張晴晴，張夢(mèng)嬌，馬翊銘，蔡學(xué)一

（1.亳州學(xué)院中藥學(xué)院，安徽亳州 236800；2.江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇無錫 214000；3.安徽雷允上藥業(yè)有限公司，安徽亳州 236800）

神經(jīng)退行性疾病，包括阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）、帕金森氏病（Parkinson′s disease，D）等，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞組織發(fā)生的非正常蛻變現(xiàn)象[1-3]。隨著社會(huì)老齡化，AD 和PD 發(fā)病率和病死率逐年上升，嚴(yán)重地影響著老年人的生活質(zhì)量，故預(yù)防和治療具有十分重要的意義[4-6]。近年來，研究報(bào)道黃酮類成分能夠保護(hù)神經(jīng)元，能夠?qū)股窠?jīng)細(xì)胞凋亡保護(hù)腦損傷，在一定程度上在退行性疾病中具有神經(jīng)保護(hù)作用[7-9]。甘草黃酮中甘草素能夠保護(hù)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞（PC12 細(xì)胞）的凋亡，具有神經(jīng)保護(hù)作用[10]。葛根素對(duì)β淀粉樣蛋白（Aβ）[11]、MPP+[12]、H2O2[13]誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞的損傷均有抗凋亡的保護(hù)作用，說明能夠緩解對(duì)PC12 細(xì)胞的損傷。同時(shí)，黃酮類物質(zhì)因具有多種促進(jìn)人類健康的生物活性、且無毒副作用，因此被認(rèn)為是功能性食品和藥品的重要原料，受到廣泛關(guān)注[14]。

薄荷（Mentha haplocalyxBriq.）是一種常用的藥食同源類植物，是唇形科植物薄荷的干燥地上部分[15]?，F(xiàn)代研究表明，薄荷具有抗病毒、抗癌、抗菌、抗氧化和抗輻射等藥理作用，另外，薄荷還可以改善新型冠狀病毒肺炎患者的癥狀[16-17]。薄荷中具有多種化學(xué)成分，起主要作用的有黃酮類、醌類、揮發(fā)油、有機(jī)酸等，其中黃酮類物質(zhì)為薄荷中重要的活性成分[18-19]。從薄荷中已分離出40 多種黃酮類化合物，例如橙皮苷、蒙花苷、蘆丁、二氫黃酮苷、香蜂草苷等[20-21]。目前，薄荷黃酮生物活性研究主要集中于抗氧化活性[16]、抗炎活性[17]、抗菌活性[18]等，而對(duì)其體外神經(jīng)保護(hù)活性的研究鮮有報(bào)道[22-23]。

薄荷黃酮類物質(zhì)常用的提取方法主要有機(jī)溶劑浸提法、超聲波提取法和超臨界CO2萃取法[24-26]，且提取溶劑（或夾帶劑）均為有機(jī)溶劑，以上方法存在溶劑易殘留、提取時(shí)間長(zhǎng)、工藝復(fù)雜、產(chǎn)率低、對(duì)環(huán)境不夠友好等問題，因此不能滿足現(xiàn)代化醫(yī)藥的生產(chǎn)需求。近年來，亞臨界水提取技術(shù)（subcritical water extraction，SWE）因綠色環(huán)保、時(shí)間短、產(chǎn)率高等優(yōu)勢(shì)成為研究的熱點(diǎn)，被廣泛用于天然產(chǎn)物活性成分的提取[27-29]。亞臨界水是指在一定壓力下，將水加熱到100～374 ℃下仍保持液態(tài)，通過控制溫度和壓力改變水的極性、黏度和表面張力，因此具有與有機(jī)溶劑類似的性質(zhì)，有利于中、弱極性物質(zhì)的提取[30-32]。Lachos-Perez 等[33]采用亞臨界水萃取法（SWE）從脫脂橙子中萃取黃烷酮，研究了通過改變介電常數(shù)來提取非極性黃酮類化合物的綠色工藝，并與三種常規(guī)提取方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，與常規(guī)提取相比，SWE 是一種高效的方法，用于回收具有高抗氧化活性的生物活性化合物。Zhang 等[34]首次采用亞臨界水作為萃取葛根異黃酮的有效溶劑。通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了4 種主要異黃酮的最佳提取工藝條件，并進(jìn)一步通過響應(yīng)面法確定了總異黃酮提取的最佳工藝條件。與常規(guī)溶劑相比，亞臨界水使用更少的溶劑并且需要更短的萃取時(shí)間。因此，SWE 因高效清潔、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于揮發(fā)油類、黃酮類等成分的提取。但有關(guān)亞臨界水萃取薄荷黃酮的研究尚未見報(bào)道。

本文采用亞臨界水提取薄荷中的黃酮類物質(zhì)，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，體外建立H2O2誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞自由基損傷模型，通過噻唑藍(lán)（methyl thiazolye tetrazolium，MTT）法考察薄荷黃酮對(duì)PC12細(xì)胞存活力的影響，旨在實(shí)現(xiàn)薄荷黃酮綠色高效萃取的同時(shí)，為薄荷資源的深度開發(fā)利用及工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薄荷全草 購(gòu)于安徽省亳州市康美中藥材市場(chǎng)；PC-12（高分化）細(xì)胞株（大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤） 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生化細(xì)胞所；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)于上海泰坦科技股份有限公司；噻唑藍(lán)試劑（methyl thiazolye tetrazolium，MTT）、PBS 緩沖液、1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（無血清）、胰酶細(xì)胞消化液、PC12（高分化）細(xì)胞專屬培養(yǎng)基（RPMI 1640 培養(yǎng)基+10% FBS+1% P/S）均購(gòu)于合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；蘆丁對(duì)照品 購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；其他試劑 均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

KCFD05-03 型亞臨界反應(yīng)釜 煙臺(tái)科立自控設(shè)備研究所；UV4150 紫外可見分光光譜儀 日本島津；IKA/RV10 數(shù)顯型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 艾卡儀器設(shè)備有限公司（德國(guó)）；Axiovert 5 倒置生物顯微鏡 蔡司公司（德國(guó)）；Thermo Multiskan FC 全自動(dòng)酶標(biāo)儀、Thermo Scientific Forma CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱 賽默飛世爾科技公司（美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 亞臨界水萃取薄荷黃酮 將干燥的薄荷全草粉碎成粉末，過60 目篩，石油醚脫脂，準(zhǔn)確稱取5.0000 g 粉末，置于亞臨界反應(yīng)釜，控制溫度、壓力、時(shí)間、液料比等進(jìn)行提取，冷卻后離心，收集上清液，減壓濃縮至無水，加乙醇定容至100 mL，測(cè)定薄荷黃酮質(zhì)量，計(jì)算薄荷黃酮得率[34]。

將上述提取液離心后將上清液置于分液漏斗內(nèi)，取適量石油醚倒入分液漏斗并搖勻，靜置，取上清液，將上清液與二氯甲烷以及70%乙醇溶液于分液漏斗中搖勻，靜置，取下清液。將得到的下清液進(jìn)行減壓蒸餾，直至無醇味，即可得到薄荷黃酮濃縮液。將薄荷黃酮濃縮液置于AB-8 型大孔吸附樹脂，加入解析液（30%乙醇溶液），吸附流速1.5 BV·h-1，洗脫30 h，以致洗脫平衡，得到薄荷黃酮純化液，減壓蒸餾，60 ℃下于真空干燥箱中進(jìn)行干燥，得到薄荷黃酮干燥樣品，用于配制藥物溶液。

1.2.2 薄荷黃酮含量的測(cè)定 參考高丹丹等[25]的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法，經(jīng)改良后用于測(cè)定本實(shí)驗(yàn)的薄荷黃酮。量取2 mL 1.2.1 制備的薄荷黃酮提取液，加入1.0 mL 的5% NaNO2溶液，充分振蕩，搖勻靜置，再加入1.0 mL 的10% Al（NO3）3溶液，振蕩搖勻，然后加入6 mL 的4% NaOH 溶液，充分振蕩后，放置15 min 后于510 nm 處測(cè)定吸光度，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，帶入回歸方程：Y=12.329X+0.002（R2=0.9997）。按公式（1）計(jì)算薄荷黃酮的得率。

式中：W 表示薄荷黃酮得率，%；C 表示黃酮提取液濃度，mg·mL-1；V 表示黃酮提取液體積，mL；m 表示薄荷原料質(zhì)量，g。

1.2.3 亞臨界水提取薄荷黃酮的工藝優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 稱取5.0000 g 粉末，在液料比20:1 mL/g、提取時(shí)間40 min、提取壓力2.5 MPa條件下，考察不同提取溫度（110、120、130、140、150、160 ℃）對(duì)薄荷黃酮得率的影響。

稱取5.0000 g 粉末，在液料比20:1、提取溫度140 ℃、提取壓力2.5 MPa 條件下，考察不同提取時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）對(duì)薄荷黃酮得率的影響。

稱取5.0000 g 粉末，在提取溫度140 ℃、提取時(shí)間40 min、提取壓力2.5 MPa 條件下，考察不同液料比（10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1）對(duì)薄荷黃酮得率的影響。

稱取5.0000 g 粉末，在提取溫度140 ℃、提取時(shí)間40 min、液料比20:1 mL/g 條件下，考察不同壓力（1、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 MPa）對(duì)薄荷黃酮得率的影響。

1.2.3.2 Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，選取3 個(gè)對(duì)薄荷黃酮得率影響較大的因素：提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）和液料比（C），各取三個(gè)水平，利用Box-Behnken 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，詳見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.4 不同提取方法提取薄荷黃酮

1.2.4.1 回流提取薄荷黃酮 精密稱取薄荷粉5.0000 g，加入75 mL 60%乙醇，于80 ℃下提取2 h，離心，上清液加乙醇定容至100 mL，參照1.2.2 測(cè)定薄荷黃酮質(zhì)量，計(jì)算薄荷黃酮得率[24]。

1.2.4.2 超聲波輔助提取薄荷黃酮 精密稱取5.0000 g 薄荷粉置于試劑瓶中，分別加入100 mL 的50%乙醇溶液，60 ℃恒溫水浴1 h，超聲處理30 min，離心，上清液加乙醇定容至100 mL，參照1.2.2 測(cè)定薄荷黃酮質(zhì)量，計(jì)算薄荷黃酮得率[25]。

1.2.4.3 超臨界CO2萃取薄荷黃酮 精密稱取5.0000 g 薄荷粉裝入萃取釜中，啟動(dòng)冷循環(huán)，設(shè)定萃取溫度55 ℃，達(dá)到設(shè)定溫度后，打開鋼瓶閥門，開啟CO2泵，CO2經(jīng)過濾后由壓縮機(jī)壓縮入萃取罐，達(dá)到萃取壓力25 MPa，加入50 mL 70%乙醇為夾帶劑進(jìn)行超臨界萃取，90 min 后收集萃取物，離心，用乙醇溶解定容100 mL，參照1.2.2 測(cè)定薄荷黃酮質(zhì)量，計(jì)算薄荷黃酮得率[26]。

1.2.5 薄荷黃酮對(duì)PC12 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

1.2.5.1 PC12 細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代 將復(fù)蘇后的PC12細(xì)胞放入加有專屬培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，放于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后取出，PBS 緩沖液潤(rùn)洗細(xì)胞，胰酶細(xì)胞消解液消化90 s，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)趨于圓形，取少量PC12 專屬培養(yǎng)基于培養(yǎng)瓶中終止消化，離心，置于顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞懸液至1×105細(xì)胞/mL 即可，將細(xì)胞懸液接種至96 孔板，置于CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱孵育48 h，即可用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.2 藥物溶液的配制 精密稱取1.2.1 制備的薄荷黃酮干燥樣品（標(biāo)記為MF），加入一定體積的DMSO 使之溶解，配成0.1 g·L-1的藥物儲(chǔ)備液，隨后進(jìn)行等比例稀釋即可。

1.2.5.3 MTT 法測(cè)定細(xì)胞活力 在正常對(duì)照組、空白對(duì)照組以及給藥組每孔分別加入濃度為10 μL 10 mg·mL-1的MTT 溶液，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h 產(chǎn)生結(jié)晶，吸走上清液，每孔加入150 μL 的DMSO 溶液，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀測(cè)OD 值（490 nm 處），根據(jù)公式（2）計(jì)算細(xì)胞存活率[35]。

1.2.5.4 薄荷黃酮對(duì)PC12 細(xì)胞增殖的影響 待PC12 細(xì)胞長(zhǎng)至96 孔板室底面積的80%后，棄原培養(yǎng)液，PBS 緩沖液洗兩次，正常對(duì)照組加入無血清的1640 培養(yǎng)基，空白對(duì)照組加入20 μL 的PBS 緩沖液，給藥組加入不同濃度的藥液20 μL，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用上述MTT 法測(cè)定各組細(xì)胞活力[36]。

1.2.5.5 過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞自由基損傷模型的建立及細(xì)胞活力的測(cè)定 待PC12 細(xì)胞長(zhǎng)至96 孔板室底面積的80%后，棄原培養(yǎng)液，PBS 緩沖液洗兩次，加入濃度為0.2 mmol/L 含過氧化氫的1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基100 μL/孔，作用1 h，造成細(xì)胞自由基損傷[13]。棄原培養(yǎng)液，用PBS 緩沖液清洗，棄PBS 緩沖液，于給藥組、空白對(duì)照組、造模組以及正常對(duì)照組中每孔各加入1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基200 μL，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后取出，采用上述MTT法測(cè)定各組細(xì)胞存活率。每組8 孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見圖1。由圖1A 可知，隨著提取溫度的升高，薄荷黃酮的得率逐漸增加，當(dāng)溫度超過140 ℃后，得率快速下降。溫度升高，溶劑水的黏度和極性減小，此時(shí)水的性質(zhì)接近于有機(jī)溶劑，使得室溫下不易溶于水的薄荷黃酮溶解度增大，同時(shí)溫度升高增加了黃酮分子擴(kuò)散的運(yùn)動(dòng)速度。但溫度超過140 ℃后，高溫使黃酮類物質(zhì)發(fā)生分解，一些非目標(biāo)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)、多糖等）溶解度增加，此時(shí)水的承載能力和密度也會(huì)減小，使得率下降，這與Wan 等[36]相關(guān)的研究結(jié)果一致。因此，在后續(xù)的響應(yīng)面試驗(yàn)中提取溫度選擇140 ℃為宜。

圖1 不同因素對(duì)薄荷黃酮得率的影響Fig.1 Effects of different factors on the yield of mint flavonoids

提取時(shí)間對(duì)薄荷黃酮得率的影響如圖1B 所示，反應(yīng)40 min 時(shí)，得率最大，達(dá)到10.32%±0.1850%。合理的提取時(shí)間使固液相充分接觸，此時(shí)溶劑水在高溫高壓下具有較強(qiáng)的溶解能力，能夠充分滲入到細(xì)胞中，有利于傳質(zhì)過程。反應(yīng)達(dá)到平衡后，過分延長(zhǎng)提取時(shí)間，不會(huì)明顯增加溶質(zhì)黃酮的量，反而可能導(dǎo)致非目標(biāo)產(chǎn)物溶出量的增加。這與Nkurunzizaad 等[37]相關(guān)的研究結(jié)果一致。因此，在后續(xù)的響應(yīng)面試驗(yàn)中提取時(shí)間選擇40 min 為宜。

液料比對(duì)薄荷黃酮得率的影響如圖1C 所示，隨著液料比的增加，薄荷黃酮得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)液料比為20:1 mL/g 時(shí)，得率最大，達(dá)到13.25%±0.2914%。液料比的增大有利于降低亞臨界水的黏度，同時(shí)有利于增大濃度梯度，但液料比過大會(huì)降低提取液中薄荷黃酮含量。這與冀恬等[38]的研究結(jié)果一致。因此，在后續(xù)的響應(yīng)面試驗(yàn)中液料比選擇20:1 mL/g 為宜。

壓力對(duì)薄荷黃酮得率的影響如圖1D 所示，隨著壓力的增加，薄荷黃酮得率的變化幅度不大，由此可知壓力對(duì)薄荷黃酮得率的影響較小。這可能是由于在提取過程中，壓力僅起到使水保持液態(tài)的作用，而對(duì)水的極性以及黏度等影響較小[32]。而壓力過高將導(dǎo)致物料顆粒堆積，不利于與溶劑的充分接觸，從而使薄荷黃酮得率略有下降，這與董興葉等[39]相關(guān)的研究結(jié)果一致。

2.2 Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型分析 利用Box-Behnken 進(jìn)行的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果詳見表2。以得率為響應(yīng)值，運(yùn)用Design expert 10.0.7 數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y得率=14.28+0.43A-0.32B+0.42C-0.47AB-0.03AC+0.08BC-1.28A2-1.04B2-1.14C2。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

回歸模型的方差分析以及回歸系數(shù)顯著性試驗(yàn)分析結(jié)果見表3。由表3 可知，該回歸模型F=36.62，P＜0.0001，說明該模型極具顯著性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其失擬項(xiàng)P=0.4974（P＞0.05）（不顯著），表示該模型不具有顯著的誤差，對(duì)實(shí)驗(yàn)工藝能進(jìn)行較好的模擬，實(shí)驗(yàn)誤差小較可靠。同時(shí)模型回歸系數(shù)R2=0.9792，調(diào)節(jié)后的R2=0.9525，說明95.25%的響應(yīng)值變化來源于模型自變量。可利用該回歸方程確定最佳提取工藝。一次項(xiàng)A 提取溫度、B 提取時(shí)間對(duì)得率具有極顯著影響（P＜0.01），C 液料比對(duì)得率具有顯著影響（P＜0.05），各因素的主效應(yīng)關(guān)系為：A（F=20.76）＞C（F=19.93）＞B（F=11.7），即提取溫度＞液料比＞提取時(shí)間。其二次項(xiàng)交互作用AB 對(duì)得率具有極顯著的影響（P＜0.01）。

表3 Box-Behnken 試驗(yàn)回歸模型方差分析Table 3 AVOVA of Box-Behnken experiment

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 A 提取溫度、B 提取時(shí)間和C 液料之間的相互作用詳見圖2。圖2（a）為A 提取溫度和B 提取時(shí)間的交互作用對(duì)得率的影響圖，觀察提取溫度和提取時(shí)間的響應(yīng)曲面可知，響應(yīng)面坡度陡峭，等高線密集且趨于橢圓。隨著提取時(shí)間的增加，得率呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間較少時(shí)，隨著提取溫度的增加，得率的坡度呈先增加后緩慢降低的趨勢(shì)，降低的幅度較小。當(dāng)提取時(shí)間較高時(shí)，得率的變化坡度隨提取溫度的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，降低的幅度較大。由此說明，提取溫度和提取時(shí)間之間存在顯著的交互效應(yīng)。僅考慮二者交互作用的條件下，當(dāng)提取溫度為135～145 ℃水平左右、提取時(shí)間在35～45 min 水平范圍內(nèi)時(shí)，得率達(dá)到最大值，且得率隨提取溫度的變化坡度大于提取時(shí)間，說明提取溫度對(duì)得率的影響大于提取時(shí)間，曲面圖與表3 中的結(jié)果也是相一致的。

圖2 各因素間交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響Fig.2 Effects of interaction between various factors on response values

A 提取溫度和C 液料比的交互作用對(duì)得率的影響如圖2（b）所示，觀察提取溫度和液料比的響應(yīng)曲面可知，響應(yīng)面坡度相對(duì)平緩，等高線稀疏且趨于圓形，說明提取溫度與液料比之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著。此外，得率的變化坡度隨提取溫度、液料比的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)。僅考慮二者交互作用的條件下，當(dāng)提取溫度為135～145 ℃、液料比為17～23 mL/g 水平范圍內(nèi)，得率達(dá)到最大值，且得率隨液料比的變化坡度大于提取溫度，說明液料比對(duì)得率的影響大于提取溫度，曲面圖與表3 中的結(jié)果是一致的。

B 提取時(shí)間和C 液料比的交互作用對(duì)得率的影響如圖2（c）所示，觀察提取時(shí)間和液料比的響應(yīng)曲面可知，響應(yīng)面坡度相對(duì)平緩，等高線稀疏且趨于圓形，說明提取時(shí)間與液料比之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著。此外，得率的變化坡度隨液料比、提取時(shí)間的增加呈先增加后緩慢降低的趨勢(shì)。僅考慮二者交互作用的條件下，在提取時(shí)間為35～45 min、液料比為17～23 mL/g 水平范圍內(nèi)，其得率取得最大值，且得率隨液料比的變化坡度大于提取時(shí)間，說明液料比對(duì)得率的影響大于提取時(shí)間。曲面圖與表3 中的結(jié)果也是一致的。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)回歸方程模型，得到最佳提取工藝條件：提取溫度142.019 ℃、提取時(shí)間38.047 min、液料比20.877:1 mL/g，此模型實(shí)驗(yàn)條件下預(yù)測(cè)薄荷黃酮的得率為14.39%。為驗(yàn)證此模型的結(jié)果，考慮到實(shí)驗(yàn)的實(shí)際條件，將最佳工藝條件修正為提取溫度142 ℃、提取時(shí)間38 min、液料比21:1 mL/g，在此條件下經(jīng)3 次平行試驗(yàn)，得到薄荷黃酮得率為14.07%±0.23%，與模型的相對(duì)誤差在5%范圍內(nèi)，說明實(shí)驗(yàn)值與模型值之間具有良好的相關(guān)性，此模型可靠。

2.3 不同提取方法對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

由于薄荷產(chǎn)地不同、采收期不同、提取部位不同等會(huì)對(duì)薄荷黃酮類化合物的含量產(chǎn)生影響，因此文獻(xiàn)中已報(bào)道的薄荷黃酮提取率差異較大，不利于提取方法的比較[40]。本文參照已報(bào)道的提取方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[24-26]，以水和不同濃度的乙醇為溶劑進(jìn)行提取，平行實(shí)驗(yàn)3 次，驗(yàn)證結(jié)果如表4 所示。由表4 可知，亞臨界水萃取法的薄荷黃酮得率比回流提取法提高了334%，比超聲波輔助提取法提高了75%，比超臨界CO2萃取法提高了173%，顯著高于以上的3 種提取方法的得率（P＜0.001），說明該法具有高選擇、高得率的特點(diǎn)。亞臨界水萃取法所需提取時(shí)間僅有38 min，其他方法提取時(shí)間均在90 min 以上，提取時(shí)間的縮短可以減少能耗。同時(shí)，乙醇回流法和超聲輔助提取法均以乙醇為溶劑，超臨界CO2萃取法雖然以CO2為萃取劑，但在萃取過程中仍需添加乙醇作為夾帶劑進(jìn)行萃取，因此以上三種提取方法均存在有機(jī)溶劑殘留、對(duì)人體以及環(huán)境不夠友好的問題。而亞臨界水萃取法是以純水為溶劑，在萃取過程中無需添加任何有機(jī)溶劑，因此不存在有機(jī)溶劑殘留，且綠色環(huán)保。水不僅資源豐富且價(jià)格低廉，大大降低了提取過程的成本。這些特點(diǎn)為薄荷黃酮實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供了極大地可行性。

表4 不同提取方法的比較Table 4 Comparison of different extraction methods

2.4 薄荷黃酮的體外神經(jīng)保護(hù)活性

2.4.1 薄荷黃酮對(duì)PC12 細(xì)胞增殖的影響 如圖3所示，不同濃度的薄荷黃酮作用PC12 細(xì)胞24 h 后，與正常對(duì)照組比較，給藥組在1～100 μg/mL 范圍內(nèi)的細(xì)胞存活率均在90%以上，說明薄荷黃酮在此濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞存活率沒有顯著影響[41]。

圖3 薄荷黃酮對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of flavonoids from Mentha haplocalyx Briq.on cell proliferation

2.4.2 薄荷黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞自由基損傷的影響 由圖4 可知，與正常組相比，H2O2組的細(xì)胞存活率降至50.09%±1.03%，當(dāng)PC12 細(xì)胞經(jīng)薄荷黃酮（MF）溶液處理后，在1～5 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率有一定的提高，從53.61%±0.64%提高到58.57%±0.86%，說明薄荷黃酮溶液對(duì)PC12 細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，并且隨著薄荷黃酮溶液濃度的增大，細(xì)胞存活率逐漸提高，細(xì)胞氧化損傷程度明顯降低，當(dāng)溶液濃度為100 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞存活率提高至78.49%±0.84%。說明在1～100 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，薄荷黃酮能明顯緩解細(xì)胞氧化損傷，對(duì)PC12 細(xì)胞具有極顯著的保護(hù)作用（P＜0.01）。

圖4 薄荷黃酮（MF）對(duì)H2O2 損傷PC12 細(xì)胞活力的影響Fig.4 Effects on the viability of MF for PC12 cells injured by H2O2

3 結(jié)論

本文建立了一套綠色、高效、可靠的提取薄荷黃酮的提取工藝，以薄荷黃酮得率為考察指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立亞臨界水萃取薄荷黃酮最佳提取工藝，具體工藝參數(shù)為：提取溫度142 ℃、提取時(shí)間38 min、液料比21:1 mL/g，在此條件下得到薄荷黃酮得率為14.07%±0.23%。與已報(bào)道的提取方法比較，亞臨界水萃取薄荷黃酮得率比回流提取法提高了334%，比超聲波輔助提取法提高了75%，比超臨界CO2萃取法提高了173%，顯著高于以上3 種提取方法的得率（P＜0.001）。亞臨界水萃取法具有得率高、選擇性好、時(shí)間短、無污染、成本低廉等優(yōu)勢(shì)。這些優(yōu)勢(shì)為薄荷黃酮實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供了極大地可行性。體外建立H2O2誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷模型，在1～100 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，薄荷黃酮能明顯緩解細(xì)胞氧化損傷，對(duì)PC12 細(xì)胞具有極顯著的保護(hù)作用（P＜0.01）。該結(jié)果暗示薄荷黃酮可能是預(yù)防與治療神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)有前景的候選天然產(chǎn)物。

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