鄭琬麒，肖雄峻，曾春莉，姚詩雨，侯長軍,*，馬 懿,*

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644005；2.四川省釀酒專用糧工程技術(shù)研究中心，四川宜賓 644005）

沃柑是一種晚熟型雜交柑橘，是蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus）植物品種，其外觀呈橙黃色，果實肉質(zhì)鮮美，是我國南方地區(qū)的特產(chǎn)，因其富含多糖、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、有機酸、酚酸、類胡蘿卜素、維生素（尤其是維生素C）、黃酮類化合物等活性物質(zhì)[1]，以及具有預(yù)防心血管疾病和癌癥、抗菌、抗炎、增強人體免疫力的作用深受消費者青睞[2]。與此同時，沃柑具有糖度高、酸度低、色澤鮮艷、多酚含量高的特點[3-4]，是果酒釀造的優(yōu)質(zhì)原料。因此，對沃柑果酒的前處理方式進行探究，不僅可以提高沃柑果酒的品質(zhì)，提升產(chǎn)品附加值，還能促進沃柑產(chǎn)業(yè)的健康良性發(fā)展。

果酒的前處理方式主要分為熱浸漬、冷浸漬以及酶處理、超聲、微波等輔助技術(shù)[5]。然而，熱浸漬、酶處理等技術(shù)，會造成果酒中花色苷等活性物質(zhì)不同程度的降解、營養(yǎng)成分不同程度的破壞，并且存在操作復(fù)雜、成本高昂等問題[6-7]。而冷浸漬技術(shù)（Cold Maceration，CM）是最近幾年研究較多的發(fā)酵前浸漬技術(shù)，該工藝技術(shù)有利于水溶性化合物在水性介質(zhì)中的選擇性擴散，在葡萄酒的生產(chǎn)中已有應(yīng)用，可增加葡萄中多糖、多酚等活性物質(zhì)的釋放和溶解[8]。Naviglio 等[9]研究了不同浸漬溫度對霞多麗葡萄的品質(zhì)影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總酚類化合物的濃度隨著低溫浸漬溫度降低而增加，其中4 ℃浸漬酒樣總酚含量高達440.4 mg/L；也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，冷浸漬時間在提高葡萄酒酚類化合物濃度的同時，也增強了抗氧化活性[10]；Alti-Palacios 等[11]發(fā)現(xiàn)冷浸漬技術(shù)顯著提高酯類、醇類化合物的濃度，對葡萄酒的芳香品質(zhì)和復(fù)雜性有積極影響；在色澤方面，李斌斌等[12]發(fā)現(xiàn)冷浸漬處理能更好地改善干紅葡萄酒的色澤，且不影響葡萄酒整體質(zhì)量。綜上所述，冷浸漬技術(shù)具有提升果酒品質(zhì)的良好潛力，但至今未應(yīng)用到沃柑果酒的開發(fā)中。

基于此，本研究通過對比未經(jīng)浸漬釀造方式與不同溫度、時間低溫浸漬技術(shù)釀造沃柑果酒后其總酚、總黃酮、DPPH 自由基清除率、色度、感官評價與香氣成分等指標(biāo)，探究低溫浸漬對沃柑果酒的品質(zhì)特性的影響，以期為冷浸漬工藝在沃柑果酒的釀造生產(chǎn)中提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沃柑 產(chǎn)自廣西武鳴，購自農(nóng)貿(mào)市場，挑選無腐爛、無損傷、成熟度一致，果徑在65～70 mm 的大小均勻的果實，糖度為15°Brix；安琪活性干酵母 湖北安琪酵母股份有限公司；果膠酶（5000 U/g）東恒華道生物科技有限公司；焦亞硫酸鉀 分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；2-辛醇 色譜純，上海麥克林生化技有限公司；蕓香葉苷、沒食子酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、福林酚、硝酸鋁、亞硝酸鈉、3,5-二硝基水楊酸 分析純，成都市科龍化工試劑廠。

WS114 手持糖度計 上海譜振生物科技有限公司；MJWJE2802D 榨汁機 美的集團股份有限公司；UV-1100 分光光度計 上海美普達儀器有限公司；7890A-5975B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 Agilent Technologies 公司；TD-4M 離心機 山東博科儀器有限公司；UitraScan VIS 臺式色差儀 HunterLab 有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沃柑果酒的釀造 選擇新鮮、成熟的沃柑，去皮、榨汁，調(diào)節(jié)果醪初始糖度為15°Brix，初始pH 為5.0，加入果膠酶100 mg/L、焦亞硫酸鉀100 mg/L[7]。試驗共分為10 組（每組3 個平行），低溫浸漬處理組于4、9、14 ℃分別放置12、24 和36 h[13]，對照組（CK 組）不進行低溫浸漬處理。浸漬結(jié)束后，酵母活化以1 g/L 干酵母計算，加10 倍量的5%的糖水，在35～40 ℃活化30 min，待低溫浸漬處理組溫度恢復(fù)室溫后，接入活化好的釀酒酵母，置于25 ℃恒溫箱，啟動酒精發(fā)酵，酒精發(fā)酵結(jié)束后過濾，加入焦亞硫酸鉀100 mg/L，于4 ℃下澄清。

1.2.2 基礎(chǔ)理化指標(biāo)的測定 總酸、酒精度的測定參照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[14]進行檢測；pH 采用pH 計測定；可溶性固形物采用手持式糖度計測定；總殘?zhí)堑臏y定參照劉俊麗等[15]的DNS 法，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.1554x-0.1716（R2=0.9991）。

1.2.3 總酚含量的測定 總酚含量的測定參照Cai等[16]Folin-Ciocalteu 比色法，吸取0.1 mL 酒樣，結(jié)果以沒食子酸計，以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=4.1714x+0.0027（R2=0.9993）。

1.2.4 黃酮含量的測定 黃酮參照李斌斌等[12]的方法測定，吸取0.1 mL 酒樣，結(jié)果以蘆丁計，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=6.0536x+0.0061（R2=0.9992）。

1.2.5 DPPH 自由基清除率測定 參考馬懿等[7]的方法，用無水乙醇配制0.2 mmol/L DPPH 溶液，將2 mL 酒樣加入到2 mL DPPH 溶液中混勻，室溫避光反應(yīng)30 min 后，在波長517 nm 處測定吸光度，記為Ai；同時以等量磷酸緩沖溶液（PBS，pH7）作空白對照試驗，記為Ac。每個樣重復(fù)測定3 次，根據(jù)下式計算清除率。

式中：Ai表示樣品加入DPPH 室溫避光反應(yīng)30 min 后在波長517 nm 處的吸光度；Ac表示加入等量磷酸緩沖溶液室溫避光反應(yīng)30 min 后在波長517 nm 處的吸光度。

1.2.6 色差的測定 色度情況參照Barros 等[17]的方法，采用色差儀對樣品進行檢測，以蒸餾水標(biāo)零后，以CK 組為標(biāo)品，分別測定每個酒樣的L*、a*、b*值，其中，dE*值根據(jù)下式進行計算。

式中：L*表示亮度；a*表示紅度值；b*表示黃度值；dE*表示總色差值。

1.2.7 感官品評 參考Hu 等[18]的方法進行感官評價（表1），感官評價小組由10 名學(xué)生（5 名女性和5 名男性，年齡20～30 歲）組成，在感官評價之前，由三名國家級品酒員對小組成員進行專業(yè)培訓(xùn)，培訓(xùn)標(biāo)準(zhǔn)參考《國標(biāo)感官分析 選拔、培訓(xùn)與管理評價員一般導(dǎo)則 第1 部分：優(yōu)選評價員》[19]。

表1 沃柑果酒感官品評評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standard for sensory evaluation of orah fruit wine

1.2.8 揮發(fā)性香氣成分的測定 香氣成分的測定參照朱艷霞等[13]頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Headspace Solid-Phase Microextraction-Gas Chromatography-Mass Spectrometry，HS-SPME-GCMS）的方法并做適當(dāng)修改。

HS-SPME：將8 mL 酒樣裝入15 mL 頂空瓶中，并加入1 g NaCl，加入內(nèi)標(biāo)2-辛醇（0.1643 μg/μL）50 μL；酒樣在45 ℃條件下預(yù)熱10 min 后，將老化后的微萃取頭插入頂空瓶中，同時推出纖維頭（距離液面1.5 cm），于頂空位置吸附35 min，吸附后，收回纖維頭并迅速送至GC 送樣口，在250 ℃熱解析3 min。

GC 條件：DB-WAX 毛線管色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；采用不分流進樣模式；程序升溫：初始溫度40 ℃，保留5 min，以2 ℃/min 升溫至60 ℃，以5 ℃/min 升溫至180 ℃，保留5 min，以10 ℃/min 升溫至230 ℃，保留10 min；載氣為高純氦氣，恒定流速1.2 mL/min。

MS 條件：電子轟擊電離源（EI），離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，采集模式為全掃描，MS 四極桿溫度150 ℃，溶劑延遲3 min。

揮發(fā)性物質(zhì)定性定量：色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜通過與NIST/Wiley Database 進行檢索比對，保留匹配度大于80%的鑒定結(jié)果。通過內(nèi)標(biāo)物（2-辛醇）的峰面積和沃柑果酒中各組分的峰面積比值，計算各個組分的質(zhì)量濃度。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)質(zhì)量濃度（μg/L）=各成分峰面積×內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度/內(nèi)標(biāo)物峰面積

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗重復(fù)操作3 次。DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)V6.55 用于數(shù)據(jù)的顯著性分析和多重比較（Duncan法），數(shù)據(jù)處理后用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示，Origin 2023 用于主成分分析（Principal Components Analysis，PCA）及圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同低溫浸漬處理對沃柑果酒基礎(chǔ)理化指標(biāo)的影響

不同低溫浸漬處理對沃柑果酒理化指標(biāo)的影響如表2 所示。低溫浸漬處理酒樣總糖含量均顯著高于CK 組酒樣總糖含量（P＜0.05），與此同時，除4 ℃浸漬12 h 處理組與CK 組的酒精度無顯著差異外，其它處理組酒精度都顯著低于CK 組（P＜0.05）?？偹崤cpH 數(shù)據(jù)表明，低溫浸漬處理組酒樣pH 在4.19～4.24 之間，總酸在10.28～11.61 g/L 之間，低溫浸漬處理組酒樣總酸含量、pH 與對照組酒樣無顯著區(qū)別（P＞0.05），低溫浸漬溫度為9 ℃的酒樣，其總酸含量隨低溫浸漬時間的延長呈增加趨勢，可能是因為浸漬時間增加導(dǎo)致沃柑內(nèi)部的成分相互發(fā)生反應(yīng)，代謝產(chǎn)物檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸和草酸等有機酸增加[20]；與此同時，不同浸漬溫度酒樣之間則無顯著的變化規(guī)律，說明低溫浸漬處理溫度對酒的酸度影響不大；此外，低溫浸漬處理各酒樣中可溶固形物含量在8.27～8.83 g/L 之間，4 ℃浸漬12 h 處理組可溶性固形物含量顯著高于其它處理組（P＜0.05），為8.83±0.17 g/L，說明該條件對可溶性固形物有積極影響。

表2 不同低溫浸漬處理對沃柑果酒基礎(chǔ)理化指標(biāo)的影響Table 2 Effects of different low temperature impregnation treatments on the basic physicochemical indexes of orah fruit wine

2.2 不同低溫浸漬處理對沃柑果酒總酚含量的影響

多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的具有多元酚結(jié)構(gòu)的植物次生代謝物，主要存在于植物的皮、根、葉、果中，有超氧化物歧化酶活性，能有效清除自由基，調(diào)節(jié)細胞氧化還原電位，幫助人體抵抗自由基的傷害，其作為果酒中最為豐富的化合物，對沃柑果酒的色澤、口感、抗氧化性等有較大影響[21]。研究發(fā)現(xiàn)不同低溫浸漬處理對沃柑果酒的多酚含量會有一定的影響，如圖1 所示。

圖1 不同低溫浸漬處理沃柑果酒的總酚含量Fig.1 Total phenol contents of orah fruit wine with different low temperature impregnation treatments

根據(jù)圖1 結(jié)果分析可知，9 ℃浸漬12 h 和14 ℃浸漬36 h 的沃柑果酒酒樣中的總酚含量與CK 組無顯著性差異（P＞0.05），其它處理組的多酚含量都顯著高于CK 組（P＜0.05），說明適當(dāng)?shù)牡蜏亟n有利于水果中多酚物質(zhì)的溶出；另一方面，低溫下多酚氧化酶的活性受到抑制，盡量多的保留了多酚物質(zhì)[17]。其中，當(dāng)浸漬溫度為4 ℃時，浸漬時間為12、24、36 h組別都顯著高于相同浸漬時間的其它組別（P＜0.05），相對于CK 組分別提高了13.64%、38.31%、13.64%，4 ℃浸漬24 h 的沃柑果酒多酚含量達到了2.13 g/L，顯著高于其它處理組（P＜0.05），該處理對于提高沃柑果酒的多酚含量有明顯的效果。

2.3 不同低溫浸漬處理對沃柑果酒黃酮含量的影響

黃酮類化合物是一種多酚類物質(zhì)，屬于生理活性物質(zhì)，具有抗自由基、抗氧化和抑菌等作用[1]，大量存在于沃柑中，主要參與形成果酒的顏色、口感、風(fēng)味等，試驗對不同低溫浸漬處理的沃柑果酒的黃酮含量進行了考察，得到了如圖2 所示的結(jié)果。

圖2 不同低溫浸漬處理沃柑果酒的黃酮含量Fig.2 Flavonoid contents of orah fruit wine with different low temperature impregnation treatments

圖2 結(jié)果表明，不同的低溫浸漬時間與溫度處理對沃柑果酒的黃酮含量有一定的積極影響，當(dāng)浸漬時間為12 h 時，4 和9 ℃浸漬處理黃酮含量無明顯提升（P＞0.05），但隨著浸漬溫度的升高，14 ℃浸漬處理組的黃酮含量有一定的升高，高于4 ℃組0.07 g/L。在浸漬溫度為9 ℃時，隨著浸漬時間的延長，黃酮含量也呈現(xiàn)遞增的趨勢，36 h 浸漬處理時最高，與12 h 相比提升了15.32%?？傮w來看，與CK（1.23 g/L）對比，4 ℃浸漬24、36 h，9 ℃浸漬36 h，14 ℃浸漬12、24、36 h 處理組的黃酮含量都得到了顯著提升（P＜0.05），其中4 ℃浸漬24 h 的沃柑果酒黃酮含量顯著高于其它處理組（P＜0.05），與CK 相比提高了0.4 g/L，原因可能是適當(dāng)?shù)牡蜏亟n處理可以破壞沃柑果肉的細胞組織，改變細胞質(zhì)膜的透性，使更多的黃酮溶出[22]。

2.4 不同低溫浸漬處理對沃柑果酒DPPH 自由基清除率的影響

沃柑果酒的抗氧化作用主要體現(xiàn)在富含多酚類物質(zhì)，這些物質(zhì)可以清除體內(nèi)自由基、螯合金屬離子、激活其它抗氧化劑、抑制細胞內(nèi)氧化酶活性[21]，從而達到了抗氧化的目的，如圖3 所示，從DPPH自由基清除率的強弱來看，CK 組清除率最低，為60.54%，而低溫浸漬處理的各酒樣清除率在68.75%～83.33%范圍內(nèi)。從不同低溫浸漬處理的沃柑果酒清除DPPH 自由基效果可看出，4 ℃浸漬24 h 的酒樣顯著高于其它酒樣（P＜0.05），DPPH 自由基清除率達到了83.33%，DPPH 自由基清除能力最強，這可能與它具有最高的多酚含量、黃酮含量有關(guān)；其次，9 ℃浸漬36 h 處理組DPPH 自由基清除能力僅次于4 ℃浸漬24 h 處理組，清除率為78.75%，顯著高于其它組別（P＜0.05），相比于CK 組，以上兩者分別提高了37.64%和30.08%?？傮w來說，低溫浸漬對DPPH 自由基清除效果較好，這與Alencar 等[10]研究結(jié)果一致。

圖3 不同低溫浸漬處理沃柑果酒的DPPH 自由基清除率Fig.3 DPPH free radical clearance rate of orah fruit wine with different low temperature impregnation treatments

2.5 不同低溫浸漬處理對沃柑果酒色澤的影響

色澤是沃柑果酒重要的感官特征之一，直接影響消費者的視覺感受，對不同低溫浸漬處理的沃柑果酒色澤指標(biāo)進行研究，得到了表3 所示的結(jié)果。

表3 不同低溫浸漬處理沃柑果酒的色澤指標(biāo)Table 3 Color indexes of orah fruit wine with different low temperature impregnation treatments

L*值反映的是沃柑果酒色澤的深淺，值越大色澤越淺，由表3 數(shù)據(jù)分析可知，L*值在4、14 ℃中會隨浸漬時間的延長呈現(xiàn)出先下降再上升的趨勢，而在溫度9 ℃下隨浸漬時間延長沃柑果酒的顏色則加深，其中4 ℃浸漬24 h 的L*值最小，14 ℃浸漬36 h的L*值最大，除14 ℃浸漬36 h 處理組外，CK 組的L*值顯著高于其它處理組（P＜0.05），說明經(jīng)低溫浸漬處理后發(fā)酵的果酒顏色更深。

a*值與酒體的紅色程度相關(guān)，沃柑果酒的a*越大，表明紅色調(diào)越強；14 ℃浸漬36 h 的酒樣a*值低于CK 酒樣中的a*值，除此之外，所有低溫浸漬處理組的a*顯著高于CK 組（P＜0.05），4 ℃浸漬24 h 的酒樣a*值最高，其次是4 ℃浸漬12 h 與36 h，與CK組相比分別增加了194.08%、134.87%、102.63%，說明低溫浸漬處理過的酒樣色調(diào)更紅，這是因為低溫浸漬使細胞壁剛性結(jié)構(gòu)喪失和增強了細胞壁的通透性，沃柑中更多的花色苷被浸提出來[23]。

沃柑果酒中的黃色調(diào)由b*表示，14 ℃浸漬36 h的b*值顯著高于其它酒樣（P＜0.05），4 和9 ℃浸漬12 h 的酒樣b*值顯著高于CK 酒樣（P＜0.05），表明在上述低溫浸漬處理條件下沃柑果酒黃色度較深，沃柑果酒的黃色度是由類黃酮等物質(zhì)產(chǎn)生的，這可能是因為適宜的低溫浸漬可以加速呈黃色調(diào)的多酚類物質(zhì)溶入果酒中；另一方面酒樣的褐變也會引起酒體顏色的變黃。研究表明，沃柑中呈黃色調(diào)的酚類物質(zhì)浸入酒體后，會與花色苷相作用形成輔色效應(yīng)，增強沃柑果酒色澤[24]，從而導(dǎo)致低溫浸漬后酒體的黃色調(diào)高于未經(jīng)浸漬的酒體。

dE*表示色差值，指與CK 的總體色澤的差距大小，值越大差距越大。9 ℃浸漬12 h 時dE*＜1，表明該處理組的酒樣與CK 組相比其色差肉眼較難以分辨；此外，沃柑果酒4 ℃浸漬24 h 后相比于對照組差距最大（P＜0.05），說明該浸漬條件對色度影響最大。已有研究表明，冷浸漬技術(shù)對色澤具有積極作用，可增加果酒的顏色強度和穩(wěn)定性，并且與多酚類化合物呈正相關(guān)[6]。

2.6 感官品評結(jié)果

本實驗組織了10 位具有一定專業(yè)技術(shù)知識、接受過專業(yè)訓(xùn)練，且身體健康、感覺器官靈敏的同學(xué)，建立的沃柑果酒感官評定小組，對果酒的各個項目（色澤、香氣、口感）進行感官評分，沃柑果酒的感官評分如表4 所示。

表4 不同低溫浸漬處理沃柑果酒的感官評分Table 4 Sensory evaluation of different low temperature impregnation treatments for orah fruit wine

通過感官品評結(jié)果（表4）可以看出，未經(jīng)浸漬工藝釀造的果酒澄清透明，但香氣不足，可能是因為多酚類物質(zhì)過多氧化，未浸提至酒樣中[22]。對比不同酒樣處理方式，低溫浸漬的酒爽口綿長，橘子味香氣怡人，而未經(jīng)浸漬工藝釀造的果酒香味不協(xié)調(diào)，缺少了酒本身的香氣與口感，得分較低，與最高得分組相差11.1 分。不同低溫浸漬處理的沃柑果酒在外觀、香氣和口感上并無明顯差異，但在口感上，4 ℃浸漬24 h的果酒醇厚綿凈、韻味悠長，總分達到了86.64 分。

2.7 不同低溫浸漬處理對沃柑果酒香氣成分的影響

根據(jù)多酚類物質(zhì)含量、感官評價和抗氧化性指標(biāo)綜合考慮，試驗選用4 ℃低溫浸漬處理的酒樣組與CK 組酒樣進行香氣成分比較。根據(jù)表5 可知，4 組樣品共檢測出22 種香氣成分，分別是醇類、酯類、酸類、酚類等，其中醇類和酯類物質(zhì)是沃柑果酒中的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，并且與黃六斌等[25]柑橘類果酒中香氣成分的含量相似。

表5 不同低溫浸漬處理沃柑果酒的香氣成分含量Table 5 Contents of aroma components in orah fruit wine with different low temperature impregnation treatments

醇類物質(zhì)是影響果酒香氣最重要的物質(zhì)之一，主要來源于酵母發(fā)酵和氨基酸轉(zhuǎn)化。CK 與3 種不同浸漬處理樣品中檢測到的醇類共6 種，其中未經(jīng)浸漬的沃柑果酒醇類物質(zhì)質(zhì)量濃度最高，總量為7700.56 μg/L，檢出4 種；4 ℃浸漬12 h 組檢出3 種，總量為2273.07 μg/L；4 ℃浸漬24 h 組檢出種類最多為6 種，總量為5970.16 μg/L，與該處理組在感官評價香氣標(biāo)準(zhǔn)中評分最高的結(jié)果相符合，說明該工藝提高了酒體香氣的復(fù)雜性；4 ℃浸漬36 h 組檢出3 種，總量為2462.51 μg/L。其中，呈玫瑰花香的苯乙醇在經(jīng)過低溫浸漬處理后得到了顯著的提高（P＜0.05），在4 ℃浸漬12 h、24 h 中分別提高了50.04%和68.50%；CK 組的2,3-丁二醇顯著低于低溫浸漬處理組（P＜0.05），4 ℃浸漬36 h 處理組顯著高于其它所有處理組（P＜0.05），與CK 組相比提升了約3 倍；此外，異戊醇與（2R,3R）-（-）-2,3-丁二醇在經(jīng)過低溫浸漬處理后含量顯著降低（P＜0.05），異戊醇在酒體中是一種苦杏仁味、油臭味，降低其含量有利于降低酒體的苦澀味。總體來說，低溫浸漬處理的酒樣酒體會更加醇厚，能使沃柑果酒表現(xiàn)出花香、果香等氣味，使得香氣復(fù)雜醇厚，可能因為浸漬溫度低時間長，沃柑中的氨基酸等物質(zhì)發(fā)生生化反應(yīng)造成的[26]。

果酒中的酯類物質(zhì)來源于漿果、脂肪酸氧化以及醇、醛和氨基酸的代謝合成[11]。4 組酒樣共檢測出11 種酯類化合物，但低溫浸漬工藝和未經(jīng)浸漬工藝釀造的沃柑果酒在種類和含量上存在較大區(qū)別，CK 組酯類物質(zhì)的種類和總量最少，共檢出6 種，總量為3168.10 μg/L；4 ℃浸漬12 h 組檢出8 種，總量為3426.55 μg/L；4℃浸漬24 h 組酯類總量最高為8687.04 μg/L，共檢出7 種；4 ℃浸漬36 h 組檢出10 種，總量為5367.86 μg/L。分析可知，在經(jīng)過低溫浸漬處理后，沃柑果酒中的十六酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、十一酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯等呈現(xiàn)花香、果香的酯類含量都得到了顯著提升（P＜0.05），其中，4 ℃浸漬36 h 組十六酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯含量提升最多，與CK 相比分別提升了2.14、0.94、1.92、0.11 倍；己二酸二（2-乙基己）酯、乙酸乙酯在4 ℃浸漬24 h 處理組中含量最高，為CK 組的4.20 和1.02 倍。

沃柑果酒中酸味主要來源于酵母利用糖類進行生化反應(yīng)的次生代謝產(chǎn)物。沃柑果酒中共檢測乙酸、癸酸、正辛酸3 種酸類香氣，CK 組與4 ℃浸漬12 h 組酸類物質(zhì)種類檢出最少，共檢出2 種，總量分別為851.38 和481.75 μg/L；4 ℃浸漬24 h 組檢出3 種，總量為681.51 μg/L；4 ℃浸漬36 h 組檢出酸類總量最高為1310.46 μg/L，共檢出3 種。分析可知，與CK 相比，4 ℃低溫浸漬36 h 增加了乙酸的含量，而4 ℃低溫浸漬12、24 h 則可以降低乙酸含量；此外，低溫浸漬處理顯著提升了正辛酸的含量，且浸漬時間越長濃度越高，說明浸漬時間對正辛酸含量影響較大。研究發(fā)現(xiàn)低濃度揮發(fā)性酸類會增加果酒香氣的復(fù)雜性，但濃度高于一定閾值后，反而會對果酒香氣產(chǎn)生負(fù)面影響[27]。因此，酸類香氣主要起輔助作用，含量不宜過多。

2.8 揮發(fā)性香氣成分主成分分析

為考察不同低溫浸漬對沃柑果酒揮發(fā)性香氣成分影響的差異性，試驗采用PCA 的方法對揮發(fā)性香氣成分進行直觀分析，PC1、PC2 的特征值及貢獻率見表6。PC1 的貢獻率為50.47%，PC2 的貢獻率為30.44%，兩者的累計貢獻率為80.91%，說明對原始數(shù)據(jù)的解釋程度效果良好，取PC1 與PC2 做主成分分析與載荷圖（圖4）。

圖4 揮發(fā)性香氣物質(zhì)主成分分析Fig.4 Principal component analysis of volatile aroma compounds

表6 PC 的特征值及貢獻率Table 6 Characteristic values and contribution rate of PC

各個指標(biāo)之間連線的距離反映了每個指標(biāo)之間的相關(guān)性，距離越短，正相關(guān)性越強。由圖4 可知，不同低溫浸漬處理組在PCA 上的位置有明顯區(qū)別，表明不同時間、溫度的低溫浸漬處理對沃柑果酒香氣有顯著影響；其中4 ℃浸漬12 h 與24 h 處理組間相關(guān)性較大，而與4 ℃浸漬36 h 和CK 組相關(guān)性較弱。對各揮發(fā)性物質(zhì)間關(guān)系進行分析可知，十六酸乙酯（B1）、癸酸乙酯（B2）、月桂酸乙酯（B3）間以及2,3-丁二醇（A2）、十一酸乙酯（B4）、亞油酸乙酯（B6）、9-十六碳烯酸乙酯（B9）、癸酸（C2）間正相關(guān)性較強，說明物質(zhì)之間聯(lián)系緊密。CK 組與異戊醇（A3）、2-甲氧基-4-（1-丙烯基）-苯酚（D1）相關(guān)性較強，4 ℃浸漬12 h 對對苯二甲酸二辛酯（B10）的積極影響較大，4 ℃浸漬24 h 處理對己二酸二（2-乙基己）酯（B5）的含量有正向的影響。總體來說，大部分的揮發(fā)性物質(zhì)主要聚集在4 ℃浸漬36 h 處理組附近，余下部分多聚集在4 ℃浸漬12 和24 h 處理組附近，與CK 組都相距較遠，說明低溫浸漬處理對揮發(fā)性物質(zhì)有積極的影響，并且4 ℃浸漬36 h 處理組對揮發(fā)性物質(zhì)正面影響最大。

3 結(jié)論

本研究探究了不同低溫浸漬時間與浸漬溫度對沃柑果酒的品質(zhì)影響，結(jié)果表明不同低溫浸漬工藝對沃柑果酒總酸含量影響較小，與未經(jīng)浸漬工藝相比，低溫浸漬酒樣殘?zhí)嵌硷@著升高，酒精度則降低；與之相反，多酚、黃酮含量升高，DPPH 自由基清除率顯著提升，色度差變大；香氣物質(zhì)分析表明，冷浸漬酒樣香氣物質(zhì)種類多，含量高，感官特性好，十六酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、十一酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯等呈花香、果香的酯類含量得到顯著提升，而異戊醇等苦味物質(zhì)含量降低（P＜0.05）。總體表明：4 ℃浸漬24 h 工藝沃柑果酒品質(zhì)最好，與未經(jīng)浸漬工藝相比，總酚、黃酮含量分別提升38.31%和24.39%，DPPH 自由基清除率為83.33%，感官評分達到86.64 分。綜上所述，低溫浸漬工藝對沃柑果酒的品質(zhì)具有提升作用，可作為沃柑果酒釀造前的預(yù)處理方法。該研究對低溫浸漬工藝未來在沃柑果酒的應(yīng)用提供了理論支撐，為提高沃柑果酒的品質(zhì)提供了新的依據(jù)。然而，低溫浸漬工藝對后續(xù)沃柑果酒發(fā)酵的影響方面還需要進一步研究。

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