鄧啟磊, 符 姣,李 楠,何萌萌,黃大可,張 培

腹膜透析作為終末期腎病患者的一種治療方式,其使用在全球范圍內(nèi)正在增加[1]。腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化是腹膜透析最常見的并發(fā)癥之一。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子 (signal transducer and activator of transcription 3,STAT3) 參與多種生物學(xué)過程,對細(xì)胞增殖、存活、分化和血管生成起到重要調(diào)節(jié)作用[2-3]。在高糖腹膜透析液誘導(dǎo)的小鼠腹膜纖維化模型和高糖刺激的間皮細(xì)胞以及脫落的人腹膜間皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)STAT3 信號活化,且對STAT3的藥理抑制可通過調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子-1α減輕間皮細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[4]。間皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(mesothelial-mesenchymal transition,MMT)是發(fā)生于胸膜、腹膜等間皮細(xì)胞的Ⅱ型上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,在致腹膜纖維化等過程中發(fā)揮重要作用。暴露于葡萄糖腹膜透析液會導(dǎo)致間皮細(xì)胞過度糖酵解,促進(jìn)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變和增殖[5]。該研究旨在探討高糖是否通過激活STAT3上調(diào) HMrSV5糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)和促進(jìn)MMT,闡明STAT3與糖酵解的交互對話機(jī)制以及抑制STAT3對腹膜透析過程中腹膜纖維化和血管新生的影響,為腹膜纖維化防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要實驗材料

1.1.1實驗動物 健康雄性Sprague-Dawley大鼠18只,180～200 g,SPF級,4～6周齡,由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(批準(zhǔn)號:LLSC20211055)。整個實驗期間,給予所有大鼠標(biāo)準(zhǔn)飲食,自由飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始正式實驗,整個實驗周期為10周。

1.1.2實驗藥物和主要試劑 STAT3抑制劑BP-1-102(S776901)購自Selleck公司,化學(xué)式:C29H27F5N2O6S,分子量:626.59,BP-1-102是高效的特異性的STAT3小分子抑制劑,可抑制Stat3與pTyr肽段的相互作用和STAT3的激活。人腹膜間皮細(xì)胞系(HMrSV5)來源于上海子實生物科技有限公司。通用二步法試劑盒PV-6000、DAB 辣根過氧化物酶顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司;青霉素/鏈霉素溶液、胰蛋白酶購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;胎牛血清、MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;葡萄糖購自美國Sigma公司。兔抗p-STAT3克隆抗體和鼠抗STAT3多克隆抗體購自美國CST公司;兔抗E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-雙磷酸酶-3 (6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3,PFKFB3)、乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)購自美國Affinity Biosciences公司;鼠抗β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔/鼠IgG購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒、無蛋白快速封閉液均購自上海雅酶生物科技有限公司;PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1高糖腹膜透析液誘導(dǎo)建立腹膜纖維化大鼠模型 所有雄性SD大鼠在安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心的特定無病原體條件下飼養(yǎng)。將動物分為3組(n=6):假手術(shù)組、模型組和STAT3抑制劑組。在大鼠背側(cè)皮膚下手術(shù)植入微型腹膜透析導(dǎo)管,導(dǎo)管尖端置于腹膜內(nèi)。假手術(shù)組:除了植入微型腹膜透析導(dǎo)管外,不進(jìn)行其他任何處理;模型組:每天早晚通過腹膜透析導(dǎo)管注射10 ml含4.25%葡萄糖的腹膜透析液 (peritoneal dialysis fluid,PDF)誘導(dǎo)腹膜纖維化; STAT3抑制劑組:為了探索靶向抑制 STAT3 對腹膜纖維化的影響,STAT3抑制劑BP-1-102以1 mg/kg 的劑量溶于10 ml含4.25%葡萄糖的 PDF中,并通過腹膜透析導(dǎo)管給藥。10周后,對大鼠進(jìn)行腹膜平衡實驗并收集大鼠腹膜組織及PDF用于進(jìn)一步分析。

1.2.2腹膜平衡實驗 在大鼠吸入麻醉后,給予腹腔注射20 ml 4.25%PDF,并在腹腔保留90 min。90 min后吸入麻醉下剪開大鼠腹腔,用注射器吸出PDF,記錄PDF總量,計算超濾量,超濾量=腹腔最后的出液量-20 ml。

1.2.3蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色 大鼠腹膜組織用4%多聚甲醛固定48 h,包埋在石蠟中,制成3 μm厚的切片,切片常規(guī)脫蠟后通過濃度梯度的二甲苯和乙醇進(jìn)行洗脫再水化,然后根據(jù)制造商 (美國Sigma公司) 提供的方案進(jìn)行HE染色。

1.2.4免疫組化檢測 大鼠腹膜組織經(jīng)過脫水、透明、包埋后制成石蠟切片,將腹膜組織切片脫蠟、再水化,用內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑封閉內(nèi)源性過氧化酶。通過高壓鍋修復(fù)腹膜組織表面抗原、山羊血清封閉。去除山羊血清后,將標(biāo)本在4 ℃下用1 ∶100稀釋TGF-β1抗體,孵育過夜。第2天,復(fù)溫后,加入二抗,使用 3,3′-二氨基聯(lián)苯胺 (DAB) 顯色。經(jīng)過脫水、透明和封片后,用正置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察并捕獲圖像。

1.2.5細(xì)胞培養(yǎng) 人腹膜間皮細(xì)胞系(HMrSV5)培養(yǎng)在含有10% 胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素溶液的MEM培養(yǎng)基中,所有細(xì)胞置于飽和濕度、5% CO2、37 ℃的溫箱中常規(guī)培養(yǎng)。高糖處理前,將間皮細(xì)胞均勻接種至6孔板中培養(yǎng)過夜。MEM補(bǔ)充為葡萄糖濃度84、138、236 mmol/L的高糖溶液,用于模擬高葡萄糖透析環(huán)境,這相當(dāng)于目前在臨床上用于腹膜透析的含有1.5%、2.5%、4.25%葡萄糖的腹膜透析液。

1.2.6siRNA轉(zhuǎn)染 使用 siRNA 特異性靶序列實現(xiàn)基因表達(dá)的沉默。所有 siRNA 特異性靶序列均來自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。將細(xì)胞接種至6孔板培養(yǎng)孔中,使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達(dá) 60%～80%,去除孔板中的培養(yǎng)基,用含有Lipofectamine2000(Invitrogen)的Opti-MEM將靶序列或陰性對照 (NC) 瞬時轉(zhuǎn)染HMrSV5細(xì)胞。分組進(jìn)行處理: 對照組、HG組(236 mmol/L 葡萄糖)、HG+NC siRNA組、HG+STAT3 siRNA 組,其中,siRNA轉(zhuǎn)染6 h后換成完全培養(yǎng)基,加葡萄糖(236 mmol/L)刺激48 h后檢測相關(guān)蛋白(STAT3、p-STAT3、PFKFB3、LDHA、E-cadherin、α-SMA)的表達(dá)。

1.2.7免疫印跡分析 將6孔板置于冰上,PBS清洗細(xì)胞后,使用含有2%蛋白酶抑制劑、2%磷酸酶抑制劑和2%乙二胺四乙酸的RIPA緩沖液裂解后提取總蛋白,測定各組總蛋白濃度。用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。用無蛋白快速封閉液封閉45 min,將蛋白質(zhì)與一抗(抗STAT3 1 ∶1 000、抗p-STAT3 1 ∶1 000、抗E-cadherin 1 ∶1 000、抗α-SMA 1 ∶1 000、抗LDHA 1 ∶1 000、抗PFKFB3 1 ∶1 000、抗β-actin 1 ∶5 000)在4 ℃下過夜。次日,用TBST洗滌3次,然后與辣根過氧化物酶 (HRP) 偶聯(lián)的二抗室溫下孵育45 min。ECL試劑用于在全自動化學(xué)發(fā)光成像儀上檢測抗體-抗原復(fù)合物。對獲得的條帶進(jìn)行可視化和分析,結(jié)果用內(nèi)源性參照物β-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用Graphpad Prism 8 軟件、Image J 軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。使用Levene方法進(jìn)行方差齊性檢驗,多組數(shù)據(jù)間的差異通過單因素方差分析(one-way ANOVA) 比較,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腹膜結(jié)構(gòu)和功能的改變SD大鼠每天注射高糖腹膜透析液,10周后發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組腹膜組織結(jié)構(gòu)未見異常,模型組腹膜組織病理改變明顯,表現(xiàn)為腹膜下區(qū)域增厚、膠原纖維沉積和血管新生,提示大鼠腹膜纖維化模型已成功構(gòu)建。STAT3抑制劑組腹膜下區(qū)域增厚和血管新生情況較模型組明顯改善。免疫組化染色顯示,假手術(shù)組腹膜下區(qū)域TGF-β1表達(dá)較弱,模型組表達(dá)明顯高于Sham組(F=200.3,P<0.05),STAT3抑制劑組腹膜組織及腹膜下區(qū)域TGF-β1表達(dá)明顯低于模型組(P<0.05)。腹膜平衡實驗結(jié)果顯示,假手術(shù)組超濾量均值為8.3 ml,模型組的超濾量均值為3.3 ml(F=71.91,P<0.05),腹膜組織超濾功能受損,STAT3抑制劑組超濾量均值為5.8 ml,功能較模型組改善(P<0.05),見圖1、2。

圖1 各組大鼠腹膜組織HE染色 ×100

圖2 免疫組化檢測各組大鼠腹膜組織TGF-β1表達(dá)情況 ×100

2.2 高糖激活HMrSV5細(xì)胞中的STAT3使用蛋白質(zhì)印跡分析探討高糖對間皮細(xì)胞 (HMrSV5) STAT3 活化的影響。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明,在不同濃度葡萄糖(84、138、236 mmol/L)刺激后,STAT3磷酸化水平較對照組升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=55.54,P<0.05),其中236 mmol/L葡萄糖處理的HMrSV5細(xì)胞中STAT3磷酸化最明顯,見圖3。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測不同濃度高糖作用于HMrSV5細(xì)胞48 h p-STAT3、STAT3蛋白的表達(dá)水平

2.3 高糖引起HMrSV5細(xì)胞糖酵解增加和MMT使用蛋白質(zhì)印跡分析探索高糖對人腹膜間皮細(xì)胞(HMrSV5)糖酵解和MMT的影響。結(jié)果表明,HMrSV5細(xì)胞在138、236 mmol/L的葡萄糖環(huán)境培養(yǎng)48 h后,LDHA蛋白表達(dá)升高(F=9.859,P<0.05),高糖(236 mmol/L)誘導(dǎo)HMrSV5細(xì)胞PFKFB3蛋白的表達(dá)增加(F=13.36,P<0.05)。同時測定與MMT相關(guān)的上皮間黏附蛋白標(biāo)志物 E-cadherin和間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)。蛋白印跡

分析顯示高糖(138、236 mmol/L)培養(yǎng)基處理HMrSV5細(xì)胞上調(diào)α-SMA的表達(dá)(F=33.81,P<0.05),高糖(236 mmol/L)處理下調(diào)E-cadherin的表達(dá)(F=4.457,P<0.05)。由此推斷236 mmol/L葡萄糖可引起HMrSV5細(xì)胞高糖酵解和MMT,見圖4。

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測不同濃度高糖(84、138、236 mmol/L)作用于HMrSV5細(xì)胞48 h PFKFB3、LDHA、E-cadherin、α-SMA蛋白的表達(dá)水平

2.4 STAT3 siRNA抑制高糖環(huán)境中STAT3信號通路的激活與對照組(未處理的細(xì)胞)相比,HG組(236mmol/L葡萄糖處理的細(xì)胞)的STAT3的磷酸化蛋白增多(F=29.20,P<0.05); HG+NC siRNA組磷酸化STAT3較高糖組無變化(P>0.05);與HG+NC siRNA組相比,HG+STAT3 siRNA組降低高糖誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞中STAT3蛋白磷酸化(P<0.05),見圖5。

圖5 敲低STAT3對高糖刺激的HMrSV5中相關(guān)蛋白的影響

2.5 STAT3 siRNA抑制高糖誘導(dǎo)的糖酵解相關(guān)代謝酶的高表達(dá)和MMT使用蛋白質(zhì)印跡檢測PFKFB3和LDHA的表達(dá)變化,結(jié)果顯示高糖刺激后可以使PFKFB3和LDHA表達(dá)上調(diào)(F=40.92,P<0.05;F=22.74,P<0.05)。此外,高糖刺激后E-cadherin表達(dá)下調(diào)(F=14.67,P<0.05),α-SMA表達(dá)上調(diào)(F=9.589,P<0.05)。HG+NC siRNA組上述相關(guān)蛋白的表達(dá)較HG組無變化。STAT3 siRNA預(yù)處理的HMrSV5細(xì)胞中PFKFB3、LDHA和α-SMA的表達(dá)較HG+NC siRNA組下降,E-cadherin的表達(dá)較HG+NC siRNA組上調(diào),見圖6。

圖6 敲低STAT3對高糖刺激的HMrSV5中糖酵解與MMT相關(guān)蛋白的影響

3 討論

完整的腹膜結(jié)構(gòu)和功能有助于達(dá)到良好的腹膜透析效果。長期腹膜透析治療中的各種不利因素?fù)p傷腹膜結(jié)構(gòu)和功能,最終導(dǎo)致腹膜纖維化。STAT3是一種關(guān)鍵的信號蛋白,參與多種生物學(xué)過程,包括細(xì)胞增殖、分化、纖維化和血管生成[2-3]。研究[6]表明,抑制腎小管上皮細(xì)胞中的STAT3 可以預(yù)防鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎纖維化和腎病。BET-溴結(jié)構(gòu)域抑制劑JQ-1可抑制STAT3信號的激活進(jìn)而部分改善日本血吸蟲卵誘導(dǎo)的肝纖維化[7]。STAT3在腎臟、腹膜以及肝臟等器官纖維化過程中激活,介導(dǎo)器官損傷[4, 6, 8-9]。本研究通過構(gòu)建腹膜透析動物模型,模擬人體長期腹膜透析環(huán)境,用以闡明STAT3參與腹膜纖維化的分子機(jī)制。HE染色結(jié)果顯示腹膜纖維化大鼠模型中膠原纖維積累、皮下區(qū)域增厚和血管密度增加。免疫組化顯示腹膜中TGF-β1(一種關(guān)鍵的纖維化因子)陽性表達(dá)增加。這些變化與接受長期腹膜透析的患者中發(fā)現(xiàn)的腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化的關(guān)鍵病理特征相似[10]。本研究顯示STAT3抑制劑BP-1-102顯著降低血管密度、減輕TGF-β1陽性表達(dá)和皮下區(qū)域增厚,說明 STAT3 信號傳導(dǎo)的藥理學(xué)抑制可減弱高糖腹膜透析液介導(dǎo)的腹膜纖維化及血管新生。在腹膜纖維化患者中,由于間皮細(xì)胞的丟失、細(xì)胞外基質(zhì)聚集、炎性細(xì)胞的滲出和血管新生,最終導(dǎo)致腹膜超濾衰竭。在模型組大鼠,發(fā)現(xiàn)超濾量降低,STAT3抑制劑BP-1-102明顯改善透析所致的超濾量的減少,證明抑制STAT3信號傳導(dǎo)有助于改善透析所致的腹膜超濾損傷。

腹膜纖維化的發(fā)展過程中,可以檢測到與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相類似的間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變的一種特殊形式,稱為MMT[11]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中上皮細(xì)胞的極性消失,轉(zhuǎn)移和侵襲能力增強(qiáng),同時伴有上皮細(xì)胞標(biāo)志物的缺失和間充質(zhì)標(biāo)志物的獲得,E-cadherin和α-SMA為腹膜間皮細(xì)胞MMT的特異性生化標(biāo)志物。本研究利用高糖刺激腹膜間皮細(xì)胞,以此模擬腹膜透析時的高糖微環(huán)境,結(jié)果顯示高糖誘導(dǎo)間皮細(xì)胞E-cadherin的低表達(dá)和α-SMA的高表達(dá),證明高糖刺激誘導(dǎo)間皮細(xì)胞發(fā)生MMT。通過抑制腹膜透析刺激的MMT來預(yù)防腹膜纖維化已成為腹膜纖維化機(jī)制研究的主要策略。對正常腹膜活檢中獲得的間皮細(xì)胞和腹膜透析治療患者的流出物的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)MMT的發(fā)展伴隨著糖酵解相關(guān)代謝酶的改變,暴露于腹膜透析液會導(dǎo)致間皮細(xì)胞過度糖酵解,阻斷過度糖酵解在兩種類型的間皮細(xì)胞中都極大地抑制了MMT[5]。進(jìn)而,本研究檢測間皮細(xì)胞中糖酵解相關(guān)代謝酶的表達(dá),結(jié)果顯示高糖誘導(dǎo)間皮細(xì)胞高表達(dá)PFKFB3和LDHA,同時伴隨STAT3激活。研究[12]表明,缺氧條件下STAT3通過下調(diào)LINC00671的表達(dá)激活LDHA,調(diào)節(jié)甲狀腺癌的糖酵解、生長和轉(zhuǎn)移。在肝細(xì)胞癌中,靶向抑制STAT3可阻止糖酵解關(guān)鍵酶的表達(dá),并誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡從而重建腫瘤免疫微環(huán)境[13]。LCN2可通過激活JAK2/STAT3信號通路促進(jìn)有氧糖酵解,加速肝癌細(xì)胞的惡性增殖[14]。本研究中用siRNA影響細(xì)胞STAT3 的基因表達(dá)后,下調(diào)高糖誘導(dǎo)的糖酵解相關(guān)代謝酶PFKFB3和LDHA的高表達(dá),表明靶向抑制STAT3可以調(diào)控高糖誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞糖酵解活化,同時且逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)間皮細(xì)胞MMT標(biāo)志性蛋白E-cadherin和α-SMA的表達(dá)。本研究結(jié)果表明,siRNA抑制STAT3 信號通路通過下調(diào)間皮細(xì)胞PFKFB3、LDHA的表達(dá)減輕HMrSV5 細(xì)胞MMT。

本研究表明抑制STAT3可部分減緩腹膜纖維化和血管新生的進(jìn)展,高糖微環(huán)境中STAT3信號通路的激活在促進(jìn)HMrSV5細(xì)胞 MMT過程中發(fā)揮促進(jìn)作用,而抑制 STAT3 信號通路的激活能通過下調(diào)間皮細(xì)胞PFKFB3、LDHA的表達(dá)減輕HMrSV5 細(xì)胞MMT。綜上所述,在腹膜纖維化中,靶向STAT3 信號通路通過調(diào)控腹膜間皮細(xì)胞糖酵解減緩腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化和血管新生,為腹膜纖維化防治提供新思路。