劉衛(wèi)震，王冠華，袁延佩，伍昌軍，賈永秀，隋文杰,*

（1.天津科技大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.天津科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；3.內(nèi)蒙古蒙特威生物科技有限公司，內(nèi)蒙古包頭 014000）

作為人體必需礦物質(zhì)成分之一，鈣參與到人體代謝、骨骼生長(zhǎng)和酶調(diào)節(jié)等多種生理過程[1-2]。通過飲食攝入是增加身體中鈣儲(chǔ)存最有效的方法[3-5]。然而，傳統(tǒng)鈣制劑容易在小腸中形成不溶性沉淀物，從而減少人體對(duì)鈣離子的吸收效果[6-7]。酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphopeptides，CPPs）是以牛乳酪蛋白為原料，經(jīng)酶水解、分離、純化而制得的含有磷酸絲氨?；奶烊换钚噪?。其在pH 呈中性到弱堿性的動(dòng)物腸道內(nèi)，能阻止磷酸鈣沉淀的產(chǎn)生，從而促進(jìn)鈣的吸收[8-11]。

鈣-乙醇沉淀法是目前分離酪蛋白磷酸肽最普遍的方法之一[12-15]，即向酪蛋白水解液中加入一定濃度的Ca2+，使CPPs 分子之間形成鈣橋，再向溶液中加入一定量的乙醇，改變?nèi)芤旱慕殡姵?shù)，使CPPs 沉淀下來。但是，由于傳統(tǒng)鈣乙醇沉淀法加入的Ca2+相對(duì)于酶解液中CPPs 來說是過量的，導(dǎo)致溶液中與其螯合的CPPs 達(dá)到飽和，進(jìn)而全部沉淀下來，所以獲得的產(chǎn)品在鈣螯合能力和純度等方面有限，降低了產(chǎn)品的應(yīng)用價(jià)值。

本研究利用酪蛋白磷酸肽螯合鈣離子的特性，以鈣離子濃度為尺度，分級(jí)制取不同鈣螯合能力的CPPs，同時(shí)提高其純度。通過改變鈣離子濃度，連續(xù)沉淀出不同鈣螯合活性的酪蛋白磷酸肽，以鈣螯合量為指標(biāo)對(duì)CPPs 進(jìn)行分級(jí)。測(cè)定不同級(jí)分的氨基酸組成、N/P 摩爾比對(duì)其進(jìn)行分析。并通過紫外吸收光譜、FT-IR 紅外吸收光譜及Zeta 電位對(duì)鈣螯合量最高的酪蛋白磷酸肽和肽鈣螯合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。最后，進(jìn)行了分級(jí)酪蛋白磷酸肽的體外持鈣能力測(cè)定和酪蛋白磷酸肽鈣螯合物的體外消化模擬實(shí)驗(yàn)，并分析了酪蛋白磷酸肽鈣螯合物在模擬胃腸消化中的生物利用度，特別是在腸道pH 環(huán)境下的鈣保持能力，旨在為提高酪蛋白磷酸肽及鈣螯合物的生物利用度提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪素 蛋白含量90%，湖北百特威生物科技有限公司；酪蛋白磷酸肽 純度80%，阿拉丁試劑股份有限公司；胰蛋白酶（25000 U/g）、胃蛋白酶（15000 U/g）上海源葉生物科技有限公司；EDTA、碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸 均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇 津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠。

H1850 型高速離心機(jī) 湖南湘儀有限公司；Scientz-10N/A 型冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Kjeltec 8400 型凱氏定氮儀 福特（中國）有限公司；IS50 型傅里葉紅外光譜儀 美國尼高利儀器公司；BeNano 90 Zeta 型Zeta 電位儀 英國馬爾文帕納科公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酪蛋白酶解液的制備 稱取適量酪蛋白酸鈉溶于去離子水（50 mg/mL）中，利用1 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH8。加入胰蛋白酶（酶與底物質(zhì)量比1:50，w/w），于45 °C 水浴鍋中酶解4 h，酶解結(jié)束后置于90 °C 水浴鍋中滅酶10 min，冷卻至室溫。將酶解液用1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 至4.6，靜置，10000 r/min 離心 10 min，取上清液備用。此制備條件下酪蛋白酸鈉酶解較充分，水解度為19.22%±0.68%。

1.2.2 鈣-乙醇分級(jí)酪蛋白磷酸肽 將酪蛋白酶解液用1 mol/L HCl 溶液調(diào)至pH 為5.5，加入CaCl2，使CaCl2濃度為0.24%。將CaCl2總量分為三個(gè)等級(jí)（終濃度分別為0.05%、0.08%、0.11%），加入無水乙醇，使其終濃度達(dá)到55%（v/v），對(duì)酶解液進(jìn)行鈣-乙醇分級(jí)。靜置6 h，10000 r/min 離心 10 min，取沉淀進(jìn)行冷凍干燥。收集不同組分，分別命名為CPP1-Ca、CPP2-Ca、CPP3-Ca。將直接加入CaCl2濃度為0.24%的酶解液進(jìn)行鈣乙醇沉淀，得到的組分被命名為CPP-Ca。

1.2.3 PBS 脫鈣 取1 g 不同級(jí)分肽鈣螯合物，加入200 mL 0.2 mol/L 的pH 為8 的PBS 緩沖液，攪拌4 h 后離心10 min[16]。取上清液進(jìn)行透析，去除磷酸根，然后將不同級(jí)分進(jìn)行冷干，得到脫鈣后的各級(jí)分，分別命名為CPP，CPP1，CPP2，CPP3。該方法可脫除酪蛋白磷酸肽鈣螯合物中99%以上的鈣，且酪蛋白磷酸肽無損失。

1.2.4 分級(jí)酪蛋白磷酸肽鈣螯合物純度和得率測(cè)定參考國標(biāo)鋇乙醇法GB 31617-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑酪蛋白磷酸肽》測(cè)定不同級(jí)分酪蛋白磷酸肽的純度。不同級(jí)分酪蛋白磷酸肽鈣螯合物得率計(jì)算公式如下：

式中：W1表示酪蛋白磷酸肽鈣螯合物絕對(duì)得率，%；A1為不同級(jí)分酪蛋白磷酸肽質(zhì)量，g；A2為酪蛋白質(zhì)量，g；W2表示酪蛋白磷酸肽鈣螯合物相對(duì)得率，%；B1為不同級(jí)分肽鈣螯合物質(zhì)量，g；B2為總肽鈣螯合物質(zhì)量，g。

1.2.5 分級(jí)酪蛋白磷酸肽鈣螯合物理化性質(zhì)測(cè)定鈣螯合量測(cè)定參照GB 5009.92-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鈣的測(cè)定》中火焰原子吸收光譜法；氨基酸組成的測(cè)定參照GB 5009.124-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》；氮含量測(cè)定參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法；磷含量測(cè)定采用半微量定磷法[17-18]，根據(jù)下式計(jì)算得出N/P（摩爾比）。

式中：W1為氮的質(zhì)量百分含量；W2為磷的質(zhì)量百分含量。

1.2.6 分級(jí)酪蛋白磷酸肽及肽鈣螯合物結(jié)構(gòu)表征Zeta 電位采用電位分析儀進(jìn)行測(cè)定[19]：樣品溶于去離子水中，充分混勻后使其濃度為1 mg/mL。隨后利用納米粒度電位儀對(duì)不同級(jí)分樣品的ξ電勢(shì)進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定紫外吸收光譜[19-22]：將CPP3-Ca 和CPP3 樣品分散在濃度為1 mg/mL 的蒸餾水中，濾膜（0.22 μm）過濾后用紫外吸收分光光度計(jì)在190～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，記錄樣品的紫外可見光譜。參考齊立偉等[21]的方法測(cè)定傅里葉紅外光譜：少量樣品（CPP3 和CPP3-Ca）與溴化鉀混合，擠壓成透明片，裝入FT-IR 樣品板。每個(gè)樣本在4000～400 cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

高文軍[4]等認(rèn)為超聲引導(dǎo)下穿刺活檢方便、簡(jiǎn)單、安全、準(zhǔn)確，在嚴(yán)格掌握適應(yīng)證的情況下，可以用于卵巢癌的診斷及鑒別診斷。本研究在超聲引導(dǎo)下穿刺活檢中有6例穿刺病例病理提示：無法診斷（組織量少或壞死物），并將這6例歸為陰性。其中有2例術(shù)后證實(shí)為畸胎瘤，4例術(shù)后證實(shí)為惡性卵巢腫瘤?；貧w分析：這6例盆腔腫塊內(nèi)部回聲均以囊性成分為主，腫塊較大，穿刺物為：壞死物或纖維組織，存在假陰性。

1.2.7 分級(jí)酪蛋白磷酸肽持鈣能力測(cè)定和體外生物利用度 酪蛋白磷酸肽持鈣能力測(cè)定：采用pH-stat法測(cè)定不同級(jí)分酪蛋白磷酸肽的持鈣能力[23-24]。反應(yīng)條件為37 °C，pH 為8.0，與人體小腸末端環(huán)境一致。加入不同級(jí)分CPP 的終濃度為0.1 g/L，以不加CPP 樣品的為空白對(duì)照。體外消化模擬[25-27]：將不同級(jí)分肽鈣螯合物、氯化鈣分別溶解于去離子水（1 mg/mL）中，調(diào)節(jié)pH 至2.0，37 °C 孵育5 min 后，按1:35（w/w）的酶底物比加入胃蛋白酶消化2 h。胃消化完成后，用飽和NaHCO3調(diào)pH 至6.8 后，按照1:25（w/w）的酶底物比加入胰蛋白酶，繼續(xù)用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)至pH7.5 后消化2 h。分別在體外消化0、30、60、90 和120 min 時(shí)取一定量樣品，沸水浴滅酶 10 min 后進(jìn)行樣品可溶性鈣含量測(cè)定。用EDTA 滴定法[27-28]測(cè)定消化過程中樣品可溶性鈣含量的變化，以不同時(shí)間間隔計(jì)算樣品的鈣含量。鈣的溶解度計(jì)算公式如下：

式中：M1為溶解鈣含量，mg/L；M0為總鈣含量，mg/L。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 22.0軟件的 ANOVA（變異系數(shù)分析）進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05），利用Origin Pro 9.0 進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪蛋白磷酸肽及肽鈣螯合物的制備

圖1 為鈣乙醇分級(jí)酪蛋白磷酸肽的制備工藝流程。酪蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解后，利用鈣乙醇沉淀酶解液中酪蛋白磷酸肽的原理，改變鈣離子濃度，連續(xù)沉淀出不同鈣螯合量的酪蛋白磷酸肽鈣螯合物（CPP1-Ca、CPP2-Ca 和CPP3-Ca），并且以傳統(tǒng)鈣乙醇沉淀的方法得到的酪蛋白磷酸肽鈣螯合物（CPP-Ca）作對(duì)照。另外，相對(duì)應(yīng)的酪蛋白磷酸肽（CPP1、CPP2 和CPP3）可以通過以磷酸肽鈣螯合物為原料，經(jīng)PBS脫鈣法得到[16]。

圖1 分級(jí)酪蛋白磷酸肽制備流程圖Fig.1 Flow chart of the preparation of different grades of casein phosphopeptides

得率和純度是評(píng)價(jià)分離酪蛋白磷酸肽的重要指標(biāo)。由圖2 可知，未分級(jí)得到的酪蛋白磷酸肽鈣螯合物得率為22.16%。鈣乙醇分級(jí)得到的CPP1-Ca、CPP2-Ca、CPP3-Ca 得率分別為10.36%、8.02%和4.31%，相較于未分級(jí)的酪蛋白磷酸肽鈣螯合物得率較低。其中，三種不同級(jí)分的酪蛋白磷酸肽鈣螯合物中CPP1-Ca 的相對(duì)得率最高，為46.18%，CPP3-Ca的相對(duì)得率最低，僅有18.15%。郭長(zhǎng)慧等[29]在酪蛋白磷酸肽制備工藝參數(shù)的優(yōu)化研究中得到最優(yōu)條件下CPPs 的得率最大為16.11%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。由圖3可知，實(shí)驗(yàn)所制備的CPP1-Ca、CPP2-Ca、CPP3-Ca和CPP-Ca 純度均在70%以上。利用鈣乙醇分級(jí)得到的不同級(jí)分酪蛋白磷酸肽鈣螯合物中，CPP3-Ca 的純度最高，為89.42%，相較于未分級(jí)的酪蛋白磷酸肽鈣螯合物（CPP-Ca）的83.77%的純度提高了6.74%。陳雪香等[13]的研究中用乙醇-鋇法測(cè)定8 種商品CPPs 的純度，其中樣品CPP 純度最大的為38.01%，最小的為19.43%。CPP1-Ca 到CPP3-Ca的鈣螯合量逐漸增高，其中CPP3-Ca 的鈣螯合量最高，為69.59 mg/g，均顯著（P＜0.05）高于CPP1-Ca 和CPP2-Ca 兩個(gè)級(jí)分的42.53 和58.54 mg/g 以及未分級(jí)的CPP-Ca（55.05 mg/g）。

圖2 分級(jí)酪蛋白磷酸肽鈣螯合物得率Fig.2 Yield of calcium chelates of casein phosphopeptide of different grades

圖3 分級(jí)酪蛋白磷酸肽鈣螯合物純度和鈣螯合量Fig.3 Purity and calcium chelation of graded casein phosphopeptide

2.2 分級(jí)酪蛋白磷酸肽鈣螯合物的理化性質(zhì)分析

2.2.1 氨基酸組成分析 有研究表明，肽結(jié)合金屬離子的能力主要取決于其氨基酸組成，其中，酪蛋白磷酸肽的鈣結(jié)合量與其中的磷酸絲氨酸基團(tuán)含量呈正相關(guān)[30]。為了研究不同級(jí)分酪蛋白磷酸肽中氨基酸組成對(duì)酪蛋白磷酸肽與鈣離子反應(yīng)的影響，測(cè)定了酪蛋白磷酸肽鈣螯合物的氨基酸組成。從總氨基酸含量結(jié)果（表1）來看，各級(jí)分酪蛋白磷酸肽鈣螯合物中谷氨酸含量較高，其次還含有亮氨酸和異亮氨酸，這與文獻(xiàn)[31-32]所報(bào)道的結(jié)果相似。由表2 可知，四種酪蛋白磷酸肽鈣螯合物的氨基酸組成中，絲氨酸（Ser）和谷氨酸（Glu）含量最高，可見四種酪蛋白磷酸肽鈣螯合物的核心結(jié)構(gòu)-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-占整個(gè)肽鏈的比例較大，酪蛋白磷酸肽的純度較高，這一結(jié)果與前文酪蛋白磷酸肽純度的測(cè)定結(jié)果一致（圖3）。磷酸化殘基在礦物結(jié)合中起重要作用，研究表明去磷酸化的肽并沒有顯示與任何礦物結(jié)合的活性[33]。由表2 可知，CPP1-Ca、CPP2-Ca、CPP3-Ca、CPP-Ca 分別具有較高含量的磷酸絲氨酰殘基，其中CPP-Ca 的絲氨酸（Ser）和谷氨酸（Glu）含量最低，僅占29.87%，而 CPP3-Ca 的絲氨酸（Ser）和谷氨酸（Glu）含量最高，占33.25%。該結(jié)果與馮穎杰等[33]利用米曲霉蛋白酶制備CPP 的氨基酸組成分析中結(jié)果一致。所以由此可證明CPP3-Ca 具有更高的鈣螯合能力。這也進(jìn)一步表明磷酸化的殘基在礦物結(jié)合和運(yùn)輸中起重要作用。

表1 不同酪蛋白磷酸肽鈣螯合物中氨基酸組成及含量Table 1 Amino acid compositions and contents in different calcium casein phosphopeptide chelates

表2 不同酪蛋白磷酸肽鈣螯合物中Ser 和Glu 含量Table 2 Ser and Glu contents in different casein phosphopeptide calcium chelates

2.2.2 N/P（摩爾比）分析 N/P（摩爾比）是評(píng)價(jià)CPP 質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，本研究規(guī)定N/P 在24 以上 的CPP 為 高N/P 的CPP，N/P 在15～24 的CPP為中N/P 的CPP，摩爾比在15 以下的CPP 為低N/P的CPP[17,34]。N/P 反映了產(chǎn)品中磷酸絲氨酸殘基的密度，N/P 越低，磷酸絲氨酸殘基密度越高。由圖4可以看出，四種酪蛋白磷酸肽高螯合物的N/P 均在15 以下，屬低N/P 的CPP，而市售CPPs 的N/P 為15.55，屬于中N/P 的CPP。其中CPP3 的N/P 最低，達(dá)到8.27。在Alcalase 水解酪蛋白制備磷酸肽和非磷肽的研究中，趙一明[35]發(fā)現(xiàn)酪蛋白水解液經(jīng)選擇沉淀法得到的酪蛋白磷酸肽N/P（摩爾比）是9.61。由此可以說明CPP3 含有較高密度的磷酸絲氨酸殘基，這一結(jié)果與前文中氨基酸組成的測(cè)定結(jié)果一致（表2）。

圖4 分級(jí)酪蛋白磷酸肽鈣螯合物N/P 摩爾比Fig.4 Graded casein phosphopeptide calcium chelates N/P molar ratio

2.3 分級(jí)酪蛋白磷酸肽及肽鈣螯合物結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 紫外吸收光譜分析 從紫外線吸收光譜的強(qiáng)度和位移的變化中可以推導(dǎo)出酪蛋白磷酸肽和鈣之間可能的相互作用機(jī)制。CPP 和CPP-Ca 的UV 光譜顯示在圖5 中。CPP3 在200 nm 附近顯示出高強(qiáng)度的吸收峰，這是對(duì)應(yīng)肽鏈中酰胺鍵C=O 的n→π*躍遷產(chǎn)生的特征峰，與鈣離子螯合后，CPP3-Ca 可以觀察到吸收峰強(qiáng)度明顯增加，這可能是由于酪蛋白磷酸肽螯合鈣后，導(dǎo)致酰胺鍵的電子云和配體的吸收特性發(fā)生變化而引起的[36]。在275 nm 處觀察到CPP 有較弱的吸收峰。這是由于多肽中芳香族氨基酸的構(gòu)象變化造成的[27]。鈣螯合后，吸收峰強(qiáng)度明顯降低，這表明在反應(yīng)過程中存在分子或原子相互作用，并發(fā)生了電子躍遷[36-37]。該結(jié)果與宋麗等[37]的研究卵黃高磷蛋白肽-鈣螯合物的紫外吸收光譜結(jié)果趨于一致。上述結(jié)果表明，CPP3 與Ca2+相互作用形成了不同于CPP3 的肽鈣螯合物。

圖5 CPP3 及CPP3-Ca 紫外吸收光譜圖Fig.5 UV absorption spectra of CPP3 and CPP3-Ca

2.3.2 FT-IR 紅外吸收光譜分析 FT-IR 是探究肽結(jié)構(gòu)和肽鈣反應(yīng)機(jī)制的方法之一[37]。吸收峰的變化可以反映金屬離子和有機(jī)基團(tuán)之間的協(xié)調(diào)反應(yīng)。與CPP3 的紅外光譜相比，CPP3-Ca 螯合物的紅外光譜具有明顯的不同，這可能是鈣離子在與酪蛋白磷酸肽進(jìn)行螯合時(shí)，使肽的某些官能團(tuán)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起吸收峰發(fā)生變化[38-39]。從圖6 可以看出，CPP3 經(jīng)過鈣螯合反應(yīng)后，在某些波數(shù)上的紅外吸收量上有所變化。CPP 的光譜中位于3444 cm-1的特征吸收帶對(duì)應(yīng)于-NH 的拉伸振動(dòng)。當(dāng)與鈣螯合時(shí)，該帶移到較低的波數(shù)3395 cm-1，表明酰胺中-NH 可能與鈣離子發(fā)生反應(yīng)，N-Ca 鍵取代氫鍵導(dǎo)致N-H 鍵延伸。代表-COOH 彎曲振動(dòng)的1378 cm-1的波段，隨著強(qiáng)度的減弱而轉(zhuǎn)移到1386 cm-1，這表明羧基氧的非鍵合自由電子轉(zhuǎn)移到鈣離子上，羧基氧參與了鈣結(jié)合反應(yīng)。該結(jié)果與劉玉玉等[40]利用FT-IR 研究白鰱魚皮膠原蛋白肽的羧基和氨基與鈣離子螯合后生成肽-鈣螯合物結(jié)果趨于一致。此外，與CPP3 相比，CPP3-Ca 在1120 cm-1處的吸收峰幾乎消失，PO43-上的吸收峰幾乎消失，PO43-上的P-O 伸縮振動(dòng)的紅外特征吸收峰在1150～1060 cm-1范圍內(nèi)[38]，1120cm-1正好在其吸收特征峰內(nèi)，所以可推測(cè)CPP3 的磷酸基團(tuán)參與到與金屬離子鈣的螯合?；谝陨辖Y(jié)果分析，CPP3 與Ca2+結(jié)合位點(diǎn)主要是氨基氮原子、羧基氧原子和磷酸基團(tuán)。

圖6 CPP3 及CPP3-Ca FT-IR 紅外光譜圖Fig.6 FT-IR spectra of CPP3 and CPP3-Ca

2.3.3 Zeta 電位分析 Zeta 電位值可表征多肽溶液的穩(wěn)定性。不同級(jí)分酪蛋白磷酸肽的表面電荷性質(zhì)通過ξ電勢(shì)進(jìn)行確定[19]。如圖7 所示，酪蛋白磷酸肽與鈣離子結(jié)合后，電位絕對(duì)值有顯著下降，其中，CPP3 的電位變化最大。這是可能是由于CPP 與鈣離子相互作用，多肽中帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)和羧基基團(tuán)與帶正電荷的鈣離子相結(jié)合，導(dǎo)致多肽表面所帶負(fù)電荷被中和，整體電位發(fā)生明顯變化。這與宋麗等[37]探究卵黃高磷蛋白肽與鈣離子結(jié)合機(jī)制中Zeta 電位分析結(jié)果一致。在鈣乙醇分級(jí)得到的三個(gè)級(jí)分中，CPP3 的電勢(shì)最低，為-36.3 mV，CPP1 的電勢(shì)最高，為-24.27 mV。這可能是因?yàn)镃PP3 帶有更多的磷酸絲氨酸殘基，本身帶有負(fù)電荷。且在N/P 摩爾比和氨基酸組成分析中可以得出，CPP3 的磷酸絲氨酸殘基的密度最大。由此也可以證明鈣乙醇分級(jí)能富集含更多的磷酸絲氨酸殘基的酪蛋白磷酸肽。

圖7 分級(jí)酪蛋白磷酸肽及肽鈣螯合物Zeta 電位Fig.7 Zeta potentials of casein phosphopeptides and peptide calcium chelates of different grades

2.4 分級(jí)酪蛋白磷酸肽持鈣能力和體外生物利用度

2.4.1 分級(jí)酪蛋白磷酸肽持鈣能力 由圖8 可以看出，未添加CPP 時(shí)，在5 min 內(nèi)迅速形成磷酸鈣沉淀。而添加CPP 后，磷酸鈣沉淀形成速度明顯減慢。這在一定程度上說明了CPP 的確能夠延遲和阻止磷酸鈣沉淀的形成，具有較好的持鈣能力。其中，CPP1、CPP2 分別在第30、35 min 時(shí)出現(xiàn)沉淀，可使磷酸鈣沉淀的形成推遲10～15 min。CPP 樣品在40 min 時(shí)出現(xiàn)沉淀，使磷酸鈣沉淀的形成推遲20～25 min。而CPP3 樣品在第50 min 時(shí)出現(xiàn)磷酸鈣沉淀，可使沉淀的形成時(shí)間推遲40 min 以上，持鈣能力明顯優(yōu)于其他級(jí)分。結(jié)合之前對(duì)不同級(jí)分酪蛋白磷酸肽的幾項(xiàng)指標(biāo)測(cè)試結(jié)果來看，與其他級(jí)分相比較，CPP3 磷酸絲氨酸殘基的密度最大，同時(shí)N/P摩爾比最低，與鈣離子結(jié)合機(jī)會(huì)增加，從而可有效阻止磷酸鈣的形成。

圖8 不同等級(jí)CPP 的持鈣能力比較Fig.8 Comparison of calcium holding capacity of different grades of CPP

2.4.2 分級(jí)酪蛋白磷酸肽-鈣螯合物體外生物利用度 鈣被吸收的一個(gè)先決條件是它在腸道中的溶解度（即生物利用度）。在胃液消化過程中鈣離子的溶解度變化趨勢(shì)如圖9，當(dāng)各級(jí)分酪蛋白磷酸肽鈣螯合物剛進(jìn)入模擬胃液進(jìn)行消化時(shí)，五種鈣源的溶解度均能達(dá)到80%以上，這是由于各樣品的初始pH 為2，酸性條件下，樣品的鈣離子被釋放出來呈游離狀態(tài)。各級(jí)分酪蛋白磷酸肽鈣螯合物釋放率相較于CaCl2來說變化較慢，說明酪蛋白磷酸肽鈣螯合物具有一定的抗消化性，能降低對(duì)胃部的刺激。

圖9 分級(jí)酪蛋白磷酸肽鈣螯合物在胃中的鈣溶解度Fig.9 Calcium solubility of graded casein phosphopeptide calcium chelate in the stomach

如圖10 所示，在腸液消化過程中，由于腸道環(huán)境呈弱堿性，鈣離子易形成氫氧化鈣沉淀，使鈣的生物利用度降低。經(jīng)體外模擬胃腸道消化后，五種鈣源的鈣溶解率均逐漸降低。在消化結(jié)束時(shí)，CPP3-Ca的鈣溶解度最高，達(dá)到62.82%，CaCl2的溶解度最低，僅有21.05%。這說明CPP3-Ca 能使更多的Ca2+在弱堿性環(huán)境的腸道中溶解，被人體消化吸收。因此，鈣乙醇分級(jí)得到的CPP3-Ca 能有效提高鈣的生物利用度。

圖10 分級(jí)酪蛋白磷酸肽鈣螯合物在腸消化中的鈣溶解度Fig.10 Calcium solubility of graded casein phosphopeptide calcium chelate in intestinal digestion

3 結(jié)論

以傳統(tǒng)的鈣乙醇沉淀法分離酪蛋白磷酸肽為基礎(chǔ)，通過逐級(jí)增加酶解液中鈣離子濃度，再用終濃度為55%（v/v）的乙醇沉淀出不同鈣鰲合量的酪蛋白磷酸肽鈣鰲合物。第三級(jí)分（CPP3-Ca）的鈣鰲合量最高，達(dá)到69.59 mg/g，其純度和體外持鈣能力均比未分級(jí)的高?；诎被峤M成和N/P 摩爾比測(cè)定分析，證明了CPP3-Ca 有更高密度的磷酸基團(tuán)。通過紫外吸收光譜、紅外吸收光譜以及Zeta 電位可以證明酪蛋白磷酸肽中參與鈣鰲合的主要是羧基、氨基和磷酸基團(tuán)，從而證明了CPP3 具有更高的鈣鰲合能力以及酪蛋白磷酸肽鈣鰲合物的形成。研究不同級(jí)分酪蛋白磷酸肽阻止磷酸鈣沉淀形成的能力，分析結(jié)果顯示CPP 能夠延遲和阻止磷酸鈣沉淀的形成，具有較好的持鈣能力，其中，CPP3 具有更高的持鈣能力。在模擬胃消化過程中，不同級(jí)分酪蛋白磷酸肽鈣螯合物的釋放率相對(duì)較慢，說明酪蛋白磷酸肽鈣螯合物具有一定的抗消化性，能降低對(duì)胃部的刺激。在模擬腸道消化過程中，分級(jí)出的CPP3-Ca 有更高的鈣溶解度，表明分級(jí)出的酪蛋白磷酸肽鈣鰲合物的體外生物利用度更高。

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