舒美玲,吳 悅,葉映泉,張爽爽,張 梅

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一,致死率位居其中首位[1]。手術(shù)和以鉑或紫杉醇為基礎(chǔ)的化療是卵巢癌的初始治療[2]。但多數(shù)患者會發(fā)生化療耐藥出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移且后續(xù)治療效果不佳,這是導(dǎo)致卵巢癌病死率較高的主要原因之一。華蟾素(cinobufagin,CBG)是從中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍的干燥表皮和腺體分泌物中通過水提醇沉法提取出來的生物活性成分,目前廣泛應(yīng)用于抗惡性腫瘤治療,在肝癌、肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中均表現(xiàn)出顯著的抑癌效果[3]。已有研究[4]顯示CBG能抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲促進(jìn)其凋亡。但對于CBG能否逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞對順鉑(cisplatin,DDP )的耐藥性以及其機(jī)制研究的報道較少?，F(xiàn)利用CBG處理A2780/DDP細(xì)胞探討CBG對卵巢癌鉑耐藥的逆轉(zhuǎn)機(jī)制,以期為CBG治療卵巢癌提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人卵巢癌細(xì)胞株A2780和人卵巢癌細(xì)胞株順鉑耐藥株A2780/DDP購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物所;順鉑注射液(貨號:H2001074)購自江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司;CBG注射液(貨號:國藥準(zhǔn)字Z34020273)由安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司提供;PI3K/AKT-IN-2抑制劑(貨號:2684412-41-5)購自美國MCE公司;RIPA1640培養(yǎng)基(貨號:C11875500BT)和胎牛血清(貨號:A5670701)購自美國Gibco公司;ABW 基質(zhì)膠(貨號:0827045)購自上海諾娃醫(yī)藥科技有限公司;EdU試劑盒(貨號:C0071S)和Hoechst試劑盒(貨號:C0003)均購自碧云天生物技術(shù)有限公司;磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase, PI3K)(貨號:R27768)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT) 又名蛋白激酶B (protein kinase B, PKB)(貨號:R23412)、E鈣黏蛋白(貨 號:340341)、 N鈣黏蛋白(貨號:380671)抗體購自成都正能生物技術(shù)責(zé)任有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (貨號:Q111-02)和RT-qPCR 試劑盒(貨號:R222-01)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1人卵巢癌細(xì)胞株的培養(yǎng) A2780和A2780/DDP細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素和0.1%支原體清除劑的RIPA1640培養(yǎng)基中,置于含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。細(xì)胞密度達(dá)80%時進(jìn)行傳代。此外,A2780/DDP細(xì)胞在傳代貼壁后另給予1 μg/ml順鉑以維持耐藥性。

1.2.2CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力 分別取對數(shù)生長期A2780和A2780/DDP細(xì)胞,按照8×103個/孔的密度接種于96孔板,細(xì)胞貼壁后按實驗設(shè)計分別給藥: DDP(2.5、5、10、20、40、80、100、160 μmol/L),CBG(200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg/ml)于24、36、48 h后每孔加入CCK-8溶液10 μl,避光孵育1.5 h后讀取562 nm處光密度(optical density,OD)值。計算DDP對A2780和A2780/DDP細(xì)胞或CBG對A2780/DDP細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(median inhibitory concetration,IC50),并計算出A2780/DDP的耐藥指數(shù)(resistance index,RI)=IC50(A2780/DDP)/IC50(A2780) 。CBG(0、2、4、6 mg/ml)處理24 h后再加入梯度濃度DDP(2.5、5、10、20、40、80、100、160 μmol/L),24 h后加入CCK-8溶液10 μl,避光孵育1.5 h后讀取562 nm處OD值,計算CBG的逆轉(zhuǎn)指數(shù)(reversal fold,RF)=IC50(0 mg/ml )/IC50(2、4、6 mg/ml)CBG[5]。實驗獨立重復(fù) 3 次,設(shè)3個復(fù)孔。

1.2.3實驗分組 根據(jù)CBG的IC50值和逆轉(zhuǎn)耐藥指數(shù)設(shè)計實驗分組:對照組(12.5 μmol/L DDP)、低劑量組(12.5 μmol/L DDP+2 mg/ml CBG)、中劑量組(12.5 μmol/L DDP+4 mg/ml CBG)、高劑量組(12.5 μmol/L DDP+6 mg/ml CBG)、抑制劑組(12.5 μmol/L DDP+6 mg/ml CBG+6 μmol/L PI3K/AKT抑制劑)。

1.2.4平板克隆實驗評估細(xì)胞的克隆增殖能力 將A2780/DDP細(xì)胞按500個/孔的密度接種于6孔板中,待細(xì)胞貼壁生長后按分組更換含藥培養(yǎng)基。持續(xù)培養(yǎng)2周,期間每隔4 d換液。培養(yǎng)結(jié)束后,棄廢液,用PBS洗凈,每孔加入800 μl 4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞。40 min后吸棄多聚甲醛溶液,再每孔加入1 ml結(jié)晶紫染色,20 min后用PBS輕緩沖洗至6孔板無染料殘留,晾干后拍照。使用ImageJ軟件分析計算克隆形成率。每組設(shè)3個復(fù)孔,實驗重復(fù) 3 次。

1.2.5EdU和Hoechst法評估細(xì)胞的增殖和凋亡情況 將A2780/DDP細(xì)胞按1×104/孔接種于鋪有14 mm爬片的24孔板中,每孔含有500 μl完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞貼壁生長后,按分組配制工作液進(jìn)行換液。48 h后按照EdU試劑盒進(jìn)行細(xì)胞的固定和標(biāo)記。Hoechst實驗前期鋪板同EdU實驗,48 h后按照Hoechst試劑盒進(jìn)行細(xì)胞的固定和標(biāo)記。染色后在熒光顯微鏡下拍照。并采用ImageJ軟件統(tǒng)計增殖或凋亡細(xì)胞數(shù)量。每組設(shè)3 個復(fù)孔,實驗重復(fù)3 次。

1.2.6細(xì)胞劃痕實驗評估細(xì)胞水平遷移能力 將A2780/DDP細(xì)胞按6×105個/孔接種于6孔板,培養(yǎng)24 h后,用200 μl槍頭在細(xì)胞上劃“一”字劃痕,PBS洗滌3次,用無血清培養(yǎng)基配制各組培養(yǎng)液,進(jìn)行換液。在0、24、48 h的時間點分別拍照,ImageJ軟件分析24 h和48 h的劃痕寬度比,細(xì)胞遷移率=(初始劃痕面積-t時刻劃痕面積)/初始劃痕面積×100%。每組設(shè)3 個復(fù)孔,實驗重復(fù)3 次。

1.2.7Transwell法檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力 將A2780/DDP細(xì)胞懸浮于含2%血清的完全培養(yǎng)基中,按4×105個/孔接種于含100 μl不同工作液的Transwell小室。細(xì)胞貼壁后下室加入含10%血清培養(yǎng)液600 μl,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出小室,用甲醛固定30 min,結(jié)晶紫染色30 min,PBS洗2次,用棉簽輕輕擦拭小室內(nèi)部未穿膜過的細(xì)胞,室溫晾干。侵襲實驗前用基質(zhì)膠將Transwell小室濕化(不含血清的培養(yǎng)液以1 ∶8比例稀釋基質(zhì)膠,加80 μl/孔稀釋好的基質(zhì)膠在小室中,放培養(yǎng)箱中靜置32 h),其余步驟同前法。最后將小室底部用顯微鏡拍照,采用ImageJ軟件統(tǒng)計遷移細(xì)胞數(shù)量。每組設(shè)3 個復(fù)孔,實驗重復(fù)3 次。

1.2.8Western blot檢測PI3K/AKT信號通路和EMT相關(guān)蛋白的表達(dá) 在1.2.3項實驗分組基礎(chǔ)上增加A2780細(xì)胞組(12.5 μmol/L DDP),藥物處理48 h后收集各組細(xì)胞的總蛋白,加入上樣緩沖液,100 ℃、5 min煮沸變性后室溫冷卻,-20 ℃保存待用。根據(jù)所測蛋白分子量配制相應(yīng)濃度分離膠,加樣,電壓65 V 30 min后,轉(zhuǎn)150 V 60 min進(jìn)行電泳,恒壓200 mA 120 min轉(zhuǎn)印至NC膜上,5%脫脂牛奶封閉60 min后與一抗(母液 ∶一抗稀釋液=1 ∶1 000)孵育過夜,TBST洗膜3次,與二抗(母液 ∶二抗稀釋液=1 ∶10 000)室溫孵育60 min后,TBST洗膜3次,使用的增強型化學(xué)發(fā)光試劑顯影并拍照。ImageJ軟件分析相對蛋白含量,用各條帶灰度值/內(nèi)參條帶的灰度值表示,每組實驗重復(fù)3 次。

1.2.9RT-qPCR法檢測PI3K/AKT信號通路和EMT相關(guān)mRNA 的表達(dá) 使用總RNA提取試劑盒提取總RNA,采用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,參照SYBR-Green PCR試劑盒說明書進(jìn)行RT-qPCR實驗。引物序列見表1,GAPDH作為內(nèi)參,采用2-△△CT法分析目的基因在不同組別之間的表達(dá)差異,每組實驗重復(fù)3次。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 A2780/DDP細(xì)胞耐藥性的鑒定及CBG對A2780/DDP細(xì)胞耐藥性的影響如圖1A-1C所示,DDP作用于細(xì)胞24、36、48 h后,A2780/DDP的IC50值分別為68.89±0.269、62.743±1.071、52.433±0.176,A2780的IC50值為12.233±0.059、10.7±0.625、9.206±0.193,在DDP的各濃度作用下,A2780/DDP細(xì)胞的細(xì)胞活力明顯高于A2780細(xì)胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=16,P<0.05 ),RI值分別為5.636、5.864、5.695。如圖1D顯示:CBG作用于細(xì)胞24、36、48 h后,對A2780/DDP的IC50分別為32.337±1.374、22.48±0.501、9.681±0.101,根據(jù)CBG作用A2780/DDP細(xì)胞48 h的IC50值與24 h 或36 h的IC50值相比顯著降低(F=540.4,P<0.05),選擇48 h為后續(xù)實驗工作時間,并將CBG對A2780/DDP細(xì)胞作用48 h后的20%(2 mg/ml)、40%(4 mg/ml)、60%(6 mg/ml)的抑制濃度作為逆轉(zhuǎn)耐藥實驗的低、中、高劑量。圖1E顯示:處理48 h后,低、中、高劑量的CBG對A2780/DDP耐藥的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為1.617、2.570、3.461。

圖1 A2780/DDP對DDP的耐藥性分析以及CBG對其耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用(n=3)

2.2 CBG對A2780/DDP克隆形成能力的影響

A-C:DDP處理24、36、48 h后A2780和A2780/DDP細(xì)胞的活力曲線;D:CBG處理后不同時間點A2780/DDP細(xì)胞生長活力曲線;E:0、2、4、6 mg/ml CBG處理A2780/DDP細(xì)胞后DDP對細(xì)胞生長的活力曲線圖2顯示:與對照組的細(xì)胞克隆數(shù)目相比,CBG低劑量、中劑量、高劑量組的細(xì)胞克隆數(shù)目隨CBG藥物劑量增加而減少,其中抑制劑組的細(xì)胞克隆數(shù)目最少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=310.2,P<0.05)。

圖2 CBG抑制A2780/DDP細(xì)胞克隆形成能力(n=3)

2.3 CBG對A2780/DDP細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響劃痕實驗顯示(圖3A) :CBG處理24 h或48 h后,與對照組相比,低、中、高劑量組的CBG呈時間和濃度依賴性地抑制了細(xì)胞劃痕愈合率,其中抑制劑組的細(xì)胞劃痕愈合率最低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(24 h:F=105.9,P<0.01,48 h:F=59.2,P<0.01)。Transwell實驗顯示(圖3B):與對照組相比,各組細(xì)胞處理24 h后,遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目呈現(xiàn)濃度依賴性的減少,其中抑制劑組細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著降低,細(xì)胞數(shù)目最少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)。

圖3 CBG抑制A2780/DDP的遷移和侵襲能力(n=3)

2.4 CBG對A2780/DDP細(xì)胞的凋亡和增殖能力影響EdU染色實驗結(jié)果顯示:與對照組相比,隨著CBG濃度升高,耐藥細(xì)胞的增殖率隨之降低,其中抑制劑組的細(xì)胞增殖率最低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=190.4,P<0.01)。Hoechst染色實驗結(jié)果顯示:與對照組相比,耐藥細(xì)胞的凋亡率隨著CBG濃度增加而上升,其中抑制劑組的細(xì)胞凋亡率最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=389.6,P<0.01),見圖4。

圖4 CBG抑制A2780/DDP細(xì)胞增殖促進(jìn)其凋亡(n=3)

2.5 CBG對A2780/DDP細(xì)胞PI3K/AKT信號通路以及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示(圖5):與 A2780細(xì)胞相比,對照組(A2780/DDP)細(xì)胞的P-PI3K/PI3K(t=8.115,P<0.01)和P-AKT/AKT(t=17.62,P<0.01)的蛋白水平相對比值更高,而E-cadherin(t=4.620,P<0.01)的蛋白表達(dá)水平更低,同時N-cadherin(t=6.126,P<0.01)、Vimentin(t=4.001,P<0.01)、Snail(t=17.333,P<0.01)的蛋白表達(dá)水平更高。此外,CBG呈濃度依賴性地抑制PI3K、AKT的蛋白磷酸化,與對照組相比,P-PI3K(F=268.5,P<0.01)、P-AKT(F=190.5,P<0.01)、N-cadherin(F=24.02,P<0.000 1)、Vimentin(F=57.65,P<0.01)、Snail(F=87.24,P<0.01)的蛋白表達(dá)量減少,其中抑制劑組上述蛋白的表達(dá)量最少。但在各濃度組CBG處理后A2780/DDP細(xì)胞中的E-cadherin 蛋白表達(dá)水平明顯升高,在抑制劑組中表達(dá)量最多(F=135.8,P<0.000 1)。

圖5 卵巢癌A2780/DDP細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路蛋白和EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平的影響(n=3)

2.6 CBG對A2780/DDP細(xì)胞PI3K/AKT信號通路以及EMT相關(guān)mRNA表達(dá)的影響RT-qPCR實驗結(jié)果顯示(圖6):CBG呈濃度依賴性地降低PI3K(F=101.1,P<0.01)、AKT(F=558.3,P<0.01)、N-cadherin(F=86.97,P<0.01)、Vimentin(F=105.9,P<0.01)、Snail(F=85.71,P<0.01),增加E-cadherin(F=80.96,P<0.01)的mRNA表達(dá),其中抑制劑組的PI3K、AKT、N-cadherin、Vimentin、Snail的mRNA表達(dá)量最少,E-cadherin的表達(dá)水平最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖6 A2780/DDP細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路和EMT相關(guān)mRNA的表達(dá)水平的影響(n=3)

3 討論

CBG能抑制PI3K/AKT通路或EMT發(fā)揮抗腫瘤作用,Li et al[6]的研究表明CBG可顯著上調(diào)HepG2、SMMC-7721和SNU-368細(xì)胞中的E-cadherin并下調(diào)N-cadherin、Snail、slug和ZEB1的表達(dá)水平,從而抑制HepG2荷瘤小鼠的肺轉(zhuǎn)移。CBG不僅具有直接抗腫瘤增殖侵襲的作用,還能逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性,在聯(lián)合放療、化療治療過程中發(fā)揮增敏作用[7]。Liu et al[8]報道了 CBG能抑制鼻咽癌中的 MYH9/GSK3β/β-連環(huán)蛋白及下游的腫瘤干細(xì)胞特性和 EMT信號,從而顯著抑制 EBV-miR-BART22 誘導(dǎo)的DDP耐藥性。Su et al[9]研究了CBG的有效成分蟾毒靈對卵巢癌耐藥的作用,結(jié)果顯示蟾毒靈能下調(diào)卵巢癌耐藥細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá),在體內(nèi)抑制卵巢癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲,從而提高卵巢癌患者對DDP敏感性。此外,臨床基礎(chǔ)研究證實,CBG進(jìn)入人體代謝活動,活化后對人體內(nèi)存在的癌細(xì)胞具有很強的直接殺傷能力,目前CBG廣泛應(yīng)用于多種腫瘤疾病的輔助或聯(lián)合用藥治療,并取得較好的臨床治療效果。林梅英 等[10]的meta分析結(jié)果顯示CBG注射液聯(lián)合療法能提高中晚期非小細(xì)胞肺癌患者近期療效和生存率、改善生活質(zhì)量、緩解疼痛、降低不良反應(yīng)。另一項來自袁福建 等[11]的研究顯示CBG能夠提高肝癌介入治療效果,改善患者的免疫功能、肝功能儲備和生存情況。

PI3K/AKT信號的過度激活與化療耐藥性和癌癥轉(zhuǎn)移密切相關(guān),抑制PI3K/AKT信號可恢復(fù)卵巢癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性[12-13],故抑制PI3K/AKT通路的藥物可能成為卵巢癌耐藥的逆轉(zhuǎn)劑。通過PI3K/AKT信號通路能調(diào)控下游EMT,而EMT的發(fā)生在卵巢癌耐藥過程中起到了重要的作用。Zhao et al[14]研究發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長因子受體3可促進(jìn)表皮生長因子受體磷酸化并激活PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo),從而減少細(xì)胞凋亡并促進(jìn)EMT過程,進(jìn)而導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性。

本研究顯示CBG處理后能恢復(fù)A2780/DDP細(xì)胞的順鉑敏感性,降低RI,呈濃度依賴性地抑制耐藥細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力,促進(jìn)其凋亡。平板克隆、Transwell、EdU實驗結(jié)果顯示CBG聯(lián)合PI3K/AKT抑制劑對耐藥細(xì)胞的抑制作用明顯優(yōu)于單獨使用CBG組(P<0.05)。Western blot和RT-qPCR實驗結(jié)果表明相比于親本株,A2780/DDP細(xì)胞中的PI3K/AKT信號通路和EMT相關(guān)蛋白以及mRNA的表達(dá)水平更高(P<0.05),提示A2780/DDP細(xì)胞中存在PI3K/AKT信號的過度激活和EMT的發(fā)生,通過抑制PI3K/AKT信號可降低A2780/DDP細(xì)胞的抗藥性。此外,與對照組相比,不同濃度 CBG處理組細(xì)胞中的P-PI3K/PI3K及P-AKT/AKT的蛋白表達(dá)比值、N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白和mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)隨著藥物濃度升高而下降的趨勢,相反E-cadherin表達(dá)量隨CBG濃度升高而增加(P<0.05),表明CBG能下調(diào)PI3K/AKT信號通路和抑制EMT過程。抑制EMT和PI3K/AKT信號通路的激活是逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥的兩個重要作用靶點,而CBG能抑制EMT和PI3K/AKT信號通路,有望成為卵巢癌鉑耐藥的有效逆轉(zhuǎn)劑。

綜上所述,CBG能誘導(dǎo)人卵巢癌A2780/DDP耐藥細(xì)胞的凋亡,減弱其增殖、遷移和侵襲能力,其潛在的機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/AKT信號通路和抑制 EMT過程有關(guān)。本研究有助于闡明CBG作為卵巢癌鉑耐藥逆轉(zhuǎn)藥物的可行性,同時為CBG逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑耐藥提供理論依據(jù),以期為卵巢癌臨床治療方案提供新的思路。