屈柳芳,黃夢(mèng)雪,曹世國(guó),陳 剛,許建明,張衛(wèi)平

抗結(jié)核藥是導(dǎo)致藥物性肝損傷的常見藥物,膽汁淤積適應(yīng)性反應(yīng)是藥物性肝損傷領(lǐng)域中的重要研究方向。過(guò)氧化物還原酶-6(peroxiredoxin-6, PR-DX6)具有過(guò)氧化物酶活性和磷脂酶A2酶活性,通過(guò)減少H2O2和各種脂質(zhì)過(guò)氧化物來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[1]。此外,PRDX6 是PRDX家族中唯一在其基因啟動(dòng)子中具有轉(zhuǎn)錄因子核因子E2相關(guān)因子2 (nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2)結(jié)合位點(diǎn)的成員[2],而Nrf2介導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)在藥物性肝損傷的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要的保護(hù)作用。有研究[3]表明利福平(rifampicin, RFP)可誘導(dǎo)膽鹽輸出泵(bile salt export pump,BSEP)、多藥耐藥蛋白1(multidrug resistant protein 1,MDR1)、多藥耐藥相關(guān)蛋白2(multidrug resistance-related protein 2,MRP2)、鈉離子-?；悄懰徕c共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(Na+/taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2 (organic anion transporting protein 2,OATP2)、有機(jī)溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體(organic solute transporter β,OSTβ)和Nrf2的蛋白和基因表達(dá)適應(yīng)性增加,從而減輕HepG2細(xì)胞損傷。此外,PRDX6磷脂酶A2活性與Nrf2之間的關(guān)系已在多項(xiàng)研究中得到證實(shí)[4-5]。因此,在膽汁淤積時(shí),PRDX6是否參與膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體適應(yīng)性表達(dá)的調(diào)節(jié)還需進(jìn)一步研究。該研究通過(guò)敲低HepG2細(xì)胞的PRDX6基因,觀察敲低 PRDX6后對(duì)RFP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷及膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料HepG2細(xì)胞購(gòu)自中科院上海分院細(xì)胞庫(kù);PRDX6-siRNA購(gòu)自上海吉瑪制藥公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自以色列BI生物公司;胰酶細(xì)胞消化液、雙抗(青鏈霉素混合液) 購(gòu)自上海碧云天生物公司;PVDF 膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;ECL顯影液購(gòu)自蘇州新賽美生物公司;蛋白 Marker、TRIzol 購(gòu)自美國(guó)Thermo scientific公司;PRDX6、MRP4購(gòu)自美國(guó)CST公司;MRP3、NTCP購(gòu)自美國(guó)Immunoway公司;MDR1購(gòu)自武漢 Proteintech公司;MRP2購(gòu)自美國(guó)Novus抗體公司;β-肌動(dòng)蛋白(β-actin) 抗體及二抗(山羊抗小鼠、山羊抗兔)購(gòu)自北京中杉金橋生物公司;PCR逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物均購(gòu)自上海生物工程有限公司;RFP、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)、總膽紅素(total bilirubin,TBIL) 、直接膽紅素(direct bilirubin, DBIL) 、總膽汁酸(total bile acid,TBA) 試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所;CCK-8試劑盒購(gòu)自安徽白鯊生物技術(shù)有限公司;Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海貝博生物公司;流式細(xì)胞儀(CytoFLEX)購(gòu)于美國(guó)貝克曼公司;酶標(biāo)儀(型號(hào):MQX200)購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞分組及培養(yǎng) 使用特異PRDX6-siRNA和control-siRNA分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞構(gòu)建敲減細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞株,再根據(jù)是否加RFP刺激,將實(shí)驗(yàn)分為5組:空白對(duì)照組、陰性對(duì)照control-siRNA+DMSO 組、control-siRNA+RFP組、PRDX6-siRNA+DMSO組、PRDX6-siRNA+RFP組。HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞放置在37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每12 h換液1次,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以每孔2.0×105個(gè)細(xì)胞的密度均勻接種在6孔板上,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到50%～60%時(shí),按照Lipofectamine2000試劑說(shuō)明書進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染采用不含血清及雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)6～8 h后更換為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR) 收集各組細(xì)胞,用TRIzol 提取各組細(xì)胞中的總 RNA,分光光度儀檢測(cè)RNA濃度及純度,根據(jù)TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將 RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA,逆轉(zhuǎn)錄條件:37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s 、4 ℃。按照PCR擴(kuò)增試劑說(shuō)明書配好反應(yīng)體系,反應(yīng)條件: 95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,計(jì)算各組PRDX6、MRP2、MRP3、MRP4、MDR1、NTCP的相對(duì)表達(dá)量。所用qRT-PCR引物序列見表 1。

1.2.4蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot) 收集6孔板中各組細(xì)胞樣本,加入混有2%蛋白酶抑制劑、2%磷酸酶抑制劑、1%PMSF的 RIPA 裂解液裂解細(xì)胞,將其置于冰上,搖床40 min,于4℃、14 000 r/min離心10 min,收集上清液。加入上樣buffer后99 ℃煮10 min,于SDS-PAGE凝膠電泳分離總蛋白,再轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,再分別加入PRDX6(1 ∶5 000) 、MRP2 (1 ∶500) 、MRP3(1 ∶1 500) 、MRP4 (1 ∶1 000) 、MDR1 (1 ∶1 000) 、NTCP (1 ∶1 500)一抗抗體,4 ℃孵育過(guò)夜,用 TBST 洗膜3次,10 min /次,洗膜后分別加入二抗(1 ∶5 000),于室溫孵育1 h, 再次TBST 洗膜3次,10 min /次,將ECL 顯影液均勻滴于PVDF膜上蛋白的位置進(jìn)行顯影,Image J 圖像軟件分析各目的蛋白的表達(dá)水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以每孔2.0×105個(gè)細(xì)胞的密度均勻接種在 6孔板上,轉(zhuǎn)染24 h后給予100 μmol/L RFP誘導(dǎo)24 h。用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞沉淀, 預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次,800 r/min離心5 min,棄掉上清液,加入400 μl Annexin結(jié)合液重懸細(xì)胞,再加入5 μl Annexin V-FITC染色液和5 μl PI混勻后在避光條件下孵育15 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 按照前述的分組,將已轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞及未處理的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按每1×104個(gè)細(xì)胞的密度均勻接種于96孔板中,邊緣孔用無(wú)菌 PBS 填充。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到60%～70%時(shí),給予100 μmol/L RFP誘導(dǎo)24 h 后每孔分別加入 10 μl CCK-8試劑和90 μl DMEM純培養(yǎng)基,于 37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育1～2 h后置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)450 nm處吸光度值(OD450 nm),各孔的OD450 nm值代表每孔的增殖活性,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞損傷標(biāo)志物的含量 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液1 ml,檢測(cè)各組細(xì)胞損傷標(biāo)志物水平變化,如ALT、AST、TBIL、DBIL、TBA。根據(jù)檢測(cè)試劑盒的操作說(shuō)明,設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)孔、樣品孔、對(duì)照孔和空白孔,按要求加入一定量的樣本和試劑,輕輕敲擊96孔板使之混勻,于37 ℃ 培養(yǎng)箱中避光孵育一定時(shí)間,按照各自所要求的檢測(cè)波長(zhǎng),用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值,根據(jù)計(jì)算公式或者標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各組細(xì)胞損傷標(biāo)志物的相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1 RFP對(duì)PRDX6表達(dá)的影響及PRDX6基因敲低驗(yàn)證為了解RFP誘導(dǎo)的肝損傷如何影響PRDX6的表達(dá),給予100 μmol/L RFP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24 h,與control-siRNA+DMSO組比較,control-siRNA+RFP組PRDX6的蛋白(F=71.21,P<0.001)及基因(F=89.13,P<0.001)表達(dá)水平均上升,結(jié)果表明RFP可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞PRDX6蛋白及基因表達(dá)上調(diào)。使用特異PRDX6-siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞敲低PRDX6基因,并通過(guò)Western blot 和 qRT-PCR檢測(cè)敲低效率,結(jié)果顯示,與control-siRNA+DMSO組比較,PRDX6-siRNA+DMSO組PRDX6的基因表達(dá)水平降低約80%(F=89.13,P<0.001),蛋白表達(dá)量降低約50%(F=71.21,P<0.01),提示HepG2細(xì)胞中的PRDX6基因敲低成功。見圖1。

2.2 敲低PRDX6后對(duì)RFP誘導(dǎo)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的影響與control-siRNA+DMSO組比較,control-siRNA+RFP組MRP2(F=86.87,P<0.05)、MRP3(F=44.32,P<0.05)、MRP4(F=55.51,P<0.05)、MDR1(F=86.88,P<0.05)、NTCP(F=19.47,P<0.05)基因表達(dá)水平均有不同程度的升高,見圖2C;MRP2(F=93.07,P<0.05)、MRP3(F=45.52,P<0.05)、MRP4(F=106.8,P<0.05)、MDR1(F=26.77,P<0.05)、NTCP(F=169.1,P<0.05)的蛋白表達(dá)量也有不同程度的升高,見圖2A、2B。敲低PRDX6并給予100 μmol/L RFP 誘導(dǎo)24 h后,與control-siRNA+RFP組相比,PRDX6-siRNA+RFP組MRP2(F=86.87,P<0.05)、MRP3(F=44.32,P<0.05)、MRP4(F=55.51,P<0.05)、MDR1(F=86.88,P<0.05)、NTCP(F=19.47,P<0.05)的基因表達(dá)水平均有不同程度的降低,并且MRP2(F=93.07,P<0.05)、MRP3(F=45.52,P<0.05)、MRP4(F=106.8,P<0.05)、MDR1(F=26.77,P<0.05)、NTCP(F=169.1,P<0.05)的蛋白表達(dá)水平也有不同程度的降低,見圖2。表明PRDX6在RFP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞損傷中可適應(yīng)性上調(diào)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)水平。

圖2 敲低PRDX6對(duì)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的影響

2.3 敲低PRDX6對(duì)RFP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷的影響Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示:與control-siRNA+RFP組比較,PRDX6-siRNA+RFP組的凋亡率上升 (F=125.7,P<0.05),見圖3A;CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:PRDX6-siRNA+RFP組的OD值較control-siRNA+RFP組的OD值低(F=30.51,P<0.01),HepG2細(xì)胞的增殖能力減弱,見圖3B;細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)結(jié)果顯示:與control-siRNA+RFP組上清液標(biāo)志物ALT、AST、TBIL、DBIL、TBA比較,PRDX6-siRNA+RFP組細(xì)胞培養(yǎng)上清液損傷標(biāo)志物ALT(F=307.3,P<0.001)、AST(F=278.2,P<0.001)、TBIL(F=155.5,P<0.01)、DBIL(F=671.8,P<0.05)、TBA(F=64.45,P<0.001)的水平均較高,見圖3C-3G。這些結(jié)果表明敲低PRDX6后,RFP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重。

圖3 PRDX6敲低后對(duì)HepG2細(xì)胞損傷的影響

3 討論

肝毒性是一線抗結(jié)核藥物的重要副作用之一,而抗結(jié)核藥所致藥物性肝損傷的確切機(jī)制尚不清楚。研究[6-8]表明肝臟在發(fā)生膽汁淤積時(shí)通過(guò)增加肝細(xì)胞基底外側(cè)膽汁酸排泄和減少基底外側(cè)膽汁酸攝取被認(rèn)為是膽汁淤積的適應(yīng)性反應(yīng)。有研究[9]表明PRDX6是Nrf2通路的抗氧化基因下游分子,在調(diào)節(jié)活性氧穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用, 輕至中等強(qiáng)度的氧化應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)Nrf2和Nrf2-prdx6介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)的激活。此外,其他研究[10]顯示丹參酮Ⅱa通過(guò)激活Nrf2調(diào)控BSEP/NTCP表達(dá)而預(yù)防RFP誘導(dǎo)的肝損傷。本研究在體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,RFP可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中MRP2、MRP3、MRP4、MDR1、NTCP蛋白及基因表達(dá)水平升高,通過(guò)上調(diào)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)水平,減輕RFP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷,這一結(jié)果與先前的研究[3,11]結(jié)果一致。HepG2細(xì)胞敲低PRDX6基因后,MRP2、MRP3、MRP4、MDR1、NTCP的表達(dá)水平較未敲低組下降,細(xì)胞損傷明顯加重。這表明PRDX6可能在RFP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞損傷中參與膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的調(diào)控,并在膽汁淤積中發(fā)揮適應(yīng)性保護(hù)作用。推測(cè)RFP誘導(dǎo)機(jī)體應(yīng)激時(shí),通過(guò)上調(diào)保護(hù)性分子Nrf2的表達(dá),增加PRDX6的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而增加膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá),恢復(fù)膽汁酸代謝的穩(wěn)態(tài),促進(jìn)肝臟對(duì)損傷的適應(yīng)。

PRDX6是廣泛存在的過(guò)氧化物酶家族中的特殊一員,參與細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制由多種因素引起的細(xì)胞凋亡。有研究[12]表明PRDX6在缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激刺激時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體中,發(fā)揮對(duì)抗肝細(xì)胞損傷的作用。此外,López-Grueso et al[13]在研究中發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞的PRDX6基因缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的線粒體功能和完整性喪失,活性氧增加,細(xì)胞數(shù)量和增殖減少。本研究結(jié)果顯示敲低PRDX6基因后,HepG2細(xì)胞的凋亡率升高,增殖能力降低。這可能與PRDX6有抗凋亡及抗氧化應(yīng)激的作用有關(guān)。

本研究表明,在RFP的作用下,肝細(xì)胞損傷標(biāo)志物(ALT、AST、TBIL、DBIL、TBA) 的水平升高,在臨床上這些指標(biāo)是反映肝功能狀態(tài)的重要指標(biāo)。敲低PRDX6基因后,這些損傷標(biāo)志物進(jìn)一步升高。綜合以上結(jié)果,表明PRDX6在RFP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)中發(fā)揮保護(hù)作用。本研究將有助于更進(jìn)一步認(rèn)識(shí)RFP誘導(dǎo)膽汁淤積適應(yīng)現(xiàn)象的分子機(jī)制,為臨床實(shí)踐提供參考。