陳 敏,陶 靜,朱慧艷

脊髓損傷是一種可致殘疾的嚴(yán)重外傷。研究表明在脊髓損傷發(fā)生后,損傷灶中的小膠質(zhì)細(xì)胞被迅速激活,誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生,并加劇神經(jīng)功能障礙和損傷[1-3],而通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥的治療策略則有助于脊髓損傷的恢復(fù)。由NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3)介導(dǎo)的經(jīng)典炎癥小體途徑可通過(guò)激活下游信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo),引起炎癥介質(zhì)的表達(dá)和釋放,從而引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[4-6]。有研究[5]報(bào)道,在脊髓損傷組織,NLRP3炎性小體的活化水平和其誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)均異常升高。這提示NLRP3炎性小體可能參與脊髓損傷中小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[5]。α-倒捻子素(α-mangostin)是從山竹果皮和樹(shù)皮中提取的多酚類酮,研究顯示,α-mangostin可通過(guò)抑制NLRP3炎性小體的活化來(lái)治療多種炎癥性疾病[7-9]。然而,在脊髓損傷中,α-mangostin是否同樣能夠下調(diào)NLRP3炎性小體來(lái)介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)尚不清楚。因此,該研究通過(guò)建立小膠質(zhì)細(xì)胞體外炎癥模型來(lái)探討α-mangostin作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和主要試劑小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素鏈霉素混合液(美國(guó)Hyclone公司);α-mangostin(浙江博邁科生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司);脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)(美國(guó)Sigma公司);檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-6和IL-18的ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司);CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);兔抗NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein, ASC)、抗裂解型caspase-1(cleaved caspase-3)、抗p65、抗磷酸化p65(phosphorylated p65, p-p65)、抗核p65(nuclear p65)、抗LaminB抗體(美國(guó)CST公司);兔抗GAPDH抗體、辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔二抗(美國(guó)Abcam公司)。ECL試劑、NE-PERTM細(xì)胞核蛋白提取試劑盒(美國(guó)Thermo公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和處理采用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)BV-2細(xì)胞。按處理方式的不同將BV-2細(xì)胞分為6組:正常培養(yǎng)的Ctrl組、LPS與ATP處理的LPS/ATP組、單獨(dú)40 μmol/L α-mangostin處理組(40 μmol/L α-mangostin組)和不同濃度(10、20、40 μmol/L)的α-mangostin干預(yù)組,分別記為L(zhǎng)PS/ATP+10 μmol/L α-mangostin、LPS/ATP+20 μmol/L α-mangostin與LPS/ATP+40 μmol/L α-mangostin。BV-2細(xì)胞分組處理前,按5×104個(gè)/孔接種至96孔板中,37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜后,加入不同濃度α-mangostin(10、20、40 μmol/L)處理4 h后,再參考文獻(xiàn)[10]方法依次采用1 μg/ml的LPS處理5.5 h和5 mmol/L的ATP處理0.5 h以建立BV-2細(xì)胞炎癥模型。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BV-2細(xì)胞,5×104個(gè)/孔接種至96孔板中,首先單獨(dú)采用不同濃度α-mangostin(10、20、40、80 μmol/L)處理細(xì)胞4 h后,每孔加入10 μl的CCK-8試劑繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h,然后根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法在微板測(cè)量?jī)x上測(cè)量每孔在450 nm處的吸光度值。然后再根據(jù)1.2項(xiàng)中的方法對(duì)BV-2細(xì)胞進(jìn)行分組處理后,按前述方法測(cè)量每組細(xì)胞在450 nm處的吸光度值。每組細(xì)胞的吸光度值為細(xì)胞的增殖活力。

1.4 ELISA實(shí)驗(yàn)取各組BV-2細(xì)胞的培養(yǎng)上清液,4 ℃下2 240 r/min離心10 min后,去除底層沉淀,采用ELISA試劑盒并參考說(shuō)明書(shū)方法測(cè)量上清液中的IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α含量。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)分別采用含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩和NE-PERTM試劑盒提取各組BV-2細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中的蛋白質(zhì)。BCA法測(cè)定蛋白濃度,取30 μg等量的蛋白樣品通過(guò)10%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行分離,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上后,5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉。加入稀釋后的一抗置于4 ℃下孵育過(guò)夜,一抗分別為:NLRP3(1 ∶500)、ASC(1 ∶1 000)、IL-1β(1 ∶500)、cleaved caspase-1(1 ∶800)、p65(1 ∶1 000)、p-p65(1 ∶1 000)、LaminB(1 ∶2 000)和GAPDH(1 ∶2 000)。次日加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔二抗(1 ∶5 000),并在室溫下孵育1 h。最后加入ECL試劑在凝膠成像系統(tǒng)中對(duì)膜進(jìn)行可視化,并分別以GAPDH和LaminB作為胞質(zhì)和胞核蛋白的內(nèi)參,利用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 α-mangostin保護(hù)LPS/ATP誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞損傷CCK-8法檢測(cè)結(jié)果表明各組間的細(xì)胞增殖活力差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=112.615、327.196,P<0.05)。與Ctrl組相比,低濃度(10、20、40 μmol/L)的α-mangostin對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活力無(wú)明顯影響(P>0.05),而高濃度(80 μmol/L)的α-mangostin可顯著降低細(xì)胞的增殖活力(P<0.05);與Ctrl組相比,LPS/ATP組細(xì)胞增殖活力明顯降低(P<0.05),但低濃度(10、20、40 μmol/L)的α-mangostin可顯著改善LPS/ATP對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活力的抑制作用(P<0.05),高濃度(80 μmol/L)α-mangostin可促進(jìn)LPS/ATP對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的損傷(P<0.05)。見(jiàn)圖1?；诖?40 μmol/L的α-mangostin對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性,但對(duì)LPS/ATP誘導(dǎo)的損傷的保護(hù)作用最強(qiáng),因此單獨(dú)α-mangostin處理組中使用40 μmol/L。

圖1 CCK-8檢測(cè)各組小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活力

2.2 各組小膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,各組間IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α的含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=426.184、268.545、414.872、321.368,P<0.05)。與Ctrl組相比,40 μmol/L α-mangostin組小膠質(zhì)細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α含量均無(wú)明顯改變(P>0.05),而LPS/ATP組的上清液中均顯著增加(P<0.05);與LPS/ATP組相比,不同濃度α-mangostin干預(yù)組上清液中炎癥因子IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α含量隨α-mangostin濃度的增加而依次降低,其中以LPS/ATP+40 μmol/L α-mangostin組降低程度最為明顯(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組小膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥因子IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α含量的比較

2.3 各組小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的表達(dá)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,各組間NLRP3、ASC、cleaved caspase-1和IL-1β的表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=594.310、392.621、511.531、416.508,P<0.05)。與Ctrl組相比,40 μmol/L α-mangostin組小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、cleaved caspase-1和IL-1β表達(dá)均無(wú)明顯差異(P>0.05),LPS/ATP組小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3、ASC、cleaved caspase-1和IL-1β的蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.01);與LPS/ATP組相比,不同濃度α-mangostin干預(yù)組中NLRP3、ASC、cleaved caspase-1和IL-1β的蛋白表達(dá)呈α-mangostin濃度依賴性而顯著降低(P<0.05),并以LPS/ATP+40 μmol/L α-mangostin組的降低最為明顯(P<0.01),見(jiàn)圖2。

圖2 各組小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3小體相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、cleaved caspase-1和IL-1β的表達(dá)

2.4 各組小膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB途徑的表達(dá)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,各組間p-p65/p65比值以及細(xì)胞核中p65的表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=501.839、514.842,P<0.05)。與Ctrl組相比,40 μmol/L α-mangostin組小膠質(zhì)細(xì)胞中p-p65/p65比值無(wú)明顯變化(P>0.05),LPS/ATP組小膠質(zhì)細(xì)胞中p-p65/p65比值顯著升高(P<0.05);與LPS/ATP組相比,不同濃度α-mangostin干預(yù)組中p-p65/p65比值隨α-mangostin濃度升高而顯著降低(P<0.05),其中以LPS/ATP+40 μmol/L α-mangostin組的降低趨勢(shì)最為明顯(P<0.01),見(jiàn)圖3A、3B。隨后,再次應(yīng)用Western blot檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞核中p65改變,結(jié)果顯示,與Ctrl組相比,40 μmol/L α-mangostin組小膠質(zhì)細(xì)胞核中p65無(wú)明顯改變(P>0.05),LPS/ATP組小膠質(zhì)細(xì)胞核中p65表達(dá)顯著升高(P<0.01);與LPS/ATP組相比,不同濃度α-mangostin組中p65均顯著降低(P<0.05),其中以LPS/ATP+40 μmol/L α-mangostin組的降低最為明顯(P<0.01),見(jiàn)圖4A、4B。

圖3 各組小膠質(zhì)細(xì)胞中p-p65/p65比值變化

圖4 各組小膠質(zhì)細(xì)胞核中p65表達(dá)

3 討論

α-mangostin具有多種生物活性和藥理作用,包括可以調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的活性[5-6,11-12]。本研究顯示,α-mangostin可通過(guò)下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路來(lái)降低NLRP3炎癥小體的激活水平,從而改善LPS/ATP誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。這表明α-mangostin可能具有改善神經(jīng)炎癥損傷的效果。

NLRP3炎癥小體在多種炎癥性疾病中起關(guān)鍵作用,包括神經(jīng)病變和其他神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病。神經(jīng)炎癥損傷導(dǎo)致NLRP3的異常激活,可能與過(guò)度積聚的炎性細(xì)胞因子刺激小膠質(zhì)細(xì)胞活化與增殖有關(guān)[5,13-14],然后通過(guò)引起膠質(zhì)屏障形成和膠質(zhì)瘢痕轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與功能的不可逆損傷[13]。本研究結(jié)果顯示,通過(guò)降低NLRP3、ASC和cleaved caspase-1的表達(dá)水平,并抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,α-mangostin抑制了LPS和ATP聯(lián)合誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的激活。之前的研究也支持了α-mangostin調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞和NLRP3炎癥小體的活性和功能[9,15]。因此,本研究證明了α-mangostin通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中的NLRP3炎癥小體的激活,改善了神經(jīng)炎癥損傷的作用。這使得α-mangostin成為潛在的治療神經(jīng)炎癥性疾病的藥物選擇。

NF-κB的活化是NLRP3炎癥小體激活的關(guān)鍵[16],同時(shí),NF-κB在小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥中也發(fā)揮著重要作用[17-19]。本研究顯示α-mangostin可以顯著抑制LPS/ATP作用下小膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的激活,并且這種抑制作用與α-mangostin的濃度相關(guān),隨著濃度的增加,對(duì)NF-κB的抑制效果越明顯。這與以前關(guān)于α-mangostin抗炎作用的研究一致。例如,Guan et al[20]報(bào)道α-mangostin通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)的Toll樣受體4的表達(dá)和NF-κB的激活來(lái)減輕小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥。Zuo et al[21]在佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠模型中發(fā)現(xiàn),α-mangostin可以顯著降低NF-κB通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和磷酸化,抑制p65的核易位,從而發(fā)揮抗炎功能,改善關(guān)節(jié)病變[21]。以上研究均表明,α-mangostin可以顯著抑制NF-κB的激活,從而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的活化。

綜上所述,α-mangostin通過(guò)抑制NF-κB的激活抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的活化。因此,α-mangostin可改善神經(jīng)炎癥和小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥性損傷。α-mangostin有可能成為防治繼發(fā)性脊髓損傷過(guò)程中的潛在臨床藥物。