宋羽佳,汪 晨,王恩秀,汪 波

霍奇金淋巴瘤主要來源于B細胞譜系,包括兩種亞型,經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤和結(jié)節(jié)性淋巴細胞為主的霍奇金淋巴瘤?；羝娼鹆馨土鍪且环N罕見的淋巴瘤,經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤占所有霍奇金淋巴瘤病例的近95%[1]?；羝娼鹆馨土鼍哂须p峰年齡分布,峰值分別在20～30歲和50～70歲,偶爾會發(fā)生在≥75歲的患者中[2]。靶向CD30的抗體偶聯(lián)藥物本妥昔單抗治療霍奇金淋巴瘤的客觀緩解率能達到75%,完全緩解率為34%[3]。然而,抗體療法受限于體內(nèi)分布,臨床獲益是短暫的,因此必須探索其他方法。過繼性細胞療法是治療癌癥的一種策略,近年來展示出極大的應(yīng)用前景[4-5]。對于霍奇金淋巴瘤,CD30是作為CAR-T細胞治療靶點的極好候選者,因為其在霍奇金淋巴瘤腫瘤細胞上的豐富和特異性表達,但在正常組織上的表達有限[6-8]。因此,該研究基于DAP12的多鏈嵌合抗原受體開發(fā)靶向CD30 CAR-T,研究CD30 CAR-T對霍奇金淋巴瘤腫瘤細胞的體外和體內(nèi)臨床前藥效。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞及質(zhì)粒 HEK-293T細胞購自美國細胞培養(yǎng)物收藏中心,由南京卡提醫(yī)學科技有限公司保存。L428人霍奇金淋巴瘤細胞保存于南京卡提醫(yī)學科技有限公司。T細胞來源于健康志愿者外周血。慢病毒表達載體包裝質(zhì)粒 pMDLg/PRRE、pRSV-Rev、pMD2.G購自湖南豐暉生物科技有限公司。JM109感受態(tài)細胞購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.1.2主要試劑 T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶購自NEB(北京)有限公司,中提質(zhì)粒抽提試劑盒購自南京諾維贊生物科技有限公司,PEI轉(zhuǎn)染試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,Ficoll分離液購自 GE公司;T細胞分選試劑盒(EasySepTMHuman T Cell Isolation Kit)購自STEMCELL Technologies;T細胞激活試劑(CD3/CD28 Dynabeads)、Optmizer培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自Gibco公司,X-VIVO 15培養(yǎng)基購自LONZA公司;人白介素-2(interleukin-2,IL-2)和干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)細胞因子檢測試劑盒購自R&DSystems公司,無血清細胞凍存液CS10購自BioLife公司。抗人CD3抗體(FITC)、抗人CD3抗體(APC-Cy7)、鏈霉親和素(PE)、鏈霉親和素(APC)和抗人CD30 antibody(APC)均購自BD公司;Biotinylated Human CD30蛋白購自 Acro Biosystems公司。

1.2 實驗方法

1.2.1腫瘤細胞培養(yǎng) L428細胞為人經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤細胞,用含有滅活的10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔2～3 d待細胞長滿后分瓶傳代,將處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞用于體內(nèi)腫瘤的接種。

1.2.2CAR慢病毒表達載體構(gòu)建及包裝 CD30 scFv委托上海生工生物工程有限公司合成含有CD30 scFv的DNA片段。CD30 scFv基因序列通過雙酶切將CD30 scFv片段插入CAR慢病毒骨架載體(KIRS2/DAP12-BB和BBζ)中構(gòu)建CD30-KIRS2/Dap12-BB 和CD30-41BBζ慢病毒表達載體,選取篩選得到的陽性克隆細菌進行搖菌并且抽提質(zhì)粒小提。質(zhì)粒送上海生工進行測序。選擇測序結(jié)果正確的克隆進行搖菌,用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒。采用第三代慢病毒包裝系統(tǒng)進行病毒包裝:將293T細胞培養(yǎng)于T150 培養(yǎng)瓶中,5%CO2、37 ℃培養(yǎng),每48 h進行換液傳代及規(guī)模放大,最終放大至8個T150方瓶。待匯合度達到 80%～90%時進行轉(zhuǎn)染;將CAR質(zhì)粒和3個包裝質(zhì)粒,通過PEI轉(zhuǎn)染,每個T150瓶需要添加10.9 μg pMDLg/PRRE、5.5 μg pRSV-Rev、5.5 μg pMD2.G、21.8 μg CAR質(zhì)粒。PEI轉(zhuǎn)染6 h換液,24 h第一次收集慢病毒懸液保存至4 ℃冰箱,48 h第2次收集慢病毒懸液,與第1次收集到的慢病毒懸液合并,用0.45 μm 的濾膜過濾去除細胞碎片,4 ℃、12 000～24 000 r/min離心過夜,離心后,傾倒全部上清液,每管加入 200 μl X-vivo15培養(yǎng)基重懸,進行病毒分裝,迅速存放于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3CAR-T細胞的制備和鑒定 通過淋巴細胞分離液提取外周血單個核細胞,磁珠分選CD3+T細胞。加入完全培養(yǎng)基(optmizer培養(yǎng)基+10%人AB血清+100 IU/ml IL-2+2 mmol/L Glutamax+Supplement)重懸,按數(shù)量比3 ∶1加入CD3/CD28刺激磁珠。24 h后,取所需量的T細胞,以感染復(fù)數(shù)MOI=3將T細胞與慢病毒混合鋪入合適的培養(yǎng)容器中,未轉(zhuǎn)導(dǎo)(not transduced,NTD)組不加入慢病毒,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。每隔1～2 d傳代補液一次,培養(yǎng)至細胞處于靜息狀態(tài),去除CD3/CD28磁珠后,將細胞凍存于液氮中,用于后續(xù)細胞功能分析。制備的 CAR-T 細胞分別命名CD30-KIRS2/Dap12-BB組和CD30-41BBζ組,未做病毒侵染的T細胞命名為NTD組。

1.2.4CAR-T 細胞體外殺傷能力的檢測 用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)L428,收集細胞,1×104細胞/孔接種于96孔板中,按照效靶比(E ∶T)為0 ∶1、1 ∶1、5 ∶1、10 ∶1將CAR-T細胞加入到靶細胞中,以NTD作為陰性對照,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h,根據(jù)乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測CAR-T細胞對靶細胞殺傷作用。

1.2.5CAR-T細胞因子分泌試驗 靶細胞培養(yǎng):L428用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng),37 ℃、5% CO2進行培養(yǎng)。細胞因子釋放試驗在96孔板上通過共培養(yǎng)靶細胞與CAR-T共培養(yǎng)進行,E ∶T為2 ∶1,靶細胞接種1×104細胞/孔,共培養(yǎng)培養(yǎng)基為200 μl 含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基。共培養(yǎng)24 h后,參考IFN-γ的ELISA試劑盒說明書,檢測上清液中IFN-γ含量。

1.2.6實驗動物及倫理 實驗所用動物的種屬為 Mus Musculus,品系為 NCG,6～8周齡,性別為雌性。動物級別為 SPF級,體質(zhì)量18～22 g,由江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供。動物試驗設(shè)計和實施符合赫爾辛基宣言、醫(yī)學倫理道德標準及我國的法律法規(guī),并得到中山大學附屬第七醫(yī)院實驗動物倫理委員會的批準。許可證號:SCXK(蘇)2023-0009。

1.2.7腫瘤細胞的接種、分組及給藥方案 將PBS重懸的L428腫瘤細胞接種于小鼠右側(cè)脅肋部皮下,5×105細胞/只,在腫瘤細胞注射接種20 d后,根據(jù)荷瘤小鼠腫瘤體積將其隨機分為3組(NTD組、CD30-KIRS2/Dap12-BB組和CD30-41BBζ組)進行治療(當天記為分組后0 d, D0),給藥途徑采用尾靜脈給藥,每組5只。

2 結(jié)果

2.1 CAR表達質(zhì)粒構(gòu)建及驗證通過上海生工生物工程有限公司全基因合成CD30 scFv,在實驗室現(xiàn)有載體pWC032和pKT004的基礎(chǔ)上,通過酶切連接的方法,分別構(gòu)建CD30-KIRS2/Dap12-BB CAR質(zhì)粒和CD30-BBζ CAR質(zhì)粒,對CAR質(zhì)粒進行雙酶切鑒定,CD30-KIRS2/Dap12-BB CAR質(zhì)粒條帶約為756 bp和8 583 bp,CD30-41BBζ CAR質(zhì)粒條帶約為756 bp和8 449 bp。載體示意圖及酶切鑒定結(jié)果如圖1所示,兩個CAR質(zhì)粒條帶大小均正確。

圖1 CAR質(zhì)粒酶切電泳圖

2.2 CAR慢病毒及CAR-T 細胞制備將CAR表達質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒用PEI轉(zhuǎn)染 293T 細胞進行慢病毒包裝,經(jīng)超速離心濃縮后,CD30-KIRS2/Dap12-BB CAR慢病毒和CD30-41BBζ CAR慢病毒滴度分別為 2.7×107TU/ml 和 4.6×107TU/ml。T 細胞激活 24 h后,以 MOI=3加入慢病毒進行感染,在細胞收獲凍存時檢測CAR陽性率,兩種CD30 CAR結(jié)構(gòu)示意圖見圖2A,結(jié)果表明兩種CD30 CAR-T細胞均能較好表達CAR分子,CAR表達都在50%以上(圖2B)。

圖2 CAR結(jié)構(gòu)設(shè)計及表達

2.3 基于多鏈結(jié)構(gòu)的CD30 CAR-T細胞體外功能測試為了檢測CD30 CAR-T細胞的殺傷活性,本研究采用L428作為抗原陽性的靶細胞,流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明L428高表達CD30抗原(圖3A)。

圖3 腫瘤細胞抗原表達及靶向CD30 CAR-T體外功能分析

細胞殺傷實驗結(jié)果表明兩種CD30 CAR-T細胞對靶細胞均有顯著的殺傷作用,其中CD30-KIRS2/Dap12-BB組殺傷作用優(yōu)于CD30-41BBζ組(圖3B)。NTD組沒有展現(xiàn)出特異性殺傷作用,表明兩種CD30 CAR-T是依賴CD30抗原的特異性殺傷作用,CD30-KIRS2/Dap12-BB組抗腫瘤效果更好。

CAR-T與靶細胞共培養(yǎng)的細胞因子分泌實驗結(jié)果表明,CD30-KIRS2/Dap12-BB組分泌IFN-γ能力最強,CD30-41BBζ組分泌IFN-γ能力稍弱于CD30-KIRS2/Dap12-BB組,兩種CD30 CAR-T與抗原陽性腫瘤細胞共培養(yǎng)均能產(chǎn)生顯著的響應(yīng)作用(圖3C)。

2.4 基于多鏈結(jié)構(gòu)的CD30 CAR-T細胞體內(nèi)抗腫瘤作用為了研究CD30-KIRS2/Dap12-BB CAR-T的體內(nèi)抗腫瘤活性,本研究用L428細胞建立了NCG小鼠皮下移植瘤模型。20 d后,待腫瘤體積大小達到50 mm3時,將荷瘤小鼠隨機分為3組,并且尾靜脈注射細胞進行治療。結(jié)果表明,CD30-KIRS2/Dap12-BB組和CD30-41BBζ組可以迅速實現(xiàn)腫瘤消退,而NTD組沒有產(chǎn)生腫瘤抑制作用。結(jié)果表明CD30-KIRS2/Dap12-BB抗腫瘤效果更持久,具備強大的靶向CD30的抗腫瘤活性(圖4)。

圖4 小鼠腫瘤體積變化情況(n=5)

3 討論

霍奇金淋巴瘤是一種影響跨越兒童和成人人群的惡性淋巴瘤。雖然大多數(shù)霍奇金淋巴瘤患者通過一線治療治愈,但約15%的患者要么是原發(fā)難治性疾病,要么是在最初治療有反應(yīng)后復(fù)發(fā)[9]。CAR-T細胞是治療復(fù)發(fā)或難治性血液系統(tǒng)惡性腫瘤(包括淋巴瘤)的一種具有前景的新療法[10-12]。CD30是一個高特異性的靶點,因為它在幾乎所有的經(jīng)典霍奇金淋巴瘤、間變性大細胞淋巴瘤以及其他部分淋巴瘤類型(包括皮膚T細胞淋巴瘤和彌漫性大B細胞淋巴瘤)中普遍表達[13]。傳統(tǒng)的CAR結(jié)構(gòu)體系普遍采用的是單鏈嵌合分子結(jié)構(gòu)的設(shè)計,主要結(jié)構(gòu)包括抗原結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和細胞內(nèi)信號區(qū)[14],然而在生理狀態(tài)下細胞的免疫受體通常是以多鏈復(fù)合物的結(jié)構(gòu)存在,例如包括配體結(jié)合鏈和免疫酪氨酸活化序列[15]。

本項目組根據(jù)免疫受體的這一生理特性設(shè)計了獨特的多鏈CAR結(jié)構(gòu)體系,以殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)和DAP12為基礎(chǔ)的多鏈體系。該CAR結(jié)構(gòu)優(yōu)點在于允許所有相關(guān)信號結(jié)構(gòu)域位于細胞膜附近[16]。從研究結(jié)果可以看出,CD30-KIRS2/Dap12-BB CAR-T細胞與CD30-41BBζ組對L428細胞體外殺瘤效應(yīng)相當。ELISA法檢測IFN-γ分泌水平結(jié)果顯示,在L428腫瘤細胞刺激下CD30-KIRS2/Dap12-BB組較CD30-41BBζ組IFN-γ分泌水平顯著提高。分別將兩種CD30 CAR-T治療NCG小鼠皮下移植瘤模型,結(jié)果顯示CD30-KIRS2/Dap12-BB組能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤完全消退且100 d內(nèi)腫瘤沒有復(fù)發(fā)。結(jié)果表明CD30-KIRS2/Dap12-BB組抗腫瘤效果更持久,具備強大的靶向CD30的抗腫瘤活性。

本研究從體外殺傷、細胞因子分泌以及體內(nèi)藥效等多個方面證明了多鏈CAR-T在抗腫瘤藥效活性方面優(yōu)于傳統(tǒng)二代CAR-T。盡管如此,CAR-T的臨床治療在開發(fā)高效抗腫瘤候選藥物的同時需要考慮到臨床的安全性,高抗腫瘤活性可能帶來更大的臨床毒副作用(如細胞因子釋放綜合征等),多鏈CAR-T雖然在臨床前藥效評估中具有一定的優(yōu)勢,但細胞因子分泌水平更高可能會給臨床的副作用處理帶來更大的挑戰(zhàn)。