高 晗,李 妍,田 方,李雪利

(1.神威藥業(yè)集團有限公司,河北 石家莊 051430;2.云南神威施普瑞藥業(yè)有限公司,云南 楚雄 675000;3.唐山學院外國語學院,河北 唐山 063000)

連翹為木樨科植物連翹的干燥果實,根據(jù)采收季節(jié)及炮制方式不同分為“青翹”和“老翹”[1],其味苦、性微寒,歸肺、心、小腸經(jīng),具有清熱解毒、消腫散結、疏散風熱的功效。有研究結果顯示,連翹具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、抗病毒、抗過敏、神經(jīng)保護等作用[2-7]。目前,在連翹的提取物中共發(fā)現(xiàn)237種化合物,其中包括46種木脂素,31種苯乙醇糖苷,11種黃酮類化合物,80種萜類,20種環(huán)己醇衍生物,6種生物堿,4種類固醇和39種其他化合物[8]。其中,揮發(fā)性成分主要有α-松油烯、α-蒎烯、莰烯檜烯、β-蒎烯、α-水芹烯、α-松油烯、檸檬烯、β-水芹烯、γ-萜品烯、萜品油烯、β-月桂烯、β-羅勒烯、(+)-蒈烯、α-羅勒烯、芳樟醇、松油烯-4-醇、α-松油醇、反式香芹醇、樟腦[9-13]。

氣相色譜-離子遷移譜法(GC-IMS)將GC和IMS技術進行結合,使得GC分析得到的化學信息更豐富,克服了IMS技術分離度差的問題。相較于GC-質(zhì)譜聯(lián)用技術等常用的揮發(fā)性成分檢測方法,GC-IMS具有快速、靈敏、無需前處理的優(yōu)勢[14],已應用于農(nóng)業(yè)、食品、藥品測定等多個領域[15]。本研究依托GC-IMS技術對連翹飲片及其標準湯劑、揮發(fā)油包合物中揮發(fā)性成分進行差異分析,在明確揮發(fā)性成分種類的基礎上,明確了在連翹藥材提取、制備成標準湯劑過程中揮發(fā)性成分的傳遞情況。同時,本研究還分析了連翹揮發(fā)油包合物與標準湯劑中揮發(fā)性成分的組成,旨在為連翹配方顆粒生產(chǎn)、質(zhì)量控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1材料 FlavourSpec?型氣相離子遷移譜聯(lián)用儀(濟南海能儀器股份有限公司),十萬分之一CPA225D 電子分析天平(德國賽多利斯股份公司),高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司),養(yǎng)生藥膳壺(合肥榮事達小家電有限公司),R502B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司),2 L圓底燒瓶,MH-2000調(diào)溫型電熱套(北京科偉永興儀器有限公司),β-環(huán)糊精(安徽山河藥用輔料股份有限公司),95%乙醇(天津市科密歐化學試劑有限公司,分析純)。水為純化水,其余試劑均為分析純。連翹藥材(產(chǎn)地:陜西商洛;批號:2012231;揮發(fā)油含量:0.025%),經(jīng)原河北省藥品檢驗所鑒定為木樨科植物連翹Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥果實。

1.2方法

1.2.1樣品前處理 (1)連翹飲片供試品制備:取連翹藥材,除去雜質(zhì)及異物,即得連翹飲片[16]。稱取連翹飲片1.0 g(過四號篩),精密稱定,置20 mL頂空瓶中。(2)連翹揮發(fā)油供試品制備:取連翹飲片20 g(批號:2012231),按2020年版《中國藥典》2204揮發(fā)油測定法中甲法[17]進行揮發(fā)油提取。將冷凝后的揮發(fā)油由活塞口放出,加入無水硫酸鈉適量,靜置脫水20 min,精密量取連翹揮發(fā)油0.025 mL,置20 mL頂空瓶中。(3)連翹標準湯劑供試品制備:取連翹飲片100 g,加水煎煮2次,一煎加8倍水,浸泡30 min,煮沸,保持微沸煎煮20 min,120目篩網(wǎng)過濾,立即冷卻至室溫;二煎加6倍水,煮沸,保持微沸煎煮15 min,120目篩網(wǎng)過濾,立即冷卻至室溫;合并2次煎液,低溫真空濃縮(濃縮溫度小于或等于60 ℃)至生藥比1∶3(g/mL),即得連翹標準湯劑[18-19]。分別精密量取連翹第1次提取液(4 mL)、第2次提取液(6 mL)、總提取液(14 mL)、標準湯劑(8 mL)、旋出液(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)出的液體,11 mL),置20 mL頂空瓶中。(4)連翹揮發(fā)油包合物供試品制備:按1 mL∶15 g(連翹揮發(fā)油∶β-環(huán)糊精)比例稱取β-環(huán)糊精,加入6倍量水攪拌均勻。取連翹揮發(fā)油適量,按連翹揮發(fā)油與乙醇1∶1比例加入乙醇,攪拌均勻。向β-環(huán)糊精水溶液中緩慢滴入揮發(fā)油乙醇溶液,設定包合溫度50 ℃,包合時間2 h,真空干燥。精密稱定連翹揮發(fā)油包合物0.375 g,置20 mL頂空瓶中。

1.2.2測定條件 將上述供試品于75 ℃孵化20 min,頂空進樣,使用GC-IMS進行測定。測定條件:FS-SE-54-CB-1色譜柱(0.53 mm×15 m,1 μm),載氣/飄移氣為氮氣,氣流量150 mL/min,探測器溫度45 ℃,載氣流量程序設定(0～2 min,2 mL/min;2～15 min,2 mL/min→10 mL/min;15～30 min,10 mL/min→150 mL/min;30～40 min,150 mL/min),柱溫75 ℃,進樣針溫度85 ℃,進樣量200 μL。

1.3統(tǒng)計學處理 使用儀器配套分析軟件,包括實驗室分析查看器(LAV)、GC-IMS Library Search。LAV可用于查看分析譜圖,圖中每1個點代表1種揮發(fā)性有機物,對其建立標準曲線后進行定量分析。其中,Reporter插件直接對比樣品之間的譜圖差異(二維俯視圖和三維譜圖);Gallery Plot插件可進行指紋圖譜對比,直觀且定量地比較不同樣品之間揮發(fā)性有機物的差異。GC-IMS Library Search軟件內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫可對物質(zhì)進行定性分析。

表1 連翹飲片揮發(fā)性成分匯總

2 結 果

2.1GC-IMS二維圖譜分析 不同供試品中均含多種揮發(fā)油性成分,且揮發(fā)油含量存在明顯差異。連翹飲片與連翹揮發(fā)油中揮發(fā)性成分基本一致;而連翹第1次提取液、第2次提取液、總提取液則明顯與連翹飲片不同,在氣相色譜保留時間600～800 s缺少相應的揮發(fā)油成分;提取液濃縮過程中揮發(fā)性成分仍然在損失,800～1 000 s揮發(fā)性成分轉(zhuǎn)移至旋出液中。由連翹揮發(fā)油與連翹揮發(fā)油包合物比較可知,包合過程中,揮發(fā)性成分損失嚴重,部分揮發(fā)性成分未與β-環(huán)糊精形成包合而損失,僅部分揮發(fā)油形成穩(wěn)定的包合物。但連翹揮發(fā)油包合物與連翹標準湯劑中揮發(fā)性成分基本保持一致。見圖1。

圖1 GC-IMS二維圖譜

2.2GC-IMS指紋圖譜分析 以GC-IMS二維圖譜中的所有成分峰為分析對象,自動生成指紋圖譜,見圖2。連翹提取液中仍然含有大量揮發(fā)油,包括α-蒎烯、檸檬烯及1、2、4、5、9、10、11物質(zhì)。連翹標準湯劑中主要含有的揮發(fā)油包括α-蒎烯、檸檬烯及1、2、4、5物質(zhì),且濃度和提取液中的基本一致,都是保留時間相對較小的物質(zhì)。而旋出液中則主要含有9、10、11物質(zhì),且濃度和提取液中的基本一致,都是保留時間相對較大的物質(zhì)。

注:每行代表1個樣品中全部的揮發(fā)性成分峰,每列代表同一種類成分在不同供試品中的信號峰1～11未知成分。

連翹揮發(fā)油中的萜烯類物質(zhì)濃度非常高,但做成連翹揮發(fā)油包合物后,揮發(fā)油濃度大幅降低,物質(zhì)的種類則和連翹標準湯劑一致,濃度也相差不大,可以通過添加該包合物到連翹顆粒中來還原標準湯劑中的揮發(fā)油。

2.3連翹樣品中揮發(fā)性成分定性分析 應用GC-IMS Library Search軟件內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫對連翹揮發(fā)性成分進行定性分析,結果見圖3、表1。連翹揮發(fā)油含有14種成分,其中12種為未知成分,3種已知成分分別為α-蒎烯、檸檬烯、芳樟醇。

圖3 連翹飲片揮發(fā)性成分定性分析

3 討 論

FlavourSpec?型氣相離子遷移譜聯(lián)用儀在非真空且無樣品前處理前提下,經(jīng)頂空進樣后可快速檢測連翹飲片、標準湯劑、揮發(fā)油包合物中的揮發(fā)性成分,其根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)GC保留時間和離子遷移時間進行定性分析。本研究共檢測出14種揮發(fā)性化合物成分,并通過NIST2014氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫與IMS數(shù)據(jù)庫比對,確定了3種揮發(fā)性物質(zhì)。對連翹飲片、連翹標準湯劑、連翹揮發(fā)油包合物的揮發(fā)性成分進行關聯(lián)性分析,可對連翹配方顆粒生產(chǎn)具有一定指導意義。

連翹中萜烯類揮發(fā)油在GC-IMS圖譜中的出峰形狀非常有特點,在同一保留指數(shù)下有很多不同遷移時間的樣品峰,形成一條橫向的條帶,容易識別。從GC-IMS圖譜中條帶數(shù)目及亮度可以看出,連翹飲片的第1次提取液、第2次提取液及混合液中揮發(fā)油成分基本一致。連翹藥材和揮發(fā)油中的萜烯類物質(zhì)非常豐富,而提取液中主要含有α-蒎烯、檸檬烯及1、2、4、5、9、10、11物質(zhì)。連翹標準湯劑中含有較低保留指數(shù)的揮發(fā)油,包括α-蒎烯、檸檬烯及1、2、4、5物質(zhì);而保留指數(shù)相對高的揮發(fā)油(9、10、11物質(zhì))則進入旋出液中。揮發(fā)油在包埋過程中大量損失,包合物中含有的萜烯類物質(zhì)種類和連翹標準湯劑中的一致,且濃度相似,因此可以直接添加到連翹顆粒中用于還原標準湯劑中的揮發(fā)油。本研究通過對連翹飲片、連翹標準湯劑、連翹揮發(fā)油包合物的揮發(fā)性成分進行了關聯(lián)分析,最大限度地還原了標準湯劑中揮發(fā)油類成分,為后續(xù)配方顆粒生產(chǎn)過程中揮發(fā)油的控制提供了保證。

綜上所述,連翹揮發(fā)油包合物與連翹揮發(fā)油成分存在差異,但與連翹標準湯劑基本一致,可為連翹配方顆粒生產(chǎn)、質(zhì)量控制提供參考。本研究豐富了連翹標準湯劑制備過程中揮發(fā)油類成分轉(zhuǎn)移的研究,但僅鑒定出3種成分,可能為標準湯劑制備過程中揮發(fā)油類成分的組分發(fā)生一定變化所致,因此下一步將繼續(xù)進行深入研究。