孔偉浩, 孫帥, 陸禹河, 徐達峰, 殷佳偉, 張錦原, 秦昆明, 高珣

(江蘇海洋大學藥學院,江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室, 江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心, 連云港 222005)

產(chǎn)品配方基于蒙古族經(jīng)典驗方“檀香三味散”化裁而來,以廣棗為主,肉豆蔻為輔。首次將廣棗浸膏粉配伍肉豆蔻揮發(fā)油包合物使用,制備成具有抗氧化功效的蒙藥廣棗-肉豆蔻片。當前已有眾多研究表明廣棗提取物和肉豆蔻揮發(fā)油中含有多種抗氧化成分,主要為酚類和黃酮類物質[1-4]。其中廣棗成分原兒茶酸(protocatechuic acid,PCA)、槲皮素[5-8];肉豆蔻成分肉豆蔻醚、甲基丁香酚[9-10]已被證實為原藥材中重要抗氧化物質。

根據(jù)國家市場監(jiān)督管理總局的規(guī)定,處方中肉豆蔻為食藥同源藥材,配以廣棗,旨在開發(fā)出一款用于抗氧化的保健食品并進行質量控制,現(xiàn)基于《中國藥典》(2020年版)片劑項要求對產(chǎn)品質量進行考察;采用高效液相色譜技術(high performance liquid chromatography,HPLC)對產(chǎn)品中4種抗氧化物質進行含量測定,進而證實產(chǎn)品的質量合格及藥效依據(jù),以期為將來產(chǎn)品的上市提供扎實的理論基礎。

1 儀器與試劑

DP30A單沖壓片機(北京國藥龍立科技有限公司);YD-Ⅲ片劑硬度測試儀(上海精密儀器儀表有限公司);ZBS-6E崩解試驗儀(上海滬粵明科學儀器有限公司);ZNCL-GS磁力攪拌器(上海道京儀器有限公司);DS-L30超聲波清洗機(無錫鼎實電子科技有限公司);LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司);FD-1A-50冷凍干燥器(上海蘭儀實業(yè)有限公司);FT-2000F脆碎度儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司);RE-52AA旋轉蒸發(fā)器(上海亞容生化儀器廠);VO-6020T真空干燥箱(上海燈晟儀器制造有限公司);JJ224BC電子分析天平(上海賽多利斯貿(mào)易有限公司);DHG-9080A鼓風干燥箱(上海博珍儀器設備制造廠);ZNHW恒溫電熱套(鄭州市煜城儀器有限公司)。

無水乙醇(分析純,上海麥克林生化科技股份有限公司);磷酸(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);甲醇(色譜純,美國Sigma Aldrich公司);石油醚(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司);對照品:槲皮素(批號:100081-201610,純度≥98%)、原兒茶酸(批號:110809-201906,純度≥98%)、肉豆蔻醚(批號:190180-201701,純度≥98%)、甲基丁香酚(批號:111642-200301,純度≥98%)均購自南通飛宇生物科技有限公司;AB-8大孔吸附樹脂(上海麥克林生化科技股份有限公司);廣棗、肉豆蔻兩味中藥購自本地北京同仁堂藥店。

2 方法與結果

2.1 廣棗浸膏粉的制備過程

稱取一定量過80目篩網(wǎng)的廣棗生藥粉,加入9倍量的50%乙醇溶液,加熱醇提回流提取3次,每次2 h,過濾合并濾液,減壓蒸餾回收乙醇后靜置即得廣棗醇提液。將廣棗醇提液倒入至預處理后AB-8大孔吸附樹脂柱,進行富集提純。調試醇提液pH為2～3,設定樣品液流速2 BV/h,洗脫液流速為3 BV/h,選用50%乙醇作為洗脫液進行洗脫,回收溶劑至洗脫液為稠膏狀,放入冷凍干燥機內(nèi)干燥即得主藥廣棗浸膏粉。

2.2 肉豆蔻油包合物的制備過程

稱取一定量過80目篩網(wǎng)的肉豆蔻生藥粉,加入6倍量水,浸泡3 h后連接揮發(fā)油提取器,加熱提取6 h,靜置后收集浮于水面的輕油,利用硫酸鎂脫水處理后即得肉豆蔻揮發(fā)油。稱取相當于肉豆蔻油8倍量的β-環(huán)糊精,添加適量純化水攪拌并加熱至70 ℃制成飽和溶液,降溫至40 ℃并保溫。取等體積肉豆蔻揮發(fā)油和無水乙醇混勻后滴入飽和溶液中,持續(xù)2 h包合攪拌后冷卻至室溫,放入冰箱中冷藏24 h取出,抽濾得濾餅后用石油醚洗去浮油后真空干燥,即得主藥肉豆蔻揮發(fā)油包合物。

2.3 片劑處方及工藝

將上述所得廣棗浸膏粉和肉豆蔻油包合物徹底研磨過80目篩網(wǎng)以備用。將處方占比35%廣棗浸膏粉、15%肉豆蔻油包合物與29.5%乳糖(填充劑)、20%低取代羥丙基纖維素(崩解劑)混勻,添加10%淀粉漿(黏合劑)制軟材,通過18目篩網(wǎng)濕法擠壓制粒,45 ℃鼓風干燥0.5 h,過18目篩整粒,使顆粒粒徑處于18～80目,最后將上述步驟所得顆粒與0.5%硬脂酸鎂(潤滑劑)混勻后,添加入壓片機內(nèi)以7.5 mm沖膜壓片,即得所述的產(chǎn)品片劑,單片約0.16 g。產(chǎn)品技術路線見圖1。

圖1 蒙藥廣棗-肉豆蔻片技術路線圖Fig.1 Technical roadmap of Mongolian medicine Fructus choerospondiatis-Nutmeg tablets

2.4 廣棗-肉豆蔻片質量考察

為進一步驗證該處方工藝下片劑質量,制備三批樣品(20220520、20220524、20220603),按照《中國藥典》(2020年版)四部片劑項下要求,對外觀性狀、硬度、片重差異、崩解時限及脆碎度進行測試。

2.4.1 外觀性狀

優(yōu)良的外觀性狀是片劑質量的有效保障,還可提升服用者對片劑的信任感。隨機選取3批樣品共計20片,根據(jù)藥典中片劑外觀性狀的檢查方法,要求片形均一、片面完整、光滑細膩、無粉末飄散,無雜質沾染。結果見圖2和表1。

表1 外觀性狀考察結果(n=20)Table 1 Appearance inspection results(n=20)

圖2 片劑外觀性狀圖Fig.2 Appearance character map of tablets

2.4.2 片量差異

片重差異嚴重,會致使產(chǎn)品含量不均一,導致療效受到影響。隨機選取3批樣品共計20片,根據(jù)藥典中片重差異的檢查方法,要求片劑平均片重≤0.3 g,其重量差異限度應控制在7.5%以內(nèi)。結果見表2。

表2 片劑的重量差異檢測結果(n=20)Table 2 Weight difference detection results of tablets (n=20)

2.4.3 硬度測定

在片劑日常運輸和攜帶過程中,片劑容易受到晃動和擠壓而碎裂,因此需要具有良好硬度以抵抗這些影響。隨機選取3批樣品共計20片,《中國藥典》沒有就片劑的硬度做出統(tǒng)一規(guī)定,不同生產(chǎn)單位都有自己的內(nèi)控準則,一般當片劑具有30 N以上硬度值時即可,結果見表3。

表3 片劑硬度檢測結果(n=20)Table 3 Tablet hardness test results (n=20)

2.4.4 崩解時限檢查

崩解,即片劑在指定溶液內(nèi)完全崩解成粉。隨機選取3批樣品共計20片,按崩解時限檢查法進行檢測,《中國藥典》規(guī)定普通片劑的崩解時限應控制在15 min內(nèi)。結果見表4。

表4 片劑崩解時限檢測結果(n=20)Table 4 Test results of tablet disintegration time limit(n=20)

2.4.5 脆碎度測定

隨機選取3批樣品共計40片,稱得總重為6.55 g。吹除散落的藥粉,準確稱重后放入滾筒內(nèi),旋轉規(guī)定次數(shù),取出即可;再次吹除藥粉后稱重。根據(jù)藥典中片劑脆碎度的檢查方法,要求損失的重量至多1%,并且不允許出現(xiàn)片劑碎裂的情況。結果見表5。

表5 片劑脆碎度檢測結果(n=40)Table 5 Test results of tablet fragility (n=40)

2.5 廣棗-肉豆蔻片含量測定

2.5.1 色譜條件

色譜柱Waters-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相0.2%磷酸水(A)-甲醇(B);梯度洗脫(0～20 min,5%→20%B;20～40 min,20%→45%B;40～70 min,45%→65%B;70～78 min,65%→70%B;78～80 min,70%→5%B;80～90 min,5%→5%B);檢測波長255 nm;柱溫25 ℃;流速0.8 min/mL;進樣量5 μL。

2.5.2 溶液的制備

1) 混合對照品溶液

精密稱取原兒茶酸、槲皮素、甲基丁香酚、肉豆蔻醚對照品適量,分別置于25 mL容量瓶中,用甲醇稀釋并定容,超聲后得質量濃度分別為原兒茶酸0.1 mg/mL、槲皮素0.1 mg/mL、甲基丁香酚0.2 mg/mL、肉豆蔻醚1 mg/mL的對照品儲備液。分別精密吸取原兒茶酸儲備液3 mL,槲皮素儲備液0.185 mL,甲基丁香酚儲備液1.25 mL,肉豆蔻醚儲備液6.5 mL,置于同一25 mL容量瓶中,再次用甲醇稀釋并定容,超聲后制得質量濃度為原兒茶酸12 μg/mL、槲皮素0.74 μg/mL、甲基丁香酚10 μg/mL和肉豆蔻醚260 μg/mL的混合對照品溶液。置于4 ℃的冰箱中保存。

2) 樣品溶液的制備

取多片研磨成細粉,精確稱取約0.15 g藥粉置于25 mL容量瓶中,添加50%甲醇溶液稀釋至刻度后密封,超聲樣品溶液30 min,放置室溫后再次稀釋并定容,用0.22 μm有機濾膜過濾雜質,即得樣品溶液。最后置于4 ℃的冰箱中保存。

3) 陰性對照品(空白輔料)溶液

按照2.3節(jié)方法制備缺少廣棗浸膏粉和肉豆蔻揮發(fā)油的空白輔料片劑。按“樣品溶液的制備”項下方法,同法制得陰性對照品(空白輔料)溶液

2.5.3 方法學驗證

1) 專屬性

分別吸取上述溶液,在上述色譜條件下進樣分析,記錄色譜圖(圖3)。結果表明各對照品各峰分離完全、對稱性較好,空白輔料溶液對所測定的4種成分無干擾,制劑中其他成分對4種藥效成分測定均無干擾。

1為原兒茶酸;2為槲皮素;3為甲基丁香酚;4為肉豆蔻醚圖3 高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram

2) 線性關系考察

分別精密吸取各對照品儲備液適量至容量瓶內(nèi),用甲醇稀釋制成系列標準溶液,于4 ℃保存?zhèn)溆谩０瓷鲜錾V條件進樣分析,以峰面積Y對進樣濃度X進行回歸方程計算。結果表明,各目標成分在各自范圍內(nèi)線性關系良好,結果見表6。

表6 各成分線性關系結果Table 6 Linear relationship results of each component

3) 儀器精密度試驗

精密吸取6次混合對照品溶液,按上述色譜條件進樣分析,記錄各成分峰面積并計算相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)。結果原兒茶酸、槲皮素、甲基丁香酚和肉豆蔻醚峰面積的RSD分別為1.8%、1.3%、1.8%和1.9%,實驗數(shù)據(jù)均小于2%,表明儀器精密度良好。

4) 重復性試驗

取20220520批次樣品,按“樣品溶液的制備”項下方法分別制備6份樣品溶液,按上述色譜條件分析,記錄各成分峰面積并計算樣品含量。結果原兒茶酸、槲皮素、甲基丁香酚和肉豆蔻醚的RSD分別為0.5%、1.9%、1.1%、1.2%。表明方法重復性良好。

5) 穩(wěn)定性試驗

取20220520批次樣品,按“樣品溶液的制備”項下方法制成一份樣品溶液,按上述色譜條件分別在室溫下0、2、4、8、12、24 h 進樣分析,記錄各成分峰面積并計算 RSD。結果原兒茶酸、槲皮素、甲基丁香酚和肉豆蔻醚的 RSD 分別為1.9%、1.9%、1.7%、1.9%。結果表明藥品溶液在配制后24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

6) 回收率試驗

取6批空白輔料溶液至25 mL容量瓶中,精密添加0.300 mg原兒茶酸、0.0185 mg槲皮素、0.250 mg甲基丁香酚和6.50 mg肉豆蔻醚的混合對照品溶液,添加甲醇稀釋并定容。制備成相當于樣品中各待測成分100%倍量的回收率供試品溶液。按上述色譜條件分析,測定含量計算各成分的回收率及RSD值,重復測定6組。結果見表7。

表7 目標成分回收率試驗結果(n=6)Table 7 Result of target component recovery test (n=6)

2.5.4 樣品含量測定

精密稱定3 批樣品各0.15 g,按“樣品溶液的制備”項下方法制備樣品溶液,按上述色譜條件進樣分析,記錄并按峰面積計算3批樣品中4種藥效成分的含量。結果見表8。

表8 樣品含量測定結果(n=3)Table 8 Sample content determination results(n=3)

3 討論

廣棗和肉豆蔻作為經(jīng)典蒙藥藥對,兩者都常見于蒙藥配方中[11],在《蒙藥標準1998》里收載了11個含有廣棗與肉豆蔻組合的配方;而在《蒙醫(yī)成方選》中也記載17個含有廣棗與肉豆蔻組合的處方,用于治療心血管類疾病,這表明兩藥配伍治療疾病的歷史悠久[12]。當前含有廣棗-肉豆蔻藥對的上市產(chǎn)品主要包括“三味檀香散、七味廣棗丸、肉豆蔻五味丸等,均為中藥生粉制劑,因此開發(fā)推出一款藥效成分含量更高、療效更為可靠的提純物制劑有助于填補保健品市場空白。

當前已有眾多研究表明廣棗醇提液和肉豆蔻揮發(fā)油為藥對中的主要藥效物質,具有抗氧化、治療心血管類疾病等眾多功效[13-14]。Wang等[15]系統(tǒng)比較了廣棗-肉豆蔻藥對、廣棗醇提液、肉豆蔻揮發(fā)油這三者對于氧化損傷的心肌細胞影響,利用MTT比色法檢測發(fā)現(xiàn)藥對組能顯著改善體外心肌細胞的氧化損傷,并明確廣棗醇提液為主要功效貢獻者。而廣棗醇提液中富含黃酮類和酚酸類成分,適用于以AB-8、HPD100等為代表的弱極性或無極性大孔樹脂[16]。故本產(chǎn)品采用AB-8吸附樹脂對廣棗醇提液進行富集純化進而減少整體服用量并增強藥效。肉豆蔻揮發(fā)油作為油性液體具有強烈香料味且極易揮發(fā)不穩(wěn)定,難以直接用于制備片劑,因此制備成β-環(huán)糊精包合物可有效克服上述問題。此外肉豆蔻醚作為肉豆蔻揮發(fā)油中含量占比最高的抗氧化藥效成分[17-18],通過測定發(fā)現(xiàn)本產(chǎn)品中肉豆蔻醚含量較高,這表明產(chǎn)品中含有肉豆蔻揮發(fā)油并包合成功。

4 結論

論述了產(chǎn)品廣棗-肉豆蔻片的制備過程并探討廣棗-肉豆蔻片的質量研究,經(jīng)外觀性狀、重量差異和崩解時限等各項考察,均符合《中國藥典》(2020年版)片劑項下要求。利用 HPLC 對制劑中的4種抗氧化成分槲皮素、原兒茶酸、甲基丁香酚和肉豆蔻醚進行含量測定,方法準確可靠,專屬性強,重復性良好,可為本產(chǎn)品質量標準的制訂提供參考。然而復方中藥制劑中物質眾多,部分藥效物質難以完整在圖譜上呈現(xiàn),因此還需要利用液相色譜-質譜和氣相色譜-質譜等分析技術進一步深入研究。綜上,通過將廣棗醇提液和肉豆蔻揮發(fā)油配伍制備成提純片,提高了廣棗有效成分在產(chǎn)品中的含量,探索了肉豆蔻揮發(fā)油在固體劑型的應用,有助于民族醫(yī)藥發(fā)展和中藥保健品開發(fā)。