張冬梅,張妍楠,秦建華,歐三桃,吳蔚樺

抗中性粒細胞胞質(zhì)抗體(antineutrophil cytoplasmic antibody,ANCA)相關(guān)性血管炎是一類由ANCA導致的以小血管壁炎癥和纖維素樣壞死為特征的一類系統(tǒng)性自身免疫性疾病。ANCA相關(guān)性血管炎的核心發(fā)病機制是ANCAs導致中性粒細胞過度激活,釋放炎性細胞因子、活性氧和裂解酶,從而損傷血管內(nèi)皮細胞[1]。既往對ANCA相關(guān)性血管炎炎癥應答機制并不完全清楚,新近興起的基于NCBI-基因表達綜合(gene expression omnibus,GEO) 數(shù)據(jù)庫等資源的生信分析方法為進一步探索ANCA相關(guān)性血管炎炎癥應答機制提供了可能。該研究擬綜合使用GEO數(shù)據(jù)庫、DAVID 6.8在線平臺對ANCA相關(guān)性血管炎差異表達基因進行篩選、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)和基因本體(gene ontology,GO)富集分析以及識別這些差異基因編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用及通路關(guān)系,最終篩選出ANCA相關(guān)性血管炎炎癥表達候選基因,并通過miRWalk和DIANA-LncBase 數(shù)據(jù)庫預測并構(gòu)建內(nèi)源性競爭性RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)調(diào)控網(wǎng)絡,為進一步進行驗證試驗提供科學基礎,為治療ANCA相關(guān)性血管炎提供新的思路和靶點。

1 材料與方法

1.1 ANCA相關(guān)性血管炎微陣列數(shù)據(jù)集采集及下載從GEO數(shù)據(jù)庫中下載ANCA相關(guān)性血管炎基因表達譜。篩選條件如下:① 關(guān)鍵詞:ANCA相關(guān)性血管炎;② 條目類型:系列(series);③ 研究類型:表達譜分析;④ 屬性:組織;⑤ 物種:人類;⑥ 腎臟組織定位:腎小球。

1.2 篩選差異表達基因利用R軟件(版本: 4.0.2)進行數(shù)據(jù)的預處理。使用R軟件的limma軟件包進行差異表達基因的篩選。將P值小于0.05且logFC(差異倍數(shù))的絕對值大于1 作為篩選差異表達基因的條件,當同時滿足上述條件是認為差異基因的表達具有統(tǒng)計學意義。利用ggplot2軟件包制作差異表達基因的火山圖。利用pheatmap軟件包(版本:1.0.12) 制作前50個差異表達基因的熱圖。

1.3 差異基因富集分析利用DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)在線平臺對所有差異表達基因進行GO和京都基因與基因組百科全書通路(KEGG Pathway)富集分析。設置P<0.05。利用在線繪圖工具(http://www.bioinformatics.com.cn)將富集分析結(jié)果進行可視化,結(jié)果分別以柱狀圖及氣泡圖展示。

1.4 炎癥應答相關(guān)差異基因的PPI網(wǎng)絡構(gòu)建通過上述富集分析,鑒別出富集在炎癥應答集群中的差異表達基因。利用STRING(http://string-db.org/)來識別這些差異基因編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用及通路關(guān)系,并利用作圖軟件Cytoscape將結(jié)果進行可視化(版本: 3.7.1)。

1.5 預測炎癥應答相關(guān)基因微小RNA(microRNA,miRNA)使用在線數(shù)據(jù)庫miRWalk 3.0預測富集在炎癥應答集群中的差異表達基因的miRNA。篩選出同時在TargetScan和 miRDB 數(shù)據(jù)庫中存在的miRNA,建立mRNA-miRNA相互作用網(wǎng)絡,并利用作圖軟件Cytoscape將結(jié)果可視化(版本: 3.7.1)。

1.6 構(gòu)建炎癥相關(guān)基因ceRNA網(wǎng)絡使用DIANA-LncBase v.2數(shù)據(jù)庫篩選與上述miRNA相互關(guān)聯(lián)的長非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)。篩選條件如下:① miRNA與LncRNA相互作用經(jīng)過免疫沉淀法證實;② LncRNA富集在腎臟;③ 評分(pr.score)>0.9。在miRNA-mRNA和lncRNA-miRNA相互作用的基礎上,建立了ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡,利用在線繪圖工具(http://www.bioinformatics.com.cn)將結(jié)果進行可視化,結(jié)果以對沖圖展示。

1.7 關(guān)鍵基因療效評價通過上述PPI分析及ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡構(gòu)建,篩選出富集在炎癥應答集群中的關(guān)鍵差異表達基因CSF1R和TNFRSF1B。通過在線繪圖工具(http://www.bioinformatics.com.cn)繪制關(guān)鍵基因的ROC曲線。ROC曲線采用敏感性、特異性和ROC曲線下面積(area under the curve, AUC)進行解釋,以此來評估關(guān)鍵基因區(qū)分對照組和ANCA相關(guān)性血管炎患者的效能。

1.8 關(guān)鍵差異基因的驗證經(jīng)檢索本院LIS系統(tǒng)及病理診斷系統(tǒng),納入2013年1月-2022年3月在西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院就診的患者,其中ANCA相關(guān)性血管炎15例,微小病變型腎病3例,IgA腎病15例,所有患者均按照腎活檢診斷要求行HE、PAS、Masson染色及電鏡診斷。在光鏡下重新閱片,評估間質(zhì)炎癥細胞浸潤程度,對照組為HE染色光鏡下觀察無明顯炎癥細胞浸潤者納入研究:微小病變性腎病3例,IgA腎病6例,實驗組為15例ANCA相關(guān)性血管炎。以上病例均為初診,取材時未行糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑治療。選擇合適的切片進行免疫組織化學染色,烤片 1 h 后依次進行脫蠟、水化,使用 3%H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶,用枸櫞酸鈉緩沖液在微波爐中進行抗原修復,5%牛血清白蛋白(BSA)常溫封閉 1 h,棄去封閉液后加入一抗稀釋液,切片置于濕盒中放-4 ℃冰箱過夜。次日使用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后繼續(xù)予以二抗稀釋液孵育,室溫孵育30 min后用PBS清洗,加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,顯微鏡下觀察效果,蘇木精復染細胞核,脫水透明后中性樹脂封片,通風處晾干于明場顯微鏡下觀察拍攝。同時將ANCA組的平均光密度值(mean optical density,MOD)值與臨床炎癥指標(包括白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、C反應蛋白)做Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 ANCA相關(guān)性血管炎差異基因的篩選結(jié)果基于上述篩選條件,收集并下載了數(shù)據(jù)集GSE108109。該數(shù)據(jù)集平臺為GPL19983,其中包括6個對照組標本和15個ANCA相關(guān)性血管炎標本。通過R語言對數(shù)據(jù)集GSE108109進行標準化預處理(圖1A)。利用R軟件的limma軟件包,總共得到差異表達基因(DEGs)846個,其中 444個基因表達明顯上調(diào),402個基因表達明顯下調(diào)?；鹕綀D展示了差異基因的表達水平(圖1B)。前10個差異顯著的上調(diào)基因是FCER1G、CYBB、UCP2、LYZ、C1QC、FSCN1、ECM1、NCKAP1L、C3AR1。前10個差異顯著的下調(diào)基因是GSTA2、ALB、AFM、GLYATL1、SLC12A3、CTP4A11、SLC16A12、ATP6V0D2、CALB1、EGF(圖1C)。使用pheatmap軟件包繪制了前50個差異表達基因的熱圖(圖2),每一行代表一個獨立的基因;每一列代表一個獨立的樣本。層次聚類分析表明,根據(jù)mRNA表達的不同模式可以將對照組和ANCA相關(guān)性血管炎患者進行區(qū)分。

圖1 ANCA相關(guān)性血管炎差異表達基因

圖2 ANCA相關(guān)血管炎前50個差異表達基因熱圖

2.2 差異基因富集分析利用DAVID在線分析工具對ANCA相關(guān)性血管炎數(shù)據(jù)集(GSE108109)中差異表達基因進行KEGG富集分析,其結(jié)果見圖3A。KEGG分析顯示差異表達基因主要富集在補體途徑、抗壞血酸和藻酸鹽代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸代謝、蛋白質(zhì)消化和吸收、細胞色素P450對異種物質(zhì)的代謝、癌癥中的蛋白聚糖、耶爾森菌感染、戊糖和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)化、色氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、破骨細胞分化、金黃色葡萄球菌感染、丁酸鹽代謝、藥物-細胞色素P450代謝、百日咳、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑等。同時,對所有差異表達基因的細胞組成、生物過程和分子功能進行了富集分析,結(jié)果見圖3B,發(fā)現(xiàn)其主要富集于炎癥反應、血管生成、細胞遷移的正調(diào)節(jié)、細胞形狀調(diào)節(jié)、外源代謝過程、血紅素結(jié)合、跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、蛋白質(zhì)結(jié)合等。

圖3 ANCA相關(guān)性血管炎差異表達基因富集分析

2.3 炎癥應答相關(guān)差異基因的PPI網(wǎng)絡構(gòu)建通過GO富集分析,共得到37個富集在炎癥應答生物學過程的差異表達基因。利用STRING(http://string-db.org/)構(gòu)建炎癥應答差異基因表達產(chǎn)物的PPI網(wǎng)絡。去除孤立的節(jié)點,并利用Cytoscape軟件可視化,結(jié)果如圖4所示。該網(wǎng)絡包含了34個關(guān)鍵基因,分別是CSF1R、HDAC5、SEMA7A、NRROS、CSF1、C5AR1、PTGER3、ITGB2、TNFRSF11B、FPR3、TNF、RELA、PIK3CG、KNG1、RELB、C3、PYCARD、CD97、C3AR1、CCR1、LYN、TGFB1、ANXA1、CD180、CYBB、FOS、TNFRSF1B、LYZ、HCK、BMP2、VNN1、AXL、NOX4、TLR7。這些差異表達基因可能是調(diào)控炎癥反應及參與炎癥應答的關(guān)鍵候選基因。

圖4 炎癥應答相關(guān)差異表達基因PPI相互作用網(wǎng)絡

2.4 miRNA及ceRNA網(wǎng)絡構(gòu)建共有19個miRNA(如hsa-miR-22-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-92a-3p和hsa-miR-331-3p)、2個下調(diào)基因(PTGER3和FOS)、7個上調(diào)基因(TNFRSF1B、CSF1R、ADGRE5、HDAC5、CD180、AXL和SEMA7A) 在mRNA-miRNA相互作用網(wǎng)絡中(圖5)。通過DIANA-LncBase v.2數(shù)據(jù)庫篩選并構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡,該網(wǎng)絡包含12個miRNA(如hsa-miR-22-3p、hsa-miR-125a-5p和hsa-miR-331-3p)、5個上調(diào)差異表達基因(ADGRE5、AXL、CSF1R、HDAC5和TNFRSF1B),同時包括了19個lncRNA(如KCNQ1OT1、XIST、NEAT1、CASC7和MALAT1等)。值得注意的是,這許多相互作用的調(diào)控軸中包括KCNQ1OT1-hsa-miR-125a-5p-TNFRSF1B (圖6)。

圖5 miRNA-mRNA預測網(wǎng)絡圖

圖6 lncRNA-miRNA-基因調(diào)控對沖圖

2.5 關(guān)鍵炎癥應答基因的篩查及療效評價用Cytoscape中的cytohubba插件篩選關(guān)鍵炎癥應答基因。利用MCC算法篩選出富集在炎癥應答集群中的關(guān)鍵差異表達基因,結(jié)果如表1所示。在PUBMED在線網(wǎng)站上搜索與ANCA相關(guān)性血管報道較少的基因作為新的候選炎癥應答差異表達基因,最終篩選出CSF1R和TNFRSF1B這兩個基因。通過在線繪圖工具(http://www.bioinformatics.com.cn)繪制兩個關(guān)鍵基因的ROC曲線,計算曲線下面積。兩個差異基因CSF1R和TNFRSF1B的曲線下面積均大于0.9(圖7)。說明這兩個基因的表達模式可以將對照組和ANCA相關(guān)性血管炎患者區(qū)分開來。

表1 MCC方法篩選關(guān)鍵炎癥應答差異表達基因

圖7 CSF1R和TNFRSF1B的ROC曲線

2.6 關(guān)鍵差異表達基因的驗證通過免疫組化染色檢測關(guān)鍵炎癥應答基因在ANCA相關(guān)性血管炎患者腎臟組織中的表達,與上述生物信息學分析結(jié)果一致,相比于對照組,CSF1R和TNFRSF1B 在ANCA相關(guān)性血管炎患者中均顯著表達,見圖 8A、8B。計算各組關(guān)鍵基因的平均光密度值,ANCA相關(guān)性血管炎組CSF1R平均光密度值為0.063 6±0.020 0,TNFRSF1B 平均光密度值為0.051 6±0.025 7,IgA腎病組CSF1R平均光密度值為0.037 9±0.006 3,TNFRSF1B 平均光密度值為0.024 5±0.005 5,微小病變組CSF1R平均光密度值為0.027 7±0.007 8,TNFRSF1B 平均光密度值為0.023 4±0.007 6,ANCA相關(guān)性血管炎組的兩個關(guān)鍵基因的平均光密度值均較對照組明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖8C。同時將ANCA組患者的MOD值與臨床炎癥指標(包括白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、C反應蛋白)做Pearson相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)CSF1R組的表達量與中性粒細胞計數(shù)含量呈正相關(guān)(r=0.587,P<0.05),TNFRSF1B組的表達量和血清C反應蛋白含量呈正相關(guān)(r=0.646,P<0.05),見圖9。

圖8 對照組與ANCA組腎組織的 IHC 染色結(jié)果圖 ×400

圖9 ANCA組CSF1R、TNFRSF1B的MOD與炎癥指標的相關(guān)性分析

3 討論

ANCA相關(guān)性血管炎是一類由抗中性粒細胞胞質(zhì)抗體介導的慢性自身免疫性疾病。近來研究證實ANCA可通過免疫系統(tǒng)過度激活、釋放炎性細胞因子溶解酶等機制致病[2]。AAV的發(fā)生和多種免疫細胞相關(guān),目前已經(jīng)有針對B細胞、T細胞和補體[3-4]的新型藥物,除此之外,針對中性粒細胞、單核-巨噬細胞及其相關(guān)衍生因子也是當下治療的研究熱點之一[5]。

本研究通過分析 GSE108109 芯片數(shù)據(jù)集,篩選出 846個差異表達基因,其中 444個基因表達上調(diào),402個基因表達下調(diào)。在KEGG信號通路分析中,發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集在補體和凝血級聯(lián)反應、金黃色葡萄球菌感染、氨基酸代謝等信號通路。在GO生物功能分析中,發(fā)現(xiàn)許多參與炎癥調(diào)控的重要差異表達基因,包括CSF1R、HDAC5、SEMA7A、NRROS、CSF1、C5AR1、PTGER3、ITGB2、TNFRSF11B、FPR3、TNF、RELA、PIK3CG、KNG1、RELB、C3、PYCARD、CD97、C3AR1、CCR1、LYN、TGFB1、ANXA1、CD180、CYBB、FOS、TNFRSF1B、 VNN1、AXL、NOX4、TLR7。因此本研究進一步構(gòu)建了這些炎癥調(diào)控相關(guān)差異基因的ceRNA調(diào)控互作網(wǎng)絡,通過MCC算法篩選出富集在炎癥應答集群中的關(guān)鍵差異表達基因CSF1R和TNFRSF1B,并發(fā)現(xiàn)了包括KCNQ1OT1-hsa-miR-125a-5p-TNFRSF1B在內(nèi)的多條調(diào)控軸。同時在ANCA相關(guān)性血管炎患者腎臟組織上對兩個關(guān)鍵基因的表達進行驗證,其與生信分析結(jié)果一致,證實了CSF1R和TNFRSF1B在ANCA相關(guān)性血管炎患者腎臟中的表達較對照組均顯著升高。

CSF1R是由CSF1R基因編碼的一種細胞表面蛋白,通過與配體CSF1和IL-34結(jié)合,參與調(diào)節(jié)巨噬細胞穩(wěn)態(tài),在先天免疫和炎癥中扮演重要角色。CSF1R最主要配體是CSF1,在腫瘤、炎癥等病理狀態(tài)下,機體CSF1的水平顯著上升,募集巨噬細胞向炎癥部位移動,控制組織的穩(wěn)態(tài)和修復[6-7]。募集巨噬細胞后,局部的CSF1顯著增多以促進巨噬細胞成熟[8]。Lenzo et al[9]認為在穩(wěn)態(tài)條件下和某些炎癥反應中,CSF1R信號在相對較晚的階段控制巨噬細胞譜系的發(fā)展。越來越多的研究證實在ANCA相關(guān)性血管炎中存在眾多與巨噬細胞極化相關(guān)的標志物。對AAV患者的體外和組織學研究顯示,CD206和CD163的表達顯著增加,這些標志物與選擇性激活的巨噬細胞(M2)相關(guān)[10]?；罨木奘杉毎赡茚尫哦喾N炎癥細胞因子,包括IL-6、IL-8等[11-12],從而調(diào)節(jié)ANCA相關(guān)性血管炎的炎癥反應。本研究中GO分析證實CSF1R富集在炎癥調(diào)節(jié)生物作用中,同時ROC曲線證實CSF1R的差異表達可以將正常人和AAV患者進行區(qū)分。在后續(xù)的實驗中觀察到,在ANCA相關(guān)性血管炎腎活檢標本中,CSF1R的表達量較對照組明顯升高。因此推測CSF1/CSF1R通路很可能通過調(diào)控巨噬細胞產(chǎn)生的級聯(lián)反應,從而促進炎癥的發(fā)生,故運用CSF1R抑制劑可能成為ANCA相關(guān)性血管炎潛在的治療策略。

TNFRSF1B是腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF)的成員之一,又稱腫瘤壞死因子受體2(TNFR2),是TNF-α的主要受體之一,參與組織再生的調(diào)控。由于TNF-α的促炎作用,抗TNF-α的藥物被用于治療炎癥和自身免疫性疾病。然而,抗腫瘤壞死因子藥物仍具有局限性,可能是因為其通過兩種不同的TNF受體(TNFR1和TNFR2)實現(xiàn)多效性生物學功能。TNFR1主要介導TNF促凋亡和促炎功能,而TNFR2激活后募集TRAF2、cIAP1/cIAP2[13]、HOIP[14]形成TNFR2信號復合物(SC),有利于免疫調(diào)節(jié)和組織再生。TNFR2在體內(nèi)外可促進調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg)的分化和功能,提示TNFR2是一個關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)因子。因此,選擇靶向TNFR2而不靶向TNF-α更為重要。研究表明TNF-TNFR2信號通路可抑制Th2和Th17的極化緩解氣道過敏炎癥[15],反之,TNF/TNFR2信號通路受損可增強Th2和Th17極化,加重過敏性氣道炎癥[16]。 許多T細胞和ANCA相關(guān)血管炎關(guān)系密切[17-18]。在活動性ANCA相關(guān)血管炎中,Th17相關(guān)的CCL20表達升高,而Th2相關(guān)的CCL22血漿趨化因子表達降低[19],這兩種細胞因子均涉及免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程。結(jié)合本研究結(jié)果分析,TNFR2在ANCA相關(guān)性血管炎患者中表達顯著升高,其相關(guān)通路信號激活,可能促進炎癥的進展。因此,TNFR2抑制劑可能會改善ANCA相關(guān)性血管炎的炎癥反應,成為 ANCA相關(guān)性血管炎治療的新選擇。

本研究還進一步構(gòu)建了炎癥相關(guān)基因ceRNA網(wǎng)絡。其中值得注意的是KCNQ1OT1-hsa-miR-125a-5p-TNFRSF1B調(diào)控軸。lncRNA KCNQ1OT1具有調(diào)節(jié)炎癥的作用,可通過miR-381-3p/ETS2軸調(diào)控ARDS小鼠的炎癥反應[20],也可通過IκBa抑制內(nèi)膜增生血管平滑肌細胞的炎癥和增殖[21]。miR-125a-5p參與調(diào)節(jié)巨噬細胞的激活和炎癥反應[22],通過miR-125a-5p/TRAF6/TAK1軸促進巨噬細胞M2極化,可改善脂多糖(LPS)誘導的炎癥[23]。已有研究[24]證實過表達miR-125a-5p可抑制TNFRSF1B,促進破骨細胞分化。因此,根據(jù)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡推測在ANCA相關(guān)性血管炎中,TNFRSF1B可能受到KCNQ1OT1-hsa-miR-125a-5p-TNFRSF1B軸的調(diào)節(jié),這需要進一步研究證實。

綜上所述,本研究通過生物信息學分析揭示了 ANCA相關(guān)性血管炎中炎癥應答候選基因及可能的分子機制。篩選出CSF1R和TNFRSF1B這兩個參與炎癥調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因,并通過不同的數(shù)據(jù)庫構(gòu)建出嚴密的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡,同時進一步證實了CSF1R和TNFRSF1B在ANCA相關(guān)性血管炎患者腎臟組織中表達明顯升高。這些結(jié)果將有助于闡明ANCA相關(guān)性血管炎發(fā)生、發(fā)展的炎癥相關(guān)分子機制,并為ANCA相關(guān)性血管炎的治療提供全新的潛在的靶點。