王雅雯,程亞楠,楊 賓,蘇碧昊,徐 普

骨重建中新生血管生成主要涉及以內(nèi)皮細(xì)胞為主的血管再生,血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管再生的主要參與者,細(xì)胞的增殖、遷移和分化是骨再生的重要促進(jìn)因素[1-2]。有研究[3-5]表明,在新生骨形成的微環(huán)境中,新生血管與骨組織之間相輔相成,內(nèi)皮細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子有利于骨重建的發(fā)生。自噬通過(guò)吞噬并溶解多余或受損的細(xì)胞器為細(xì)胞供能,是維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)發(fā)育的有利因素。雷帕霉素(rapamycin,Rapa)通過(guò)抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)(mammalian target of rapamycin,mTOR)達(dá)到激活細(xì)胞自噬的目的,是研究自噬較為成熟的自噬激活劑[6-7]。

課題組前期研究[8-9]結(jié)果表明,氧濃度的改變會(huì)影響成骨細(xì)胞的自噬活性,進(jìn)而改變細(xì)胞的增殖和分化能力。但內(nèi)皮細(xì)胞的自噬活性改變對(duì)局部成骨造成影響目前少見(jiàn)報(bào)道。該研究通過(guò)Rapa作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)建立細(xì)胞自噬模型,探討Rapa上調(diào)HUVECs自噬對(duì)細(xì)胞增殖的影響,為后續(xù)血管再生與骨重建相關(guān)性研究提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料HUVECs購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。Rapa購(gòu)自美國(guó)MCE公司,人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(F-12K+0.1 mg/ml heparin+ECGS+10%FBS),PBS磷酸鉀緩沖液、青鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3, LC3)、unc-51樣激酶1(unc-51-like kinase 1, ULK1)和mTOR一抗購(gòu)自美國(guó)CST公司,Beclin1 一抗、GAPDH一抗、Goat Anti-Rabbit IgG二抗購(gòu)自英國(guó) Abcam公司,CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁公司,自噬染色檢測(cè)試劑盒(MDC法)、EdU-488細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 HUVECs常規(guī)培養(yǎng),每2 d換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)合適密度時(shí)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。以正常培養(yǎng)(10%FBS培養(yǎng))為對(duì)照組,以10%FBS培養(yǎng)液中加入終濃度100 nmol/L的Rapa為實(shí)驗(yàn)組,作用于HUVECs,3、6、12、24 h收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.2.2Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng),以50%的密度接種于10 cm2培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至85%時(shí)加入終濃度為100 nmol/L的Rapa分別處理3、6、12、24 h。加入RIPA細(xì)胞裂解液1 ml,4 ℃、12 140 r/min離心5 min,BCA蛋白定量后加上樣緩沖液,95 ℃蛋白變性5 min,-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?0 μg蛋白樣品加入4%～20%梯度膠上樣孔中,依次120 V恒壓50 min蛋白電泳,冰上300 mA恒流30 min轉(zhuǎn)膜,封閉后分別加入一抗LC3(1 ∶1 000)、Beclin 1(1 ∶3 000)、ULK1(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶2 000),4 ℃孵育過(guò)夜;室溫下孵育二抗(1 ∶2 000和1 ∶10 000)1 h,化學(xué)發(fā)光1 min后拍照。Image J軟件進(jìn)行灰度值測(cè)量,相對(duì)蛋白表達(dá)強(qiáng)度以目標(biāo)條帶與內(nèi)參蛋白的灰度比值表示。

1.2.3透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)檢測(cè)自噬小體 細(xì)胞處理24 h后取1 ml電鏡固定液加入皿中,室溫固定5 min,隨后細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞置于1.5 ml EP管,1 200 r/min離心3 min,加入新固定液1 ml,室溫固定30 min,4 ℃?zhèn)錅y(cè)。

1.2.4MDC法檢測(cè)自噬熒光表達(dá) 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后,以1×104/孔接種于24孔板中,24 h后吸凈培養(yǎng)液。每孔加入250 μl MDC染色液,培養(yǎng)箱避光孵育1 h;吸凈MDC染色液,使用Assay Buffer洗滌3次,更換新Assay Buffer,熒光顯微鏡下拍攝綠色熒光,熒光強(qiáng)度用Image J進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.5CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后,以1×104/孔接種于96孔板中,設(shè)置4個(gè)復(fù)孔,按實(shí)驗(yàn)分組分別于3、6、12、24、48 h加入10 μl CCK-8液,37 ℃繼續(xù)孵育1 h,酶標(biāo)儀450 nm測(cè)光密度(optical density, OD)值,計(jì)算抑制率,抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.6EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞以2×104/孔接種于24孔板中,處理24 h;去除50%原培養(yǎng)基,加入等體積EdU工作液進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記;37 ℃繼續(xù)孵育細(xì)胞2 h;4%多聚甲醛室溫固定15 min,洗滌液洗3次;加入通透液室溫孵育15 min,洗滌液洗2次;每孔加入100 μl的Click反應(yīng)液,室溫避光孵育30 min,洗滌液洗3次;每孔加入100 μl Hoechst 33342溶液,室溫孵育10 min進(jìn)行細(xì)胞核染色,熒光倒置顯微鏡進(jìn)行熒光檢測(cè)。Hoechst 33342為藍(lán)色熒光,EdU染色為綠色熒光。

1.2.7血管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞管腔形成能力 Matrigel提前4 ℃過(guò)夜,所需槍頭、EP管及24孔板4 ℃過(guò)夜預(yù)冷。培養(yǎng)基和Matrigel配比2∶1配置實(shí)驗(yàn)用膠,96孔板內(nèi)加入50 μl/孔實(shí)驗(yàn)用膠鋪膠,培養(yǎng)箱中固化。細(xì)胞消化離心后依據(jù)分組選用相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基進(jìn)行重懸,2×104/孔加入細(xì)胞懸液,37 ℃培養(yǎng)箱靜置2 h后,觀察血管形成情況,并于最佳時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較用單因素方差分析,兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Rapa上調(diào)HUVECs自噬活性

2.1.1自噬蛋白表達(dá)上調(diào) 經(jīng)過(guò)Rapa處理后,自噬蛋白相對(duì)蛋白表達(dá)高于對(duì)照組,自噬活性增強(qiáng)。LC3-II/LC3-I相對(duì)比值的蛋白表達(dá)在起始3 h時(shí)出現(xiàn)明顯升高(P<0.001),隨后蛋白表達(dá)強(qiáng)度減弱,但在作用的24 h時(shí)又明顯增強(qiáng)(P<0.001)。Beclin1的相對(duì)蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組,最高值出現(xiàn)在作用后的6 h(P<0.001),而ULK1的相對(duì)蛋白量同樣呈現(xiàn)不斷升高的趨勢(shì),最高值出現(xiàn)在作用后的24 h(P<0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 Western blot法檢測(cè) Rapa 分別處理HUVECs 3、6、12、24 h后自噬蛋白表達(dá)水平

2.1.2自噬小體形成 TEM檢測(cè)觀察自噬小體形成情況,結(jié)果顯示,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均可見(jiàn)自噬小體及自噬溶酶體,自噬體融合變成單層膜結(jié)構(gòu)的自噬溶酶體,其內(nèi)可見(jiàn)已溶解的細(xì)胞器,見(jiàn)圖2。

圖2 TEM觀察Rapa作用后自噬體形成

2.1.3自噬熒光表達(dá)增強(qiáng) MDC法檢測(cè)結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)Rapa處理的實(shí)驗(yàn)組,HUVECs的自噬熒光表達(dá)較強(qiáng),熒光強(qiáng)度為 15.706±2.776,高于對(duì)照組的8.782±2.310(F=0.162,P=0.029),見(jiàn)圖3。

圖3 MDC法檢測(cè)Rapa作用后自噬熒光表達(dá) ×200

2.2 Rapa上調(diào)HUVECs自噬活性抑制細(xì)胞增殖

2.2.1HUVECs的增殖能力減弱 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),OD值不斷增加,在6 h前,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組OD值的差值雖隨著時(shí)長(zhǎng)增大,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比,在處理24 h時(shí)細(xì)胞抑制率值最高,為(55.56±1.30)%(F=109.069,P=0.001)。見(jiàn)圖4。

表1 Rapa處理HUVECs后OD450值

圖4 CCK-8法檢測(cè)Rapa作用后細(xì)胞增殖抑制率

2.2.2增殖細(xì)胞減少 EdU法檢測(cè)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組可觀察到EdU綠色熒光細(xì)胞數(shù)減少,平均每視野(9±1)個(gè),明顯低于對(duì)照組(21±3)個(gè)(F=1.160,P=0.001),見(jiàn)圖5。

圖5 EdU法檢測(cè)自噬上調(diào)后細(xì)胞增殖水平 ×200

2.3 HUVECs管腔形成能力減弱與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組未能很好地形成完整的管腔樣結(jié)構(gòu),管腔壁連續(xù)性破壞,出現(xiàn)殘缺、斷裂等表現(xiàn),細(xì)胞血管形成能力減弱,見(jiàn)圖6。

圖6 血管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自噬活性上調(diào)對(duì)HUVECs管腔形成的影響 ×100

3 討論

局部新生微血管作為影響種植區(qū)域良好骨結(jié)合的重要因素,是促進(jìn)種植成功的關(guān)鍵基礎(chǔ)[10]。自噬是細(xì)胞生活的基礎(chǔ),自噬活性的改變引發(fā)一系列的細(xì)胞功能變化,而過(guò)度的自噬則會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[11]。細(xì)胞自噬的過(guò)程受自噬相關(guān)基因所調(diào)控,目前發(fā)現(xiàn)的自噬相關(guān)基因約31個(gè),Beclin1是首個(gè)被學(xué)者所熟悉的關(guān)鍵自噬啟動(dòng)基因,ULK1能促進(jìn)Beclin1的磷酸化誘導(dǎo)自噬,而LC3是自噬體膜形成的關(guān)鍵蛋白[12]。因此,本研究通過(guò)Rapa誘導(dǎo)HUVECs構(gòu)建自噬模型,探討HUVECs自噬活性改變對(duì)細(xì)胞增殖的影響,為骨修復(fù)材料促血管化提供一定的理論依據(jù)。

mTOR是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的絲氨酸蘇氨酸激酶,是細(xì)胞自噬活化的核心,mTOR信號(hào)通路是氧感受重要自噬信號(hào)通路,對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和增殖起著重要調(diào)控作用,Rapa通過(guò)降低mTOR的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性,上調(diào)細(xì)胞自噬活性[13-15]。既往研究[13,16-22]表明,Rapa作為mTOR蛋白的抑制劑能有效降低mTOR的表達(dá),mTOR作為許多疾病,如卵巢癌、乳腺癌、肝損傷、視網(wǎng)膜病變、阿爾茨海默病及心血管疾病潛在治療靶點(diǎn),在血管形成中起著重要的作用。ULK1是自噬啟動(dòng)的關(guān)鍵因子,通過(guò)磷酸化Beclin1參與自噬體膜的延伸,同時(shí)也是mTOR的負(fù)調(diào)控蛋白[23]。本研究中,經(jīng)Rapa處理HUVECs后ULK1表達(dá)上調(diào),細(xì)胞自噬啟動(dòng),提示ULK1可能參與Rapa對(duì)HUVECs的自噬調(diào)控,但mTOR作為治療的靶點(diǎn)及ULK1在其中的調(diào)控作用可能需要更多的研究證據(jù)。

細(xì)胞受到外界刺激后由Beclin1啟動(dòng)自噬反應(yīng),LC3由非脂質(zhì)型的LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)橹|(zhì)型LC3-Ⅱ參與構(gòu)成自噬小體雙層膜結(jié)構(gòu),進(jìn)而包裹并溶解受損細(xì)胞器或衰老蛋白,釋放能量維持細(xì)胞穩(wěn)定[6,23]。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,Beclin1和LC3-Ⅱ 的蛋白表達(dá)升高,提示自噬已被激活,即Rapa能上調(diào)HUVECs的自噬活性。同時(shí),透射電鏡和MDC自噬熒光檢測(cè)的結(jié)果也顯示,細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)自噬小體形成,自噬熒光表達(dá)增強(qiáng),進(jìn)一步證實(shí)Rapa能增強(qiáng)HUVECs自噬活性。這與其他學(xué)者關(guān)于Rapa能上調(diào)HUVECs的自噬活性的研究結(jié)果一致[20,24]。

自噬作為維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素,其活性的改變對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生的影響已成為研究的焦點(diǎn)。眾多學(xué)者研究結(jié)果顯示,自噬活性改變對(duì)細(xì)胞功能的調(diào)控受疾病種類(lèi)、治療方式以及種屬差異所影響。本課題研究的結(jié)果初步顯示,在一定的時(shí)間內(nèi),激活HUVECs 的自噬活性,細(xì)胞的增殖能力減弱,增殖受到抑制,同時(shí)細(xì)胞管腔形成能力降低。有研究提示,內(nèi)皮細(xì)胞自噬活性對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控具有雙面性,處理的方式、作用時(shí)間都是可能的影響因素。上調(diào)HUVECs 自噬活性能增強(qiáng)過(guò)氧化氫處理后細(xì)胞的增殖能力,而敲低GRB2關(guān)聯(lián)結(jié)合蛋白1(Grb2-associated binder1,GAB1)表達(dá)同樣如此[25-26],但缺血環(huán)境下,自噬活性的改變則對(duì)細(xì)胞增殖起反作用[27]。而在本研究中,Rapa作用48 h后,細(xì)胞的抑制率下調(diào),其中的原因仍需要深入研究。

自噬是細(xì)胞選擇性降解過(guò)程,能消除異常積累的蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器,增加細(xì)胞在低氧環(huán)境存活概率[28]。骨重建中新生血管生成是促進(jìn)新骨形成的重要因素,自噬在種植骨結(jié)合過(guò)程中對(duì)新生血管及新生骨形成的調(diào)控,以及兩者之間的關(guān)系目前仍不清楚。本研究結(jié)果提示,上調(diào)HUVECs自噬活性能抑制細(xì)胞增殖,在此基礎(chǔ)上,仍需繼續(xù)探討在骨組織工程中自噬活性介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖可能的分子機(jī)制,為骨生物材料血管化研究提供新的理論依據(jù)。