黃 茜,陳穎志,甘梵飛,陶愛(ài)恩

(麗江文化旅游學(xué)院醫(yī)學(xué)院,云南 麗江 674100)

木香收載于《中國(guó)藥典》,為菊科草本植物木香Aucklandia lappa Decne.的干燥根。大量研究表明,木香中含有270余種成分,其中包括具有調(diào)節(jié)胃腸功能、抗腫瘤、抗菌和抗炎作用的揮發(fā)油、萜類、糖苷、氨基酸及膽胺類等物質(zhì)[1-4]。近年來(lái),隨著對(duì)木香化學(xué)成分、藥理活性及臨床應(yīng)用等方面的深入研究,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)木香在抗炎、抗癌、抗?jié)?、抗病原微生物及其他多個(gè)領(lǐng)域表現(xiàn)出顯著的藥理活性[5]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),木香中的活性成分對(duì)多種癌細(xì)胞具有毀滅作用,但是關(guān)于木香在胃癌中的作用研究較少見(jiàn)。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù),通過(guò)藥物-疾病-作用靶點(diǎn)等多途徑調(diào)節(jié)的理念闡述藥物治療疾病的作用機(jī)制,進(jìn)一步為闡述木香治療胃癌提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)(TCMSP),對(duì)木香的活性成分進(jìn)行查詢,并查閱相關(guān)文獻(xiàn)。在此基礎(chǔ)上,篩選并預(yù)測(cè)木香關(guān)鍵活性成分和核心靶點(diǎn)。

1.2方法

1.2.1篩選木香成分靶點(diǎn) 使用TCMSP(https://tcmsp-e.com/)檢索木香活性成分,篩選活性成分的選擇條件為口服生物利用度(OB)大于或等于30%,類藥性(DL)大于或等于0.18。通過(guò)對(duì)整理得到的靶點(diǎn)進(jìn)行Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)校準(zhǔn),以獲得標(biāo)準(zhǔn)化的基因名。同時(shí),為了確保所有蛋白名稱都符合規(guī)范,限定輸入蛋白名稱所屬物種為“Homo sapiens”。

1.2.2胃癌疾病靶點(diǎn)篩選 在GeneCards和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)中分別使用關(guān)鍵詞“gastric cancer”進(jìn)行搜索,獲取相關(guān)疾病的靶點(diǎn)。將這些靶點(diǎn)整合并去除重復(fù)值,得到最終的疾病靶點(diǎn)集合。將獲得的藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行相互映射,并利用Venn圖確定靶點(diǎn)之間的共同基因。最后,借助Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建一個(gè)包含“藥物-疾病-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.2.3木香與胃癌靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了進(jìn)一步研究木香在治療胃癌時(shí)蛋白質(zhì)之間的相互作用,將藥物-交集基因上傳至相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)String(https://string-db.org/),進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。選擇“Homo sapiens”物種,默認(rèn)參數(shù),將最終結(jié)果保存為T(mén)SV格式,導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析(Cytoscape→Tools→Network analyzer→Network analysis→Analyze network),并保存網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果。用節(jié)點(diǎn)大小和顏色反映Degree的大小,節(jié)點(diǎn)越大,Degree值越大;邊的粗細(xì)用于反映Combine score的大小,邊越粗,Combine score越大。挑選核心靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4基因本體論(GO)富集分析和京東基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路分析 對(duì)于目標(biāo)基因運(yùn)用clusterProfiler軟件包進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。選擇人類物種作為研究對(duì)象,以P<0.05作為富集篩選的顯著性標(biāo)準(zhǔn),并提取排名前10位結(jié)果。利用Rstudio中的ggplot2軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化繪圖。從生物過(guò)程、細(xì)胞成分、分子功能3方面注釋木香治療胃癌的作用靶蛋白在基因功能中的作用。為闡明木香治療胃癌的靶點(diǎn),在信號(hào)通路中進(jìn)行KEGG通路富集分析。

1.2.5活性成分與靶點(diǎn)的分子對(duì)接 使用AutoDock Vina(1.1.2)軟件對(duì)木香的活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,以驗(yàn)證二者的相互作用活性,具體步驟如下:(1)從TCMSP官網(wǎng)下載mol2格式的化合物,在Chembio3D軟件中進(jìn)行能量最小化處理;在AutodockTools-1.5.6軟件中導(dǎo)入化合物,并進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷、分配電荷等操作,最終保存為“pdbqt”格式。(2)從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)中下載與目標(biāo)蛋白相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白,優(yōu)先選擇人源蛋白,并考慮其與待對(duì)接活性成分結(jié)構(gòu)的相似度及高分辨率情況。(3)利用PyMoL(2.3.0)軟件去除目標(biāo)蛋白中原始配體和水分子,并將其導(dǎo)入AutoDocktools(v1.5.6)軟件,再進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷、分配電荷和指定原子類型等處理,最終保存為“pdbqt”格式。(4)根據(jù)目標(biāo)蛋白原始配體或在報(bào)道的關(guān)鍵氨基酸殘基附近確定對(duì)接盒子中心位置,若無(wú)原始配體則選取附近區(qū)域作為對(duì)接區(qū)域。格點(diǎn)盒子大小設(shè)置為60×60×60(每個(gè)格點(diǎn)間距0.375 ?),其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。(5)利用PyMOL和Ligplot軟件進(jìn)行相互作用模式分析。在半柔性對(duì)接中,應(yīng)選擇與度值較高的化合物相結(jié)合的前5個(gè)重要靶點(diǎn)。為了評(píng)估小分子與靶蛋白之間的結(jié)合情況,可以使用結(jié)合能來(lái)進(jìn)行衡量。當(dāng)結(jié)合能小于0時(shí),表示小分子可以自由地與靶蛋白發(fā)生結(jié)合。數(shù)值越小,則代表著更高的結(jié)合可能性。

2 結(jié) 果

2.1木香活性成分篩選與靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 經(jīng)過(guò)篩選,獲得5個(gè)木香活性成分,其滿足OB≥30%和DL≥0.18,并且這些成分共作用于29個(gè)靶點(diǎn)。見(jiàn)表1。

表1 篩選后木香中活性成分

2.2胃癌疾病靶點(diǎn)篩選 通過(guò)GeneCards和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲得15 197、312個(gè)胃癌相關(guān)基因,將2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)合并去重后得到15 221個(gè)共同基因。通過(guò)Venny 2.1軟件將木箱成分候選靶點(diǎn)與胃癌疾病靶點(diǎn)做交集,獲得共同靶點(diǎn)25個(gè)。見(jiàn)圖1。藥物-成分-靶點(diǎn)復(fù)合網(wǎng)絡(luò)如圖2所示,該網(wǎng)絡(luò)共有35個(gè)節(jié)點(diǎn),44條邊。

圖1 木香成分靶點(diǎn)與胃癌疾病靶點(diǎn)的共同靶點(diǎn)

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)復(fù)合網(wǎng)絡(luò)

2.3核心靶點(diǎn)及網(wǎng)絡(luò)相互作用 將韋恩圖所得的藥物靶點(diǎn)與疾病共有的25個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù),該數(shù)據(jù)庫(kù)用于預(yù)測(cè)蛋白-蛋白相互作用。構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)如圖3所示,該網(wǎng)絡(luò)共有23個(gè)結(jié)點(diǎn)和65條邊,其中前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合成酶(PTGS)2、PTGS1、單胺氧化酶(MAO)A、MAOB、SLC6A3為核心靶點(diǎn)。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4生物功能富集分析

2.4.1GO富集分析 共篩選出624個(gè)GO條目,其中與生物過(guò)程相關(guān)的有487個(gè),涉及細(xì)胞成分的有49個(gè),包含分子功能的有88項(xiàng)。排名前10位的生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能GO條目見(jiàn)圖4。在生物過(guò)程方面,主要涉及G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)信號(hào)傳遞途徑、環(huán)核苷酸第二信使耦合、平滑肌收縮以及循環(huán)系統(tǒng)中的血管調(diào)節(jié)等。在細(xì)胞成分方面,主要包括突觸后膜和突觸前膜等組成部分。在分子功能方面,主要涉及GPCR的活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體的功能及參與調(diào)控突觸后膜電位的神經(jīng)遞質(zhì)受體的作用等。

圖4 木香與胃癌交集基因的GO富集分析

2.4.2KEGG通路富集分析 KEGG通路富集結(jié)果顯示,木香治療胃癌時(shí)可能涉及85條通路,其中排名前10的通路包括神經(jīng)活性配體與受體的相互作用、鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑、血清素的作用、脂肪細(xì)胞內(nèi)脂解調(diào)節(jié)機(jī)制、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷-蛋白激酶G信號(hào)傳遞通路、酪氨酸代謝過(guò)程、膽堿能突觸功能及化學(xué)致癌物質(zhì)對(duì)受體的激活效應(yīng)等。見(jiàn)圖5。木香可能通過(guò)上述通路調(diào)節(jié)干預(yù)疾病。

圖5 木香與胃癌交集基因的KEGG富集分析

2.5分子對(duì)接結(jié)果 所有小分子均能成功進(jìn)入靶蛋白的活性中心,為了展示最佳對(duì)接效果,選擇與每個(gè)蛋白質(zhì)相互作用最好的小分子進(jìn)行圖形化呈現(xiàn)。Benzo(a)carbazole與MAOA的Glu216形成氫鍵,氫鍵的長(zhǎng)度為3.21 ?;Benzo(a)carbazole與MAOB的Tyr435形成氫鍵,氫鍵的長(zhǎng)度為3.05 ?;Benzo(a)carbazole與PTGS1的Tyr385形成氫鍵,氫鍵的長(zhǎng)度為2.81 ?;Benzo(a)carbazole與PTGS2的Tyr385形成氫鍵,氫鍵的長(zhǎng)度為2.93 ?;Mairin與SLC6A3的HGly386、Asp385形成氫鍵,氫鍵的長(zhǎng)度分別為3.11、2.83 ?。小分子與周圍的氨基酸殘基均形成了較強(qiáng)的疏水作用,木香核心成分與核心靶點(diǎn)均對(duì)接良好。見(jiàn)表2、圖6～10。

圖6 Benzo(a)carbazole與MAOA蛋白相互作用模式分析

圖7 Benzo(a)carbazole與MAOB蛋白相互作用模式分析

圖8 Benzo(a)carbazole與PTGS1蛋白相互作用模式分析

圖9 Benzo(a)carbazole與PTGS2蛋白相互作用模式分析

圖10 Mairin與SLC6A3蛋白相互作用模式分析

表2 活性成分與核心靶蛋白對(duì)接結(jié)果

3 討 論

木香被廣泛應(yīng)用在腫瘤治療中[6-13]。王緒穎等[14]的數(shù)據(jù)庫(kù)處理分析結(jié)果顯示,木香在腫瘤藥物搜索過(guò)程中的使用頻率排名第2。胃癌在我國(guó)的發(fā)病率居于世界首位[15]。目前,關(guān)于木香治療胃癌的研究較少見(jiàn)。本文為系統(tǒng)了解木香抗胃癌作用機(jī)制,通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了分析。

本研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及篩選后獲得5個(gè)活性成分,分別為Mairin、Sitosterol、Stigmasterol、Benzo(a)carbazole、cynaropicrin,其中Mairin、cynaropicrin為萜類有效成分,主要具有抗炎、抗腫瘤和抗?jié)兊淖饔肹16]。郭旭等[17]研究表明,不同水平樺木酸對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖具有抑制性,且呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性。抗癌機(jī)制主要通過(guò)改變腫瘤細(xì)胞的毒性作用,干擾其細(xì)胞周期,有針對(duì)性地促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡、自噬和分化,并阻礙其遷移、侵襲等過(guò)程,從而增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。CHO等[18]成功分離出具有活性的倍半萜內(nèi)酯(cynaropicrin、reynosin和珊塔瑪內(nèi)酯)。適量使用cynaropicrin時(shí),可以有效地抑制腫瘤壞死因子-α的活性,并且其主要作用是通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)的生成及限制淋巴細(xì)胞的增殖,參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。大部分植物都含有Sitosterol、Stigmasterol。KUMAR等[19]通過(guò)全面的植物化學(xué)和細(xì)胞毒性研究發(fā)現(xiàn),植物提取物Stigmasterol普遍具有抗癌、抗氧化、抗菌功效。Sitosterol能夠提高共刺激細(xì)胞的表達(dá)水平,進(jìn)而激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)通路,并增強(qiáng)對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞的殺傷效果;同時(shí),Stigmasterol能有效抑制胃癌細(xì)胞遷移能力,并以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞周期阻滯[20-21]。關(guān)于Benzo(a)carbazole的報(bào)道較少見(jiàn),但是從研究中可以看出,其與核心靶點(diǎn)MAOA、MAOB、PTGS1、PTGS2結(jié)合能最強(qiáng)。由此可以初步推斷,木香主要通過(guò)多成分共同對(duì)胃癌進(jìn)行干預(yù)。

本研究通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn),PTGS2、MAOA、MAOB、SLC6A3、PTGS1為核心靶點(diǎn),提示木香抗胃癌可能是通過(guò)干預(yù)核心靶蛋白發(fā)揮關(guān)鍵作用。MAO是機(jī)體內(nèi)比較重要的酶,其可以催化生物體在大腦和周圍神經(jīng)組織中產(chǎn)生胺類物質(zhì),并促使其發(fā)生氧化脫氨反應(yīng)。根據(jù)底物選擇性和對(duì)抑制劑的敏感度,MAO可分為MAOA和MAOB。作為一種兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)降解酶,研究者一直將其與精神疾病聯(lián)系在一起,關(guān)于抗腫瘤方面涉及的研究比較少,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析得到其與胃癌的治療密切相關(guān)。羅家梓[22]研究結(jié)果顯示,MAOA在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá),與胃癌預(yù)后呈相關(guān)性。PTGS2是一種誘導(dǎo)型酶,在胃腸道腫瘤炎癥性微環(huán)境中起著關(guān)鍵作用,其功能與炎癥和致癌相關(guān)[23]。有研究表明,PTGS2高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致癌變的發(fā)生,其主要機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞因子表達(dá)而產(chǎn)生作用,且PTGS2上調(diào)與胃腸道癌變有密切關(guān)系[24-26]。有研究表明,選擇性PTGS2抑制劑塞來(lái)昔布對(duì)胃癌小鼠胃腫瘤的形成具有抑制作用[27-28]。SLC6A3作為一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在大腦中主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)多巴胺水平,其表達(dá)異常與精神類等疾病相關(guān)[29]。腫瘤細(xì)胞常利用轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)維持自身生長(zhǎng),并在多種腫瘤細(xì)胞中上調(diào)表達(dá),以滿足癌細(xì)胞快速增殖所需要的能量[30-31]。胃癌組織學(xué)類型中提到了神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤,這些類型腫瘤的產(chǎn)生是否與SLC6A3的表達(dá)有關(guān),目前尚不明確。

本研究通過(guò)GO分析和KEGG分析發(fā)現(xiàn),相關(guān)通路涵蓋了癌癥、炎癥等多個(gè)方面。GPCR在信號(hào)傳遞過(guò)程中扮演著核心角色,影響多種細(xì)胞功能。越來(lái)越多的研究表明,在腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域,GPCR及其配體具有重要作用。G蛋白偶聯(lián)受體激酶(GRKs)是一類包含7種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,能夠特異性地激活GPCR。哺乳動(dòng)物的GRKs可分為3個(gè)亞組:視紫紅質(zhì)激酶(GRK1、GRK7),β-ARK亞組(GRK2、GRK3)及GRK4亞組(GRK4、GRK5、GRK6)。通過(guò)磷酸化反應(yīng),GRK3可以調(diào)節(jié)廣泛的受體功能,并使β-腎上腺素及相關(guān)GPCR的激動(dòng)劑發(fā)揮作用。李源等[32]研究結(jié)果顯示,與非癌組織相比,胃癌及其配對(duì)癌旁組織GRK3表達(dá)水平在癌組織中呈上升趨勢(shì)。此外,胃癌患者G蛋白偶聯(lián)受體35(GPR35) mRNA表達(dá)水平上調(diào),且其與患者存活期顯著相關(guān),提示GPR35可能成為評(píng)估胃癌預(yù)后及開(kāi)展靶向治療時(shí)有價(jià)值的生物學(xué)指標(biāo)[33]。

綜上所述,木香主要通過(guò)多成分共同對(duì)胃癌進(jìn)行干預(yù),其可能是通過(guò)干預(yù)核心靶蛋白發(fā)揮關(guān)鍵作用。但是,在研究過(guò)程中對(duì)于成分采用的數(shù)據(jù)庫(kù)不全面,并未做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,因而只能為抗胃癌新藥的研究與開(kāi)發(fā)提供理論參考和思路。