王卉卉,朱向玲,吳旭銘,張慧茹,周園園,王安琪,劉 崇,涂佳杰

PU.1作為E26 transformation-specific(ETS)轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一,由Spi1基因編碼,重要的功能區(qū)域包括羧基端高度保守的DNA結(jié)合區(qū),也就是ETS結(jié)構(gòu)域,可以識別擁有GGA(A/T)序列的DNA結(jié)合位點[1]。PU.1主要在造血細(xì)胞中表達(dá),能夠調(diào)控多種免疫細(xì)胞的分化和功能,從而影響一些自身免疫性疾病的病程,比如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)和實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephakmyelitis, EAE)等[2]。課題組前期研究[3]已證實,PU.1可以通過直接靶向巨噬細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞中的FMS樣酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase, FLT3)來促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。同時,許多研究也表明PU.1在T細(xì)胞的發(fā)育及相關(guān)疾病中也發(fā)揮了重要作用,PU.1對于T細(xì)胞的調(diào)控有望在未來成為RA新的藥物靶點[4]。因此該研究利用Cre/LoxP系統(tǒng)和CRISPR/Cas9 技術(shù),構(gòu)建出T細(xì)胞條件性敲除Spi1基因的小鼠,并對其進(jìn)行繁育及基因型鑒定,為進(jìn)一步探索PU.1在T細(xì)胞相關(guān)疾病中的具體作用和潛在機(jī)制提供可靠的模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物所有小鼠的遺傳背景均為C57BL/6,由賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2018-0003。實驗動物均飼養(yǎng)于SPF級動物房,并且所有實驗均通過了安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所動物實驗倫理委員會批準(zhǔn),批準(zhǔn)號為PZ-2022-024。

1.2 主要試劑核酸染料、100bp Ladder DNA Marker和2×HotStrat Taq PCR Master Mix(北京博邁德基因技術(shù)有限公司);Agarose(德國BioFroxx公司);淋巴細(xì)胞分離液(北京達(dá)科為生物科技有限公司);CD4 MicroBeads mouse(德國Miltenyi Biotec公司);山羊抗鼠IgG(美國Proteintech公司);TRIzol、固定/破膜液(美國Thermo Fisher Scientific公司);BCA試劑盒、qPCR試劑(南京諾唯贊生物科技有限公司);PU.1抗體(美國GeneTex公司,貨號:GTX17997);PE抗PU.1流式抗體(美國BioLegend公司,貨號:681307)。

1.3 主要儀器熒光定量PCR儀(上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司);通用型電泳儀DYY-7C型(北京六一生物科技有限公司);Tanon-1600全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)、Tanon-5200成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);QuantStudio 3實時熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);Cytoflex十色流式細(xì)胞儀(美國Bectman Coulter公司)。

1.4 方法

1.4.1T細(xì)胞Spi1條件性敲除小鼠的建立與繁育 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的Cas9酶識別gRNA切割Spi1基因第2外顯子的兩側(cè),隨后將兩個LoxP分別置于切割位點,在淋巴細(xì)胞蛋白酪氨酸激酶(lymphocyte-specific protein-tyrosine kinase,Lck)啟動子的控制下表達(dá)Cre,使用Cre重組酶特異性地切除T細(xì)胞中被LoxP位點標(biāo)記的序列,構(gòu)建策略示意圖見圖1。將Lck-Cre小鼠與Spi1flox/flox小鼠雜交獲得Lck-Cre×Spi1flox/+基因型的F1代雜合子小鼠,再將F1代小鼠進(jìn)行交配,篩選后得到Lck-Cre×Spi1flox/flox基因型的小鼠。

圖1 Lck-Cre×Spi1flox/flox小鼠的構(gòu)建策略示意圖

1.4.2小鼠的基因型鑒定

1.4.2.1 小鼠尾部DNA的提取 小鼠3周齡時,剪取3 mm左右的鼠尾,向EP管中加入50 μl A液(50 μl 5 mol/L氫氧化鈉與4 μl 0.5 mol/L pH 8.0 EDTA溶于10 ml ddH2O所得),使鼠尾沉至管底,置于95 ℃電熱恒溫水箱中進(jìn)行裂解,30 min后取出加入50 μl B液(400 μl 1 mol/L pH 8.0 Tris-HCl溶于10 ml ddH2O所得),于渦旋震蕩器上震蕩并充分

混勻,以3 000 r/min的速度離心5 min,取上清液作為DNA模板。

1.4.2.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳 首先分別進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增反應(yīng)。小鼠Spi1flox/flox基因型的PCR引物為flox×F和flox×R,Lck-Cre基因型的引物為 Primer-1和Primer-2,具體引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為:總體積25 μl;ddH2O 9 μl,2×HotStrat Taq PCR Master Mix 12.5 μl,正反向引物均為1 μl,DNA 1.5 μl。PCR擴(kuò)增程序為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火35 s,72 ℃延伸35 s,35個循環(huán);72 ℃ 5 min終止反應(yīng)。其次取10 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,120 V電泳30 min,用全自動數(shù)碼凝膠圖像系統(tǒng)分析成像并保存。

表1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)引物序列

1.4.3磁珠分選小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞 將小鼠頸椎脫臼處死后,分離脾臟,用PBS清洗2次后包裹于200目細(xì)胞篩網(wǎng)中,加入4 ml淋巴細(xì)胞分離液,將脾臟充分碾碎,收集組織懸液,在液面上添加1ml RPMI 1640 培養(yǎng)基,2 200 r/min離心30 min,收集中間薄膜層于新的15 ml離心管中,用PBS洗滌1次。加入80 μl PBS和20 μl CD4+T細(xì)胞磁珠,4 ℃孵育15 min。添加PBS洗滌1次后,用1 ml PBS重懸,加到已安裝在磁分選器上的分選柱中,待液體自然流盡后,再用PBS洗脫1次,最后取下分選柱,沖出CD4+T細(xì)胞。

1.4.4Western blot檢測小鼠PU.1表達(dá)水平 提取脾臟CD4+T細(xì)胞總蛋白,應(yīng)用BCA法進(jìn)行定量后,按一定比例加入上樣緩沖液,100 ℃恒溫煮沸10 min使其變性。采用10% SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,快速封閉液室溫封閉15 min,加入PU.1一抗(1 ∶1 000),37 ℃孵育1 h,TBST洗3次,6 min/次,加入山羊抗鼠IgG(1 ∶10 000),室溫孵育2 h,TPBS洗3次,6 min/次,PBS洗3 min,化學(xué)發(fā)光成像分析儀進(jìn)行曝光拍照并保存。Image J軟件分析目的條帶灰度值。

1.4.5qPCR檢測小鼠Spi1表達(dá)水平 應(yīng)用TRIzol法抽提脾臟CD4+T細(xì)胞的RNA,將其定量后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,得到的cDNA再進(jìn)行實時熒光定量PCR。逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增程序為:50 ℃ 15 min;85℃ 5 s;4℃ ∞。設(shè)計Spi1基因的qPCR引物為Left Primer: ACTTCACAGAGCTGCAGAGT;Right Primer:TCACCCTCCTCCTCATCTGA;內(nèi)參GAPDH基因的引物為Left Primer:CAAGGTCATCCATGACAACTTTG;Right Pri-mer:GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG。qPCR反應(yīng)體系為:2×AceQ qPCR SYBP Green Master Mix 10 μl,50×ROX Reference Dye 2 0.4 μl,正反向引物均為0.4 μl,cDNA 2 μl,ddH2O補(bǔ)至20 μl。qPCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán);95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。

1.4.6流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠PU.1表達(dá)水平 對脾臟CD4+T細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和固定破膜后,分成Blank組、Spi1flox/flox及Lck-Cre×Spi1flox/flox組,Blank組適量PBS重懸后直接用十色流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析,其余兩組用100 μl PBS重懸,加入PU.1抗體(0.125 μg/106個細(xì)胞),4 ℃孵育30 min。離心棄上清液,適量PBS重懸后,上機(jī)分析最終樣品細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 T細(xì)胞Spi1條件性敲除小鼠的鑒定T細(xì)胞Spi1條件性敲除小鼠的基因型鑒定結(jié)果見圖2A、2B,可見編號1、2、3號在flox擴(kuò)增產(chǎn)物220 bp處有陽性條帶,Cre擴(kuò)增產(chǎn)物460 bp處沒有條帶,為Spi1flox/flox基因型小鼠;編號4、5、6號在flox擴(kuò)增產(chǎn)物220 bp處有陽性條帶,Cre擴(kuò)增產(chǎn)物460 bp處有陽性條帶,為Lck-Cre×Spi1flox/flox基因型小鼠。以上結(jié)果說明初步構(gòu)建出了T細(xì)胞條件性敲除Spi1基因的小鼠。

圖2 Lck-Cre×Spi1flox/flox小鼠的構(gòu)建及基因鑒定結(jié)果

2.2 T細(xì)胞Spi1條件性敲除小鼠的表型驗證Western blot、qPCR及流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)Lck-Cre×Spi1flox/flox小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞的Spi1表達(dá)水平與Spi1flox/flox小鼠相比顯著降低,分析結(jié)果見圖3A-3C。此結(jié)果驗證了條件性敲除小鼠T細(xì)胞中的Spi1已被成功敲除。

圖3 Lck-Cre×Spi1flox/flox小鼠的表型驗證結(jié)果

3 討論

CRISPR是原核生物基因組內(nèi)的一段重復(fù)序列,CRISPR相關(guān)蛋白Cas9是一種內(nèi)切酶,CRISPR/Cas9技術(shù)就是通過利用單鏈向?qū)NA(small guide RNA,sgRNA)介導(dǎo)Cas9與DNA靶序列形成堿基對,對靶位點進(jìn)行切割,進(jìn)而造成DNA位點特異性的雙鏈斷裂,以此達(dá)到對一個或者多個等位基因進(jìn)行可遺傳性修飾的目的。目前,這項技術(shù)在一系列基因治療和生物技術(shù)等多個應(yīng)用領(lǐng)域上都展現(xiàn)出了極大的應(yīng)用前景[5]。隨著基因敲除技術(shù)的廣泛應(yīng)用,基于Cre/LoxP系統(tǒng)的條件性敲除小鼠模型得到了越來越多的關(guān)注。Cre/LoxP系統(tǒng)的構(gòu)建策略是由帶有LoxP序列的基因突變小鼠和帶有Cre重組酶基因的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交并篩選,得到特異性地刪除目的片段的小鼠[6]。LoxP位點是由1個非回文核和2個反向重復(fù)序列組成,Cre是一種可以使2個LoxP位點之間發(fā)生特異性DNA重組的酶,Cre-LoxP 系統(tǒng)具有很高的組織及空間特異性,能夠準(zhǔn)確地控制目的基因在何時何地表達(dá)[7-8]。CRISPR/Cas9技術(shù)與Cre-LoxP系統(tǒng)的結(jié)合具有容易操作、精確靶向等多種優(yōu)點[9],是基因研究領(lǐng)域的重要實驗工具。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的參考序列,Spi1基因位于小鼠的2號染色體上,其中共有5個外顯子,本模型選擇外顯子2作為條件性基因敲除(conditional knockout,CKO)區(qū)域,CKO的有效區(qū)域大小為597 bp,且這段區(qū)域并沒有任何其他已知基因。為了進(jìn)一步研究PU.1對T細(xì)胞的調(diào)控在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病中所起到的作用,以及避免PU.1全身性敲除可能導(dǎo)致胚胎致死的問題[10],采用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組工程技術(shù)以及Cre/LoxP重組系統(tǒng),將Cas9 mRNA、CKO片段的gRNA和含有l(wèi)oxP位點的靶向載體共同注射到受精卵中,Cas9通過識別gRNA先導(dǎo)鏈切割CKO片段的兩側(cè),隨后將兩個loxP分別放置于切割位點,經(jīng)過數(shù)代雜交并篩選后得到基因型為Spi1flox/flox的小鼠。在與Lck-Cre小鼠交配后,Cre重組酶會切割loxP位點,即實現(xiàn)特異性地刪除CKO區(qū)域,從而建立起T細(xì)胞Spi1基因條件性敲除的小鼠模型,同時依據(jù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳法確保小鼠的基因型背景符合預(yù)期,利用qPCR和Western blot及流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠的Spi1表達(dá)水平及敲除效果,證實了PU.1特異性缺陷的小鼠模型建立成功。

既往研究[4]表明,PU.1對T細(xì)胞的前期增殖和后期分化有著重要作用。在自身免疫性疾病中,PU.1對于T細(xì)胞的調(diào)控也扮演著重要角色。例如,在SLE中,PU.1與T細(xì)胞的過度激活有關(guān);在EAE中,PU.1能夠作用于T細(xì)胞來促進(jìn)疾病的進(jìn)展[2]。然而,RA中PU.1對于T細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。因此,借助CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合Cre/LoxP系統(tǒng),成功構(gòu)建出T細(xì)胞中Spi1基因特異性敲除小鼠,有利于在整體動物水平上研究PU.1在T細(xì)胞相關(guān)癌癥及自身免疫性疾病中調(diào)控T細(xì)胞的具體作用機(jī)制,并為相關(guān)藥物靶點的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)和實驗基礎(chǔ)。