李 娟,蔣揚青,沈瑞明,李國銓,王 敏,徐逢皇

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以侵襲性對稱性多關節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病,RA關節(jié)病理特征是滑膜增生、血管翳形成,表現(xiàn)為滑膜成纖維細胞(synovial fibroblast,SF)類瘤樣增生、浸潤軟骨和骨,并導致關節(jié)破壞[1]。目前,我國RA的發(fā)病率約為0.34%,3年致殘率達70%,每10年死亡的總體危險增加1.3～2倍,且患者出現(xiàn)心血管疾病的風險顯著增高[2],給個人、家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔。迄今RA的發(fā)病機制尚未明確,SF是RA疾病進展最主要的效應細胞[3],深入研究病理狀態(tài)下SF表型發(fā)生變化的機制、尋找可能干預的靶點將對未來開發(fā)潛在的治療藥物具有重大意義。研究[4-6]顯示表觀遺傳學的異?？蓪е骂愶L濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞活化及炎癥反應的發(fā)生,表現(xiàn)為異常增殖,具有侵襲性,破壞軟骨和骨。mRNA腺嘌呤N6位甲基化(N6-methyladenosine,m6A)是高等真核生物基因轉(zhuǎn)錄后mRNA最主要的修飾[7],m6A是否參與RA-SF表型的改變及其中的調(diào)節(jié)機制尚未明確。該研究以RA關節(jié)滑膜組織、滑膜成纖維細胞為研究對象,采用免疫組化、酶聯(lián)免疫吸附試驗、流式細胞術、基因過表達及敲低等技術探討METTL3對滑膜細胞增殖、遷移及分泌細胞因子的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2020年1月-2021年12月海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院風濕免疫科及關節(jié)外科收治的行關節(jié)置換或關節(jié)鏡下滑膜切除術的RA及骨關節(jié)炎(osteoarthritis, OA)患者各25例,兩組患者年齡、性別比例差異無統(tǒng)計學意義。RA患者符合1987年美國風濕病協(xié)會或2010年美國風濕病協(xié)會和歐洲抗風濕聯(lián)盟發(fā)布的分類標準。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會的批準[批準號:2020(科研L)第(114)號)],所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1主要試劑及儀器 兔抗METTL3單克隆抗體(ab195352)、鼠抗人METTL14單克隆抗體(ab220030)、兔抗WTAP單克隆抗體(ab195380)、兔抗ALKBH5單克隆抗體(195377)、m6A RNA甲基化定量試劑盒(ab185912)購自英國Abcam公司;抗兔IgG過氧化物酶(31460)、抗鼠IgG過氧化物酶(32430)購自美國賽默飛公司;STM2457(HY-134836,MedChemExpress公司),TRIzol試劑(A33250)、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000(L3000001)購自美國Invitrogen公司;細胞計數(shù)試劑盒-8(FY600001)購自弗元生物公司;凋亡試劑盒(22839)購自AAT Bioquest公司; 5×PrimeScript RT Master Mix(RR036A)、TB Green qPCR Premix Ex Taq II(RR820Q)購自TAKARA公司;METTL3-siRNA及METTL3-pcDNA3.1購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

NanoDrop 2000分光光度計(nd2000)、Pikoreal 96 real-time PCR系統(tǒng)(PikoReal)、iBright CL750 成像系統(tǒng)(iBright CL750)購自美國賽默飛公司。

1.2.2RA滑膜成纖維細胞的分離培養(yǎng)及分組 RA患者滑膜組織中加入RPMI 1640洗滌,解剖剪銳性切碎。用4 mg/ml I型膠原酶的RPMI 1640消化37 ℃孵育120 min。收集細胞懸液,經(jīng)細胞濾網(wǎng)過濾,反復離心洗滌,重懸,接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。取P3代SFs制細胞爬片,細胞免疫組化檢查抗原Vimentin和CD68的表達水平。對滑膜細胞分別轉(zhuǎn)染針對METTL3-siRNA(si-METTL3組)、METTL3-pcDNA3.1(hi-METTL3組)及陰性對照(MOCK組),以及給予STM2457(METTL3抑制劑) 10 μmol/ml干預組。分別在細胞培養(yǎng)的12、24、48 h檢測每組細胞的增殖活性、凋亡比例、遷移能力及培養(yǎng)液上清液白介素-6 (interleukin-6, IL-6)、白介素-17A (interleukin-17A, IL-17A)、 腫瘤壞死因子-κB活化受體配體(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand, RANKL)、骨保護素(osteoprotegerin, OPG) 的濃度。

1.2.3m6A檢測 使用m6A RNA甲基化定量試劑盒檢測總RNA中的m6A水平。根據(jù)實驗操作步驟,使用TRIzol試劑提取滑膜組織中總RNA。分別加入200 ng總RNA、捕獲抗體溶液和檢測抗體溶液,用比色法測量每個孔在450 nm的吸光度,根據(jù)標準曲線定量m6A水平。

1.2.4免疫組化檢測甲基轉(zhuǎn)移酶樣3 (methyltransferase-like 3, METTL3)、甲基轉(zhuǎn)移酶樣14 (methyltransferase-like 14, METTL14)、腎母細胞瘤 1 相關蛋白(Wilms′tumor 1-associating protein,WTAP)、AlkB 同系物5(AlkB homologue 5,ALKBH5)的表達 滑膜組織浸泡于10%的多聚甲醛中24 h后石蠟包埋。石蠟塊切片(5 μm)后進行蘇木精-伊紅(HE)染色,免疫組化檢測METTL3、METTL14、WTAP、ALKBH5表達。石蠟切片干燥、脫蠟和水合、抗原修復、蛋白封閉后,加入特異性一抗進行孵育,4 ℃過夜,加入二抗孵育2 h后顯色。顯微鏡下觀察目的蛋白表達情況。將免疫組化圖片輸入Image J軟件中計算陽性細胞數(shù)占比。

1.2.5細胞轉(zhuǎn)染 小干擾RNA轉(zhuǎn)染:METTL3 siRNA的序列為5′-GUCAGUAUCUUGGGCAAAUTT-3′(正向)和5′-AUUUGCCCAAGAUACUGACTT-3′(反向)。在6孔板中培養(yǎng)滑膜成纖維細胞(3.0×105/孔),按照操作流程使用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染1 μg小干擾RNA,RT-qPCR和Western blot驗證METTLE轉(zhuǎn)染后mRNA及蛋白的表達。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:在6孔板中培養(yǎng)滑膜成纖維細胞(3.0×105/孔),按照操作流程使用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染1 μg METTL3-pcDNA3.1,RT-qPCR和Western blot驗證METTLE轉(zhuǎn)染后mRNA及蛋白的表達。

1.2.6CCK-8法檢測細胞增殖 原代RA滑膜細胞在96孔培養(yǎng)板(每孔6 000個細胞)中培養(yǎng),每組分別在培養(yǎng)12、24、48 h,加入10 μl CCK-8溶液,并共培養(yǎng)1.5 h。用酶標儀在450 nm下測試吸光度值。

1.2.7流式細胞術檢測細胞凋亡 在6孔板中培養(yǎng)滑膜成纖維細胞(2.0×105/孔),各組分別在培養(yǎng)12、24、48 h收集細胞,采用凋亡試劑盒對細胞進行染色,使用流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。

1.2.8劃痕實驗檢測細胞遷移 4組滑膜成纖維細胞分別培養(yǎng)在6孔板中(1.0×105/孔),用10 μl移液管尖端在每個孔的單細胞層中間刮劃一痕,PBS洗滌未附著的細胞,每組分別在培養(yǎng)12、24、48 h,用4%多聚甲醛固定細胞,用0.1%結(jié)晶紫染色后使用顯微鏡進行觀察。

1.2.9RT-qPCR檢測 為檢測METTL3 mRNA表達,首先根據(jù)操作說明使用TRIzol試劑提取總RNA,使用NanoDrop 2000分光光度計測量濃度。使用5×PrimeScript RT Master Mix通過反轉(zhuǎn)錄獲得互補DNA(cDNA)。在實驗說明的基礎上利用TB Green qPCR Premix Ex Taq Ⅱ制備反應混合物。反應在Pikoreal 96 real-time PCR系統(tǒng)中進行,使用以下條件檢測mRNA水平:95 ℃持續(xù)10 min,然后在95 ℃下循環(huán)40次持續(xù)15 s,60 ℃持續(xù)60 s。使用2-ΔΔCT方法計算相對表達,以β-actin mRNA表達作為內(nèi)參。

1.2.10Western blot檢測 等量(約0.2 g)的組織或計數(shù)細胞在RIPA緩沖液(0.1 g/ml)中勻漿,在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min,收集上清液蛋白質(zhì)。測量蛋白濃度后,在1×SDS緩沖液中煮沸(100 μl /106cells)5 min。在10%SDS-PAGE凝膠上加等量(50 μg)蛋白,分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜,之后分別與特異性抗METTL3(1 ∶2 000)、抗METTL14(1 ∶5 000)、抗WTAP(1 ∶5 000)、抗ALKBH5(1 ∶2 000)、二抗(1 ∶5 000)一起孵育后用蛋白印跡成像系統(tǒng)檢測。

1.2.11ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液IL-6、IL-17A、RANKL、OPG濃度 在6孔板中培養(yǎng)滑膜成纖維細胞(2.0×105/孔),各組分別在培養(yǎng)12、24、48 h收集細胞培養(yǎng)液上清液,按照人IL-6、IL-17A、RANKL、OPG ELISA試劑盒操作步驟進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 RA和OA滑膜組織m6A含量RA滑膜組織m6A含量顯著高于對照組(OA組),差異有統(tǒng)計學意義(圖1),說明RA滑膜組織m6A甲基化水平增高。

圖1 RA與OA滑膜組織m6A的含量

2.2 RA及OA滑膜組織中METTL3、METTL14、WTAP及ALKBH5的表達與OA滑膜組織相比,免疫組化(陽性細胞數(shù)占比,圖2)及Western blot(圖3)結(jié)果顯示RA滑膜組織METTL3的表達顯著高于OA組(P<0.05),METTL14、WTAP及ALKBH5的表達在兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖2 免疫組化檢測RA及OA滑膜組織中METTL3、METTL14、WTAP及ALKBH5的表達 ×200

圖3 Western blot檢測RA及OA滑膜組織中METTL3、METTL14、WTAP、ALKBH5的表達

2.3 RA滑膜細胞培養(yǎng)及鑒定體外培養(yǎng)RA滑膜成纖維細胞,P3時呈較為均一的長梭形細胞(圖4)。流式細胞術檢測體外培養(yǎng)滑膜樣成纖維細胞:CD68-CD14-CD90+(圖5)。

圖4 體外培養(yǎng)RA滑膜細胞 ×400

圖5 流式細胞術檢測體外培養(yǎng)滑膜樣成纖維細胞

2.4 METTL3促進RA滑膜成纖維細胞增殖、遷移及分泌炎癥因子與陰性對照相比,RT-qPCR及Western blot顯示si-METTL3組滑膜成纖維細胞中METTL3表達顯著降低,hi-METTL3組滑膜成纖維細胞中METTL3表達顯著增高,見圖6A-6C。

圖6 RT-qPCR及Western blot檢測si-METTL3及hi-METTL3細胞METTL3的表達

2.4.1METTL3對RA滑膜成纖維細胞增殖的作用 細胞培養(yǎng)12、24 h,四組細胞增殖差異無統(tǒng)計學意義,48 h后,hi-METTL3組滑膜成纖維細胞增殖能力顯著高于對照組(P<0.05),si-METTL3組和STM2457組滑膜成纖維細胞增殖能力顯著低于對照組(P<0.05),見圖7。

圖7 CCK-8法檢測四組滑膜成纖維細胞12、24、48 h增殖能力

2.4.2METTL3對RA滑膜成纖維細胞凋亡的作用 hi-METTL3組滑膜成纖維細胞凋亡比例低于對照組,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);si-METTL3組和STM2457組細胞凋亡比例高于對照組,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖8。

圖8 流式細胞術檢測四組滑膜成纖維細胞凋亡比例

2.4.3METTL3對RA滑膜成纖維細胞遷移的作用 滑膜成纖維細胞培養(yǎng)12 h開始,hi-METTL3組細胞遷移能力顯著高于對照組,si-METTL3組及STM2457組細胞遷移能力顯著低于對照組,并持續(xù)至24 h和48 h,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖9。

圖9 劃痕實驗檢測四組滑膜成纖維細胞 12、24、48 h細胞遷移能力

2.4.4METTL3對RA滑膜成纖維細胞分泌細胞因

子的作用 滑膜成纖維細胞培養(yǎng)48 h后上清液IL-6的濃度在si-METTL3組和STM2457組均顯著低于對照組,hi-METTL3組顯著高于對照組(P<0.05)?；こ衫w維細胞培養(yǎng)24 h后,培養(yǎng)上清液中RANKL的濃度在hi-METTL3組顯著高于對照組,并持續(xù)至48 h;培養(yǎng)48 h后,hi-METTL3及STM2457組上清液RANKL的濃度顯著低于對照組(P<0.05)?；こ衫w維細胞培養(yǎng)24、48 h時,hi-METTL3組細胞培養(yǎng)上清液OPG濃度顯著低于對照組(P<0.05),si-METTL3組及STM2457組濃度顯著高于對照組(P<0.05)。四組間在各培養(yǎng)時間點IL-17A濃度無顯著差異(圖10)。

圖10 ELISA法檢測四組滑膜成纖維細胞12、24、48 h細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-17A、RANKL、OPG濃度

3 討論

RA是一種慢性自身免疫性疾病,如未及時正規(guī)治療可導致關節(jié)畸形、殘疾,嚴重影響患者的生活質(zhì)量。類風濕關節(jié)炎的病因目前尚未明確,SF是RA疾病進展最主要的效應細胞,在生理條件下,SF是滑液和滑膜基質(zhì)中分子成分的關鍵制造者,保證關節(jié)的平衡與功能優(yōu)化。在RA病理條件下,滑膜襯里層SF可由正常的1～3層增至15層甚至更多層細胞。SF表現(xiàn)為失去接觸抑制的非依賴性生長,具有異常的增殖和侵蝕特性[8]。

表觀遺傳調(diào)控是以獨立于基因組序列的方式,在核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下調(diào)控基因的表達,并影響蛋白功能等重要的生命過程。研究[9]顯示表觀遺傳學異常可導致RA-SF活化及炎癥反應的發(fā)生,表現(xiàn)為異常增殖,具有侵襲性,破壞軟骨和骨。mRNA m6A甲基化是高等真核生物基因轉(zhuǎn)錄后mRNA最主要的修飾。mRNA m6A修飾由甲基轉(zhuǎn)移酶復合體對mRNA進行甲基化,去甲基化酶移除甲基,RNA結(jié)合蛋白與其特異性結(jié)合后可讀取相關信息。其中甲基轉(zhuǎn)移酶復合體是由METTL3、METTL14和WTAP組成。ALKBH5作為去甲基酶從而實現(xiàn)去甲基化[7]。因正常關節(jié)滑膜組織較難獲得,因此本課題組研究了RA和OA患者關節(jié)滑膜組織RNA m6A甲基化情況,發(fā)現(xiàn)RA滑膜組織RNA m6A甲基化程度顯著增高,進一步研究了參與RNA m6A甲基化的相關甲基化酶及去甲基化酶,發(fā)現(xiàn)METTL3在RA滑膜組織中的表達顯著增高。接下來本課題組對SF進行體外培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)與對照組相比,過表達METTL3組SF細胞RNA m6A顯著增加,細胞增殖活性、遷移能力顯著增強[10],細胞凋亡無明顯差異;敲低METTL3細胞RNA m6A顯著減少,SF細胞增殖活性、遷移能力顯著下降[11]。STM2457干預SF后,細胞增殖、遷移的變化與siMETTL3組相似。說明METTL3通過調(diào)控SF mRNA m6A甲基化促進SF細胞增殖和遷移。

SF除了具有異常的增殖特性,也能夠刺激炎癥,更能夠直接破壞關節(jié)軟骨和骨。研究[12]表明SF可分泌一系列細胞因子,對單核巨噬細胞、淋巴細胞和骨細胞發(fā)揮多效性作用。RA SF能夠產(chǎn)生及(或)應答的炎癥介質(zhì)包括IL-6、IL-17、RANKL、OPG等。IL-6是活化的T細胞和成纖維細胞產(chǎn)生的淋巴因子,是RA的發(fā)生發(fā)展中重要炎癥因子之一[13-14]。IL-17是重要的促炎細胞因子,由T輔助細胞17產(chǎn)生,IL-17能夠誘導上皮細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞合成分泌IL-6,從而導致炎癥產(chǎn)生[15-16]。RANKL也叫做破骨細胞分化因子,其與受體結(jié)合后可激活破骨細胞,促進骨破壞[17-18]。OPG屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體家族,是RANKL的誘導受體,通過與RANKL的結(jié)合減少破骨細胞的產(chǎn)生,發(fā)揮骨保護作用[19-20]。本研究顯示,與對照組相比,hi-METTL3組滑膜成纖維細胞RNA m6A甲基化程度增加,細胞分泌IL-6、RANKL顯著增加、OPG顯著減少;si-METTL3組SF RNA m6A甲基化程度顯著下降,細胞分泌IL-6、RANKL顯著減少,OPG顯著增加,說明METTL3調(diào)控RNA m6A甲基化后可促進炎癥因子IL-6的表達及破骨細胞分化因子RANKL的表達,減少骨保護素OPG的表達,可能會促進骨破壞。各組細胞培養(yǎng)上清液中IL-17A濃度無明顯變化,說明METTL3對IL-17A的作用影響小。METTL3對SF合成分泌IL-6、RANKL及OPG的具體調(diào)控機制,如蛋白基因轉(zhuǎn)錄的影響、mRNA m6A甲基化的區(qū)域或位點值得進一步探討,這也是課題組下一步的研究方向。本研究顯示給予METTL3特異性抑制劑STM2457干預后,SF細胞增殖活性、遷移能力顯著下降,分泌IL-6及RANKL顯著減少,OPG表達顯著增加,STM2457作為METTL3特異性抑制劑是未來RA治療的潛在藥物之一,本課題組下一步將對STM2457干預RA動物模型的體內(nèi)作用進行研究。

總之,本研究表明RA滑膜成纖維細胞mRNA m6A甲基化顯著增加,且主要為METTL3所調(diào)控。METTL3可通過促進RA-SF細胞mRNA m6A甲基化,促進SF增殖和遷移,同時促進SF分泌IL-6及RANKL。METTL3特異性抑制劑STM2457是RA治療的潛在靶點藥物,值得后續(xù)進一步研究。