張 濤，馬 杰，年國芳，周芷夷，張 婷，周建中

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830000）

在20 世紀(jì)初，第一種合成抗菌劑砷凡納明問世[1]。隨著抗菌藥物的深入開發(fā)和廣泛使用，這些藥物的局限性也逐漸顯露出來。其中最主要的是抗生素的生物利用率低，部分抗生素具有毒性以及過度依賴抗生素藥物帶來的抗微生物耐藥性（Antimicrobial resistance，AMR）危機(jī)[2]。除了傳統(tǒng)的小分子藥物外，世衛(wèi)組織還建議研究非傳統(tǒng)和替代療法，重點(diǎn)關(guān)注不同的細(xì)菌靶標(biāo)的抗菌肽和噬菌體療法[3]。

抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）又稱宿主防御肽，是生物機(jī)體用來抵抗入侵病原體的天然免疫屏障[4]。它們廣泛存在于動(dòng)物的免疫細(xì)胞中，如吞噬細(xì)胞、各種臟器的粘膜、皮膚以及植物的花、果、葉，甚至存在于微生物自身體系中[5-7]。與傳統(tǒng)的抗生素不同，除了不易產(chǎn)生耐藥性和交叉抗性外[4]，還具有對(duì)環(huán)境友好，對(duì)人類和動(dòng)物無害的特點(diǎn)，對(duì)細(xì)菌、病毒、真菌以及原生動(dòng)物等都表現(xiàn)出廣泛的抑制作用[8-9]。不同抗菌肽在與細(xì)胞作用時(shí)表現(xiàn)的作用方式和作用機(jī)制也各不相同。帶正電荷的抗菌肽結(jié)合細(xì)胞膜中帶負(fù)電荷的磷脂是一種殺菌機(jī)制；抗菌肽結(jié)合細(xì)胞壁或胞內(nèi)組分的非膜靶點(diǎn)也可殺死病原體[10]。關(guān)于抗菌肽的作用機(jī)理有兩種觀點(diǎn)：膜靶向機(jī)制和非膜靶向機(jī)制。研究人員采用了聚集體模型、環(huán)狀孔模型、桶板模型和毯式模型等不同作用模型對(duì)兩種作用機(jī)制作進(jìn)一步闡述[4]。

我國杏資源非常豐富，主要分布在東北、華北、西北地區(qū)，是“三北”生態(tài)脆弱區(qū)發(fā)展經(jīng)濟(jì)林產(chǎn)業(yè)的適生樹種[11]，其中新疆杏栽培歷史悠久，培植了諸多優(yōu)質(zhì)的品種[12]。作為傳統(tǒng)的中藥原料，苦杏仁能夠顯著降低血清中膽固醇、動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)[13]，且杏仁油具有提高免疫力、預(yù)防心血管疾病等多種生理功能?？嘈尤适袌?chǎng)需求呈不斷上升趨勢(shì)，尤其是在食品[14]、醫(yī)藥[15]、化工[16]等領(lǐng)域。杏仁皮多酚類化合物具有抗菌抗病毒活性[17]，崔海燕等[18]對(duì)其主要活性成分進(jìn)行了研究。Salih 等[19]從杏仁中提取苦杏仁苷并研究其對(duì)綠膿桿菌、沙雷氏菌等病原菌的抑制作用。王麗芳等[20]提取龍井茶葉粗提物，研究茶葉抗菌肽對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制，劉東偉等[21]將壓榨提油后的核桃粕酶解制備核桃粕蛋白，發(fā)現(xiàn)核桃粕蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有抑制效果，對(duì)于杏仁蛋白的抗菌效果目前暫無研究。前期研究發(fā)現(xiàn)苦杏仁蛋白具有抗菌性，本實(shí)驗(yàn)以榨油后的杏仁粕為研究對(duì)象并探究其蛋白的抑菌特性，優(yōu)化水解及純化條件，富集其中的抗菌肽組分并解析其結(jié)構(gòu)，以期為苦杏仁活性肽的開發(fā)和杏仁副產(chǎn)品的再利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦杏仁 新疆烏魯木齊市沙依巴克區(qū)北園春市場(chǎng)采購；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌 北京永澤浩嘉生物技術(shù)發(fā)展中心購入；堿性蛋白酶（酶活：200 U/mg）、酸性蛋白酶（酶活：50 U/mg）、中性蛋白酶（酶活：100 U/mg）、復(fù)合蛋白酶（酶活：120 U/mg）、胰蛋白酶（酶活：130 U/mg）、木瓜蛋白酶（酶活：800 U/mg）、葡聚糖凝膠G-25、考馬斯亮藍(lán)G250 上海源葉生物科技有限公司；LB 肉湯、瓊脂粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其余化學(xué)試劑均為分析純 天津鑫鉑特化工有限公司。

ZYJ-7090 單螺桿榨油機(jī) 東莞市方太電器有限公司；SF-GL-16A 高速冷凍離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司；ALpha 2-4 LSCplus 凍干機(jī) 德國Christ 公司；UV-1200 型紫外可見分光光度計(jì)上海美譜達(dá)儀器有限公司；滅菌鍋LDZF-50L-I 上海申安醫(yī)療器械廠；HD-21-1 核酸蛋白檢測(cè)儀、HL-2S 恒流泵、HD-A 電腦采集器 上海滬西分析儀器廠；Agilent Zorbax 300SB-C18美國安捷倫公司；超分辨液質(zhì)聯(lián)用儀Q Exactive HF-X 美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苦杏仁蛋白的制備 挑選顆粒飽滿的苦杏仁熱燙去皮后，在60 ℃烘干2 h 去除表面水分，使用榨油機(jī)對(duì)杏仁進(jìn)行初步脫脂，工藝設(shè)置為溫度50 ℃，榨軸轉(zhuǎn)速30 r/min。冷榨后的杏仁粕用石油醚按照1:10 的比例浸提12 h 進(jìn)行進(jìn)一步脫脂處理，重復(fù)2 次，在60 ℃條件下烘干5 h 后過60 目篩，得脫脂杏仁粉，于4 ℃保存。

采用堿溶酸沉法[22]提取脫脂苦杏仁粉中的杏仁蛋白，以1:25 比例加入蒸餾水，NaOH 調(diào)pH 至10.0，連續(xù)攪拌浸提60 min，4000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心20 min，沉淀物重復(fù)堿提1 次，合并上清液加HCl 調(diào)至pH4.4，4000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心20 min 棄去上清液，用蒸餾水洗滌沉淀3～5 次，冷凍干燥后得到苦杏仁粗蛋白。

1.2.2 蛋白酶的篩選 選擇堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶在各自最適條件下對(duì)苦杏仁蛋白進(jìn)行水解，并測(cè)試其酶解物對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌金黃色葡萄球菌及沙門氏菌的抑制效果，以水解度和抑菌圈直徑為衡量指標(biāo)，篩選出一種較優(yōu)的蛋白酶用于后續(xù)苦杏仁抑菌肽的制備。不同蛋白酶適宜酶解條件如表1所示。

表1 不同蛋白酶適宜酶解條件Table 1 Suitable enzymatic conditions for different proteases

1.2.3 水解度測(cè)定 蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[23]，水解度的測(cè)定采用甲醛滴定法[24]，按下式計(jì)算水解度DH：

式中：V1為酶解液消耗的NaOH 溶液體積（mL）；V0為蛋白溶液消耗的NaOH 溶液體積（mL）；V 為所用離子水體積（mL）；C 為滴定消耗的NaOH溶液濃度（mol/L）；M 為所加蛋白質(zhì)質(zhì)量（g）；pro 為蛋白質(zhì)濃度（%）。

1.2.4 抑菌活性的測(cè)定 采用濾紙片法測(cè)定抑菌活性[25]。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，為保持微生物活力，所有待測(cè)菌株需每2 周在瓊脂培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，并于4 ℃保存。待測(cè)菌在使用前，在37 ℃ LB 液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)18 h。吸取菌懸液在5000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心15 min，用無菌生理鹽水連續(xù)稀釋調(diào)整至105CFU/mL 菌落形成單位。

在超凈工作臺(tái)內(nèi)，吸取活化完成的試驗(yàn)菌液100 μL 均勻涂于LB 平板培養(yǎng)基上。使用打孔器制作直徑6 mm 的濾紙圓片，在苦杏仁酶解液中浸泡2 h，將浸泡過的濾紙片貼于平板培養(yǎng)基上，37 ℃條件下培養(yǎng)12 h，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。試驗(yàn)重復(fù)3 次，以水作空白對(duì)照。

1.2.5 最小抑菌濃度測(cè)定 采用二倍稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度[26]。將由酶解制備的苦杏仁抑菌肽樣品做濃度遞減稀釋，分別為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125 mg/mL，對(duì)所選指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，具體操作同1.2.4，以抑菌圈大于8 mm 為依據(jù)確定最小抑菌濃度，重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.6 單因素實(shí)驗(yàn) 以苦杏仁蛋白水解度及酶解物抑菌活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察酶解時(shí)間、pH、酶底比、酶解溫度和底物比對(duì)抑菌肽酶解及抑菌性的影響，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

酶解時(shí)間：固定酶解pH6.5，酶底比為3%，溫度為60 ℃，底物比為4%，以水解度和抑菌圈直徑的大小為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考查不同酶解時(shí)間（1、2、3、4、5 h）對(duì)杏仁蛋白酶解的影響。

酶解pH：選擇酶解時(shí)間3 h，酶底比為3%，溫度為60 ℃，底物比為4%，以水解度和抑菌圈直徑的大小為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考查不同酶解pH（4.5、5.5、6.5、7.5、8.5 h）對(duì)杏仁蛋白酶解的影響。

酶底比：設(shè)置酶解時(shí)間3 h，酶解pH6.5，溫度為60 ℃，底物比為4%，以水解度和抑菌圈直徑的大小為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考查不同酶底比（1%、2%、3%、4%、5%）對(duì)杏仁蛋白酶解的影響。

酶解溫度：選擇酶解時(shí)間3 h，酶解pH6.5，酶底比為3%，底物比為4%，以水解度和抑菌圈直徑的大小為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考查不同酶解溫度（40、50、60、70、80 h）對(duì)杏仁蛋白酶解的影響。

底物比：確定酶解時(shí)間3 h，酶解pH6.5，酶底比為3%，溫度為60 ℃，以水解度和抑菌圈直徑的大小為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考查不同底物比（2%、3%、4%、5%、6%）對(duì)杏仁蛋白酶解的影響。

1.2.7 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝 通過單因素實(shí)驗(yàn)，研究酶解時(shí)間、pH、酶底比、酶解溫度、底物比對(duì)苦杏仁蛋白水解程度以及酶解物抑菌效果的影響，采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見表2，篩選3 個(gè)影響酶解物抑菌效果的主要因素，并用響應(yīng)面法中的Box-Behnken 設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見表3，確定苦杏仁蛋白酶解制備抑菌肽的最優(yōu)工藝條件。

表2 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 2 Factors and levels of Plackett-Burman test

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 3 Factors and levels of response surface test

1.2.8 抑菌肽的超濾分離 參考徐楊林等[27]的方法。將酶解制備的苦杏仁抑菌肽與去離子水進(jìn)行1:20 溶解，在常溫條件下經(jīng)不同分子截留量的超濾膜將酶解液分離成大于30 kDa（A-Ⅰ）、30～10 kDa（A-Ⅱ）、10～3 kDa（A-Ⅲ）和小于3 kDa（A-Ⅳ）的四組不同分子量的濾液，通過二次循環(huán)收集截留液，凍干后-20 ℃保存?zhèn)溆?，并用濾紙片法測(cè)定各部分酶解物的抑菌活性，重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.9 Sephadex G-25 層析純化條件的優(yōu)化 經(jīng)超濾后得到抑菌效果較好的肽粉，用超純水溶解為不同濃度肽液準(zhǔn)備上樣。借鑒胡二坤等[28]的實(shí)驗(yàn)方法，采用280 nm 紫外檢測(cè)波長，在Sephadex G-25 柱上（1.6 cm×60 cm）層析分離，考察上樣濃度、洗脫速度、洗脫劑3 個(gè)因素對(duì)苦杏仁抑菌肽的分離效果的影響。用自動(dòng)接收器接收樣品，冷凍干燥后測(cè)量各級(jí)組分的抑菌圈直徑大小。

1.2.9.1 上樣濃度的選擇 設(shè)置洗脫速度為0.68 mL/min，以純水為洗脫液，上樣量為2 mL，探究樣品濃度為50、25、12.5、9.38、6.25 mg/mL 時(shí)的純化效果。

1.2.9.2 洗脫速度的選擇 設(shè)置樣品濃度為9.38 mg/mL，以純水為洗脫液，上樣量為2 mL，探究樣品洗脫速度在0.96、0.93、0.74、0.68、0.41 mL/min 時(shí)的純化效果。

1.2.9.3 洗脫劑的選擇 設(shè)置樣品濃度為9.38 mg/mL，洗脫速度為0.68 mL/min，上樣量為2 mL，探究樣品洗脫劑含NaCl 量為0.25、0.1、0 mol/L 時(shí)的純化效果。

1.2.10 LC-MS/MS 鑒定肽結(jié)構(gòu) 多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)通過LC-MS/MS 測(cè)定[29]，凝膠層析得到的組分脫鹽后用純水溶解，配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的溶液。

液相條件：液相色譜柱（0.15 mm×150 mm，RPC18，Column Technology Inc）；A 液為0.1%甲酸水溶液，B 液為0.1%甲酸-乙腈水溶液（乙腈為84%）。以95%的A 液進(jìn)行平衡，樣品用0.45 μm 的濾膜過濾，再經(jīng)過液相色譜柱梯度洗脫分離。

質(zhì)譜鑒定：酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，分析時(shí)長：60 min；檢測(cè)方式：正離子。按照每次全掃描后采集10 個(gè)碎片圖譜（MS2 scan）的方法采集多肽和多肽碎片的質(zhì)荷比。該質(zhì)譜圖經(jīng)軟件MaxQuant 1.5.5.1 檢索相應(yīng)的蛋白數(shù)據(jù)庫，最后得到蛋白質(zhì)鑒定及定量分析結(jié)果，使用在線軟件APD3 推斷出抗菌肽段。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)據(jù)，使用Excel 2019 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)、SPSS 26 進(jìn)行差異檢驗(yàn)及方差分析，用Origin 2021 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶種類的篩選及抑菌效果驗(yàn)證

不同蛋白酶水解苦杏仁蛋白的水解度如圖1 所示，水解初期，水解程度隨著水解時(shí)間的增長越來越高，反應(yīng)進(jìn)行一段時(shí)間后，水解程度趨于穩(wěn)定，這是由于底物以及酶切位點(diǎn)開始變少，反應(yīng)也逐漸變得平穩(wěn)。堿性蛋白酶的水解度在本實(shí)驗(yàn)的六種蛋白酶中最高，木瓜蛋白酶的水解度比堿性蛋白酶略低一些，在水解反應(yīng)4 h 之后，水解度趨于平緩，達(dá)到16.98%±0.42%。而復(fù)合蛋白酶在水解反應(yīng)3 h之后的水解度趨于平緩，最高不到15%，相當(dāng)于木瓜蛋白酶水解1 h 時(shí)的水解度；中性蛋白酶的水解度雖然與時(shí)間近似正比，但在水解反應(yīng)6 h 之后仍然未超過14%，除此之外，胰蛋白酶和酸性蛋白酶的水解能力接近，在水解反應(yīng)6 h之后，它們的水解度甚至小于10%。在本試驗(yàn)中，6 種蛋白酶水解苦杏仁蛋白的水解度排序?yàn)椋簤A性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞復(fù)合蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶＞酸性蛋白酶。不同種類的蛋白酶即使在條件類似的水解度下，苦杏仁蛋白的水解度會(huì)有差異，是因?yàn)椴煌牡鞍酌傅乃馕稽c(diǎn)不同[4]。

圖1 不同蛋白酶水解苦杏仁蛋白的水解度Fig.1 Hydrolysis degree of bitter almond protein by different proteases

不同種類的蛋白酶水解苦杏仁蛋白所得酶解物的抑菌效果如表4 所示，木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶的酶解物對(duì)2 種革蘭氏陽性菌均有抑制活性，且木瓜蛋白酶酶解物對(duì)2 種細(xì)菌抑菌圈直徑都大于8.0 mm，尤其是金黃色葡萄球菌，抑菌圈直徑接近20 mm，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果。空白對(duì)照組沒有出現(xiàn)抑菌圈，說明水對(duì)金黃色葡萄球菌的生長并未產(chǎn)生任何抑菌的作用。苦杏仁蛋白的酶解物對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用，這可能與木瓜蛋白酶具有在較短時(shí)間內(nèi)切割疏水區(qū)域氨基酸的特異性識(shí)別切割特征有關(guān)[30]。以抑菌效果為主，綜合考慮抑菌圈直徑和水解度2 個(gè)因素，本實(shí)驗(yàn)選用木瓜蛋白酶作為后續(xù)制備抑菌肽的蛋白酶，并以金黃色葡萄球菌作為指示菌，對(duì)酶解法制備苦杏仁抑菌肽的工藝進(jìn)行優(yōu)化。

表4 不同蛋白酶酶解物的抑菌活性Table 4 Antibacterial activities of different protease hydrolysates

2.2 木瓜蛋白酶酶解制備苦杏仁抑菌肽單因素實(shí)驗(yàn)

前期的實(shí)驗(yàn)中木瓜蛋白酶表現(xiàn)出最好的酶解效果和抑菌效果，為了便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展，實(shí)驗(yàn)選定時(shí)間、pH、酶底比、溫度、底物比5 個(gè)單因素，研究它們對(duì)苦杏仁蛋白水解度及酶解物抑菌活性的影響。

由圖2A 可知，隨著酶解時(shí)間的不斷增加，水解度隨著酶解時(shí)間增加整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。而酶解物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性逐漸增強(qiáng)，在3 h 處達(dá)到最大，為19.76±0.58 mm，之后抑菌圈直徑呈減小趨勢(shì)。這是由于具有抑菌活性的氨基酸序列因酶解時(shí)間的延長而不斷地暴露出來[31]。由圖2B 可知，pH能直接影響酶的活力。pH 在4.5～7.5 時(shí)，酶解物的抑菌活性變化不大，但水解度迅速增大，當(dāng)pH 進(jìn)一步增加時(shí)，水解度卻逐漸降低，而抑菌活性增強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值18.75±0.33 mm?？赡苁怯捎趐H過低、過高都能使酶蛋白變性而失活，同時(shí)pH 的改變能影響酶活性中心上必需基團(tuán)的解離程度，在合適的pH 范圍中，酶分子與底物蛋白能更容易地結(jié)合，進(jìn)而使得酶解物的抑菌活性增強(qiáng)[32]。由圖2C 可知，隨著酶添加量的增加，抑菌圈的直徑增大，當(dāng)酶底比達(dá)到2%時(shí)，抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)到18.33±0.4 mm；推測(cè)酶量的增加使水解產(chǎn)物具有抑菌活性的多肽片段增加[33]。再增加酶添加量，酶解物的抑菌活性反而略有下降，而水解程度隨著酶添加量的增加呈不斷增強(qiáng)的趨勢(shì)。可能是酶將苦杏仁蛋白水解成單個(gè)氨基酸或更小的無抑菌活性的小肽[34]。由圖2D 可知，隨著酶解溫度升高，抑菌活性和水解度都呈先增后減的趨勢(shì)，抑菌活性在溫度為70 ℃時(shí)達(dá)到最大，抑菌圈直徑為24.42±0.51 mm。這是由于溫度升高，能提高水解速度，有利于抑菌多肽的生成。當(dāng)溫度過高的時(shí)候，結(jié)構(gòu)遭到破壞的酶分子將喪失或部分喪失活性[35]。從圖2E 可以看出，底物濃度在2%～4%時(shí)，對(duì)水解程度的影響不大，在底物濃度達(dá)4%后水解度略有下降。抑菌活性隨底物濃度的增加呈先增后減趨勢(shì)，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到3%時(shí)，酶解物的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)到24.39±0.43 mm，可能是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜餄舛鹊蜁r(shí)有足夠的酶去酶解底物，隨著底物濃度的增加，沒有剩余的酶蛋白與之結(jié)合，且底物蛋白溶液黏度過高不利于底物蛋白與酶蛋白的接觸[36]。

圖2 時(shí)間、pH、酶底比、溫度和底物比對(duì)苦杏仁蛋白水解度與酶解物抑菌活性的影響Fig.2 Effects of time,pH,enzyme substrate ratio,temperature and substrate ratio on the degree of hydrolysis of bitter almond protein and the bacterial inhibitory activity of enzymatic digest

2.3 Plackett-Burrman 設(shè)計(jì)篩選主效因素

由表5 可知，方差分析模型的P值為0.0038，復(fù)決定系數(shù)R2=0.9139，校正決定系數(shù)R2Adj=0.8422，表明此回歸模型相關(guān)性好。酶底比、溫度對(duì)苦杏仁抑菌肽的制備影響極顯著（P＜0.01），pH 對(duì)苦杏仁抑菌肽的制備影響顯著（P＜0.05），而其它兩個(gè)因素則不顯著。顯著性大小依次為：酶底比＞溫度＞pH＞時(shí)間＞底物比。因此選擇具有顯著影響的3 個(gè)因素，即酶底比、溫度、pH 作為下一步響應(yīng)面模型的考察因素。

表5 Plackett-Burman 模型方差分析Table 5 Analysis of variance of Plackett-Burman model

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

對(duì)Plackett-Burrman 設(shè)計(jì)篩選出的3 個(gè)主效開展N=15 的三因素三水平的Box-Behnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表5。利用Design Expert 8.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到酶解苦杏仁蛋白的多項(xiàng)式回歸模型如下：

由表6 可知，模型F值為8.14，P值0.0163＜0.01，說明該回歸模型可靠。模型失擬項(xiàng)的P值為0.895，不顯著，校正決定系數(shù)R2Adj值為0.8211，表明某產(chǎn)量82.11%的變異分布在方程中，其相關(guān)系數(shù)R2=0.9361，表明產(chǎn)量的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度，該模型可用于預(yù)測(cè)對(duì)苦杏仁抑菌肽制備的實(shí)際情況。

表6 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 6 ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance table

在該模型中，回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)顯示，一次項(xiàng)A、B 對(duì)酶解液抑菌性的影響均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），C 達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。比較A、B、C 3 個(gè)因素的F值大小可得，各因素對(duì)苦杏仁蛋白提取率影響的大小順序?yàn)椋簆H（C）＞溫度（A）＞酶底比（B）。二次項(xiàng)（A2、C2）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響顯著（P＜0.05）；交互項(xiàng)（AB、AC、BC）對(duì)酶解物的抑菌效果影響均不顯著（P＞0.05）。根據(jù)軟件程序預(yù)測(cè)，可得苦杏仁抑菌肽最大抑菌圈直徑為17.86 mm，對(duì)應(yīng)的最佳方案為：酶解溫度為74.04 ℃，酶底比為2.65%，pH 為6.9。

2.5 最佳水解條件的確定和驗(yàn)證

鑒于實(shí)驗(yàn)的可操作性，將苦杏仁抑菌肽的制備工藝參數(shù)修正為：酶解溫度為74 ℃，酶底比為2.5%，pH 為7。在此條件下，實(shí)際測(cè)得的平均抑菌圈直徑為18.14±0.26 mm，與理論預(yù)測(cè)值相比相對(duì)誤差在1.6%左右。經(jīng)測(cè)定，此條件下酶解物中蛋白質(zhì)濃度為19.21%，水解度為26.21%，因此采用修正后的方法得到的提取參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.6 最低抑菌濃度的測(cè)定

由表7 可知，苦杏仁抑菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果活性較高，最低抑菌濃度為3.13 mg/mL，結(jié)果表示濃度較低時(shí)仍有抑菌效果，具有較高的開發(fā)價(jià)值。

表7 不同濃度的苦杏仁抑菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果Table 7 Inhibitory effects of different concentrations of bitter almond antibacterial peptide on Staphylococcus aureus

2.7 苦杏仁抑菌肽的超濾分離

將酶解制備的苦杏仁抑菌肽用截留量不同的濾膜過濾后，共得到A-Ⅰ、A-Ⅱ、A-Ⅲ和A-Ⅳ四個(gè)組分，測(cè)得各組分的抑菌活性如圖3 所示，組分A-Ⅱ的抑菌圈直徑最高達(dá)到17.34±0.38 mm，表明該組分的抑菌效果較強(qiáng)。其余3 個(gè)組分A-Ⅰ、A-Ⅲ和A-Ⅳ的抑菌圈直徑分別為12.17±0.36、9.71±0.77、8.11±0.51 mm。因此，選擇組分A-Ⅱ?qū)ζ溥M(jìn)行進(jìn)一步凝膠層析分離。

圖3 不同分子量組分的抑菌效果Fig.3 Bacterial inhibition effects of different molecular weight components

2.8 純化條件優(yōu)化

在按照1.2.9.1 條件進(jìn)行純化時(shí)，上樣濃度對(duì)純化效果的影響結(jié)果如圖4 所示。

圖4 上樣濃度對(duì)組分A-Ⅱ分離效果的影響Fig.4 Effects of upper sample concentration on the separation effects of fractions A-Ⅱ

通過圖4 可知，上樣濃度過高，不僅導(dǎo)致組分A-Ⅱ分離時(shí)間變長，還導(dǎo)致樣品擴(kuò)散，引起臨近峰重疊，分離效果不理想。上樣濃度偏低，實(shí)驗(yàn)效率低且峰形不尖銳，含量低的部分組分無法分離。過高濃度和過低濃度均只分離出3 個(gè)組分，選擇上樣濃度9.38 mg/mL 進(jìn)行層析時(shí)，分離出4 個(gè)組分，樣品得到較好的分離，且組分與組分之間較明顯。

在按照1.2.9.2 條件進(jìn)行純化時(shí)，洗脫速度對(duì)純化效果的影響結(jié)果如圖5 所示。

圖5 洗脫速度對(duì)組分A-Ⅱ分離效果的影響Fig.5 Effects of elution speed on the separation effects of A-Ⅱfraction

通過圖5 可知，洗脫速度太快，會(huì)使組分A-Ⅱ被洗脫液沖洗下來時(shí)還未分離徹底，分離出2 個(gè)峰。洗脫速度過慢，出峰慢且樣品由于長時(shí)間存留發(fā)生擴(kuò)散，會(huì)導(dǎo)致分離效果不佳和峰拖尾，也只分離出2 個(gè)峰。當(dāng)洗脫速度為0.68 mL/min 時(shí)分離出4 個(gè)組分，峰相對(duì)尖銳，且分離效果較佳。

在按照1.2.9.3 條件進(jìn)行純化時(shí)，洗脫劑對(duì)純化效果的影響結(jié)果如圖6 所示。

圖6 洗脫劑中NaCl 的濃度對(duì)組分A-Ⅱ分離效果的影響Fig.6 Effects of the concentration of NaCl in the eluent on the separation effect of A-Ⅱcomponent

由圖6 可知，洗脫劑為0.25 mol/L 或0.1 mol/L的NaCl 溶液時(shí)，分離所得的組分吸光值較高，可能是NaCl 具有防止蛋白在凝膠中吸附的作用[37]，但分離效果欠佳，前者得到3 個(gè)峰，而后者只分離出2 個(gè)單峰。而只用純水作為洗脫液時(shí)，分離效果較含NaCl 的效果明顯，但所得組分的吸光值較低，部分組分因吸附未被洗脫出來。因此，實(shí)驗(yàn)采用不含NaCl的超純水為洗脫液時(shí)，凝膠過濾色譜分離各組分的效果最佳。

2.9 純化肽的抑菌效果研究

由SephadexG-25 純化的肽對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制效果較好，尤其是金黃色葡萄球菌，分離出的4 個(gè)組分中，組分A-Ⅱ-b 的抑菌效果最強(qiáng)。綜上所述，組分A-Ⅱ-b 的抑菌活性較強(qiáng)，為了提高該組分的產(chǎn)量，確定凝膠層析的純化工藝為樣品濃度9.38 mg/mL，洗脫速度0.68 mL/min、洗脫劑為純水的條件為最佳凝膠過濾條件。使用HD-A 軟件對(duì)最佳純化條件分離的4 個(gè)目標(biāo)峰進(jìn)行分析，得出A-Ⅱ-a、A-Ⅱ-b、A-Ⅱ-c 和A-Ⅱ-d 的峰面積比分別為38.38%、13.15%、40.52%、7.96%。多次重復(fù)試驗(yàn)，收集各組分，將各組分經(jīng)真空濃縮和冷凍干燥后制成粉末，備用。

2.10 LC-MS/MS 鑒定分析

采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)抑菌效果最強(qiáng)組分A-Ⅱ-b 的肽段序列進(jìn)行鑒定分析，篩選潛在的抑菌肽段。組分A-Ⅱ-b 的總離子流圖如圖7 所示。將對(duì)重現(xiàn)性最好，相對(duì)峰面積也較高的肽段，質(zhì)譜檢測(cè)到的b，y 離子匹配圖（圖8）與數(shù)據(jù)庫（uniprottaxonomy Anabantaria 2023）進(jìn)行匹配，得到每個(gè)肽的準(zhǔn)確氨基酸序列。在抗菌肽數(shù)據(jù)庫（APD3）中進(jìn)行同源性分析并篩選出潛在的抗菌肽，結(jié)果如表8 所示。經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)7 種肽段序列與APD 數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道抑菌肽具有一定的的同源相似度。多肽序列平均為10～20 個(gè)氨基酸序列長度，分子量在1500～2500 Da 的抑菌肽段含有大量的堿性氨基酸殘基與疏水性殘基，使用在線軟件APD3 對(duì)肽段序列的電荷數(shù)和疏水率進(jìn)行計(jì)算，其凈電荷數(shù)從-1～+2，疏水率范圍從23%～50%。這與以往學(xué)者的研究結(jié)果基本一致[36]，由此，推斷出這7 種苦杏仁肽序列具有潛在的抗菌活性。具有疏水性基團(tuán)和帶正電荷是AMPs 的顯著特征。抗菌肽通常因?yàn)楦缓彼?、賴氨酸殘基而形成高度明確的陽離子結(jié)構(gòu)域[36]。疏水作用體現(xiàn)在AMPs 通過靜電吸引被微生物膜吸附后，疏水殘基開始與脂質(zhì)雙分子層的疏水段相互作用，最終導(dǎo)致微生物膜的破壞[38]。

圖7 組分A-Ⅱ-b 的總離子流圖Fig.7 Total ion flow diagram of A-II-b component

圖8 抑菌肽的質(zhì)譜圖Fig.8 Mass spectra of bacteriostatic peptides

表8 LC-MS/MS 鑒定組分A-Ⅱ-b 抑菌肽段Table 8 Antimicrobial peptides identified by LC-MS/MS from A-II-a fraction

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中以脫脂苦杏仁為原料提蛋白，使用多種酶法水解提取多肽并檢驗(yàn)其抑菌活性。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出木瓜蛋白酶水解蛋白的程度較高且酶解物的抑菌活性較強(qiáng)，尤其是對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制效果。使用金黃色葡萄球菌作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的指示菌。優(yōu)化木瓜蛋白酶酶解制備苦杏仁抑菌肽的工藝為：酶解溫度為74 ℃，酶底比為2.5%，pH 為7。在此條件下酶解3 h 得該抑菌肽的蛋白濃度為19.21%，對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為3.13 mg/mL，產(chǎn)生的抑菌圈直徑達(dá)到18.14±0.26 mm。

通過超濾分離將苦杏仁抑菌肽分出4 個(gè)組分并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行檢測(cè)，篩選出活性較好的一個(gè)組分做進(jìn)一步凝膠層析純化處理。使用SephadexG-25 進(jìn)行純化洗脫出4 個(gè)峰A-Ⅱ-a、A-Ⅱ-b、A-Ⅱ-c和A-Ⅱ-d，其中A-Ⅱ-b 對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制活性最強(qiáng)。采用LC-MS/MS 進(jìn)行分析，質(zhì)譜檢測(cè)到的b，y-離子匹配圖與蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，得到每個(gè)肽的準(zhǔn)確氨基酸序列。在抗菌肽數(shù)據(jù)庫（APD3）中進(jìn)行同源性對(duì)比分析，篩選推斷出七種潛在具有抑菌活性的杏仁活性肽，分別是ALPDEVLQNAFRIS、ESWN PRDPQFQWAGVA、VAYWSYNNGEQPLVA、FLD LSNDQNQLDQVPR、GENDNRNQIIRVR、RNLQ GENDNRNQIIRVR、RALPDEVLQNAFRIS。

抑菌活性的研究是對(duì)對(duì)苦杏仁活性肽功能特性的進(jìn)一步完善，有利于擴(kuò)大苦杏仁蛋白的應(yīng)用，對(duì)杏仁資源的深度開發(fā)也具有一定的指導(dǎo)意義。在面臨耐藥性和篩選新的抗生素較為困難的如今，杏仁抑菌肽的研究對(duì)培育新一代的抗菌藥物注入新的動(dòng)力，提供新的思路，具有較大的市場(chǎng)及應(yīng)用潛力。

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