周 瑩,武栗妃,3,杜文靜,曹濟民

胸主動脈瘤(thoracic aortic aneurysm, TAA)為胸主動脈直徑是正常動脈直徑的1.5倍以上,與基質(zhì)降解、彈力板斷裂、平滑肌表型轉(zhuǎn)換、炎癥浸潤等密切相關(guān)[1]。TAA易并發(fā)破裂,死亡率極高,目前無有效藥物[2],因此尋找治療TAA的藥物迫在眉睫。

多巴胺受體根據(jù)其生物活性和藥理學(xué)性質(zhì)可以分為一型受體和二型受體,一型受體包括多巴胺受體1(dopamine receptor D1, D1DR)和多巴胺受體5(dopamine receptor D5, D5DR);二型受體包括多巴胺受體2(dopamine receptor D2, D2DR)、多巴胺受體3(dopamine receptor D3, D3DR)和多巴胺受體4(dopamine receptor D4, D4DR)[3]。有研究顯示激活多巴胺一型受體可通過其下游的環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)抑制NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-, LRR- and pyrin domain-containing protein 3, NLRP3)炎癥小體的活化,從而抑制炎癥反應(yīng)[3-4];直接抑制NLRP3也可減輕主動脈瘤[5-6]。此外,激動多巴胺一型受體也可以抑制平滑肌細(xì)胞的增殖[7]。因此,激活多巴胺一型受體可能在TAA中具有保護(hù)作用。該研究采用多巴胺一型受體激動劑非諾多泮(fenoldopam, FNDP)探究其在TAA中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性3周齡C57BL/6J小鼠25只,體質(zhì)量9～10 g,購自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SCXK(晉)2019-0004]。小鼠購買后常規(guī)飼養(yǎng)3 d后開始正式實驗(飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級)。在實驗過程中,遵循3R原則的指導(dǎo),給予實驗動物以人道主義關(guān)懷,倫理批準(zhǔn)編號為SYDL2023020。

1.2 主要試劑FNDP(SML0198)和β-氨基丙腈(β-aminopropionitrile,BAPN)(A3134)購自美國Sigma公司;抗白細(xì)胞分化抗原68(cluster of differentiation 68,CD68)單克隆抗體(ab283654)、抗基質(zhì)金屬酶2(matrix metallopeptidase 2, MMP2)單克隆抗體(ab86607)和抗基質(zhì)金屬酶9(matrix metallopeptidase 9,MMP9)單克隆抗體(ab228402)購自美國Abcam公司;兔超敏二步法試劑盒(PV9001)及DAB顯色試劑盒(ZLI-9019)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司; 彈力蛋白(Elastin)染色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;明膠酶譜電泳試劑盒購自南京信帆生物技術(shù)有限公司;TRIzol 購自美國Ambion公司;RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司;熒光定量試劑盒購自中國聚合美生物科技有限公司;RNA引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;PCR儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 小鼠分組及TAA模型的建立將25只小鼠分為三組:對照組(n=5),飲用無菌水;BAPN組(n=10),飲用含有BAPN[1.0 g/(kg·d)]的無菌水;BAPN + FNDP組(n=10),在飲用含有BAPN[1.0 g/(kg·d)]的無菌水基礎(chǔ)上,第14天開始每隔1 d腹腔注射FNDP(10 mg/ kg),共注射7次;對照組和BAPN組注射等體積的生理鹽水。

1.4 胸主動脈組織取材及處理28 d造模結(jié)束后,用3%異氟烷對小鼠進(jìn)行麻醉,打開胸腔,從心尖部灌注生理鹽水將心腔及主動脈內(nèi)血液沖洗掉,將心臟及主動脈及連通的腎臟取下進(jìn)行拍照;然后將胸主動脈用4%多聚甲醛固定,逐級乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片,并將切片貼敷于載玻片上。

1.5 Elastin染色對制備好的石蠟切片進(jìn)行烤片(65 ℃,2 h)、二甲苯脫蠟、梯度乙醇復(fù)水、PBS清洗,再用碘液孵育切片5 min,PBS清洗;將硫代硫酸鈉溶液滴于切片上,5 min后用流水沖洗;用醛品紅染色2 min后再用水洗;用碘橙黃G染液滴染后,水洗,二甲苯透明,中性樹脂封片,拍照。

1.6 免疫組化染色烘烤組織切片(65 ℃,2 h),然后脫蠟、復(fù)水、蒸餾水清洗;將切片置于100 ℃的1×檸檬酸鈉溶液中20 min進(jìn)行抗原修復(fù);用無菌水清洗切片,再用內(nèi)源性過氧化酶抑制劑室溫孵育切片20 min,無菌水清洗,用血清室溫封閉切片20 min,甩干,滴加一抗抗體,4 ℃濕盒過夜;次日將切片在室溫下平衡30 min,PBS清洗;滴加辣根過氧化酶標(biāo)記二抗抗體,室溫孵育30 min,PBS清洗;DAB顯色;之后進(jìn)行蘇木精染色,鹽酸分化、脫水、透明、封片。

1.7 明膠酶譜用明膠酶譜法測定血清中的MMP2和MMP9的活性。收集小鼠血液,離心(1 000 r/min,10 min),獲得上層血清。采用非還原上樣緩沖液對血清進(jìn)行制樣,在含有0.2%明膠的分離膠和濃縮膠中進(jìn)行電泳;膠體用A液室溫?fù)u床孵育48 h;B液37 ℃孵育5 h;考馬斯亮藍(lán)染色,脫色液脫色直到條帶清晰,之后采圖。

1.8 RT-PCR將獲取的小鼠胸主動脈組織用TRIzol方法提取總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒方法將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,之后用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行cDNA擴增。所用引物序列見表1。

表1 引物序列

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗,多組間比較采用方差分析;P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TAA中多巴胺受體轉(zhuǎn)錄水平的變化與對照組相比,給予BAPN 28 d后,小鼠胸主動脈形成瘤體,Elastin染色可見胸主動脈彈力纖維出現(xiàn)紊亂,見圖1A、1B,提示造模成功。與對照組相比,BAPN組的D1DR、D5DR及D3DR的mRNA表達(dá)水平顯著降低(D1DR:P<0.05; D5DR:P<0.01; D3DR:P<0.01);但D2DR的mRNA表達(dá)水平顯著升高 (P<0.01),見圖1C-1F。

2.2 FNDP對小鼠TAA進(jìn)展的抑制作用與對照組相比,BAPN組小鼠胸主動脈肉眼可見膨大,見圖2A箭頭所示,而BAPN+ FNDP組小鼠的胸主動脈膨大程度較BAPN組小鼠明顯減輕,見圖2A。BAPN組10只小鼠有7只形成動脈瘤,TAA發(fā)生率為70%,7只發(fā)生死亡,其中3只因動脈瘤破裂而死亡,破裂率為30%;而在BAPN+FNDP組,10只小鼠僅有3只形成動脈瘤,TAA發(fā)生率為30%,且僅有2只死亡,其中1只因動脈瘤破裂發(fā)生死亡,破裂率為10%。對照組5只小鼠全部存活,且血管形態(tài)無異常,見圖2B、2C。與BAPN組相比,BAPN+FNDP組小鼠生存率顯著增高(P<0.01),見圖2C。提示FNDP具有抑制TAA進(jìn)展、降低TAA發(fā)生率和提高TAA生存率的作用。

圖2 FNDP對小鼠TAA進(jìn)展的抑制作用

2.3 FNDP對彈力纖維斷裂和基質(zhì)降解的改善作用彈力纖維染色結(jié)果顯示,與BAPN組小鼠相比,BAPN+FNDP組小鼠的胸主動脈彈力纖維紊亂情況明顯減輕,見圖3A。免疫組化結(jié)果顯示,各組小鼠胸主動脈組織內(nèi)的MMP2(圖3B、3D)和MMP9(圖3C、3D)的陽性信號差異有統(tǒng)計學(xué)意義(MMP2:F=26.958 0,P<0.01;MMP9:F=21.041 4,P<0.01)。與對照組相比,BAPN組MMP2和MMP9表達(dá)增加(MMP2:P<0.01;MMP9:P<0.01);而相對于BAPN組,BAPN+FNDP組的MMP2和MMP9表達(dá)減少(MMP2:P<0.01;MMP9:P<0.01)。小鼠血清中的MMP2的活性檢測結(jié)果顯示,BAPN+FNDP組血清MMP2的活性顯著低于BAPN組(P<0.05),但血清MMP9(圖3E、3F)活性無顯著差異(P=0.147 5)。

圖3 FNDP對彈力纖維斷裂和基質(zhì)降解的改善作用

2.4 FNDP對巨噬細(xì)胞浸潤和炎癥因子表達(dá)的抑制作用免疫組化結(jié)果顯示,各組小鼠動脈組織中巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68的表達(dá)(圖4A、4B)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=43.3171,P<0.01)。相比于對照組,BAPN組CD68表達(dá)增加(P<0.01);而相較于BAPN組,BAPN+FNDP組CD68表達(dá)明顯降低(P<0.01)。

圖4 FNDP對巨噬細(xì)胞浸潤和炎癥因子表達(dá)的抑制作用

RT-PCR結(jié)果顯示,各組小鼠動脈組織中炎癥因子的表達(dá)(圖4C-4F)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(MCP-1:F=17.757 5,P<0.01;IL-6:F=102.046 0,P<0.01;TNF-α:F=13.632 3,P<0.01;IL-1β:F=30.139 4,P<0.01)。與對照組相比,BAPN組小鼠動脈炎癥因子MCP-1、IL-6、TNF-α、IL-1β水平明顯增加(MCP-1:P<0.01; IL-6:P<0.01;TNF-α:P<0.01; IL-1β:P<0.01);而與BAPN組相比,BAPN+FNDP組小鼠動脈炎癥因子MCP-1、IL-6、TNF-α、IL-1β的水平下降 (MCP-1:P<0.05; IL-6:P<0.05;TNF-α:P<0.01; IL-1β:P<0.01)。

2.5 FNDP對TAA平滑肌細(xì)胞收縮表型的影響動脈平滑肌細(xì)胞在正常功能狀態(tài)下表達(dá)收縮蛋白,如α-SMA和SM22α。RT-PCR結(jié)果顯示(圖5),各組小鼠動脈組織中α-SMA的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.756 4,P<0.01),然而SM22α表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.352 3,P=0.087 6)。相比于對照組,BAPN組α-SMA和SM22α的表達(dá)顯著下降(α-SMA:P<0.01;SM22α:P<0.05);然而,相較于BAPN組,FNDP + BAPN組中α-SMA和SM22α的表達(dá)無顯著差異(α-SMA:P=0.128 5;SM22α:P=0.094 3)。

圖5 α-SMA和SM22α 的mRNA相對表達(dá)水平

3 討論

FNDP在不同的疾病中均表現(xiàn)出抗炎作用。Joseph et al[8]發(fā)現(xiàn)腹腔注射FNDP可減輕糖尿病內(nèi)毒素小鼠的高血糖和全身炎癥反應(yīng);Amatya et al[9]發(fā)現(xiàn)FNDP可降低腎臟細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng);之前的研究[10]也顯示FNDP可激動巨噬細(xì)胞膜上的多巴胺一型受體,使胞內(nèi)cAMP生成增多,繼而抑制巨噬細(xì)胞的炎癥因子表達(dá),緩解心衰小鼠心肌早期炎癥。在本研究中,FNDP抑制了TAA管壁巨噬細(xì)胞的浸潤,降低了炎癥因子的產(chǎn)生,而炎癥反應(yīng)是TAA的一個重要病理特征,這提示FNDP可能通過減輕炎癥反應(yīng)從而減緩TAA的進(jìn)展,但對于減緩TAA是否通過cAMP及其下游信號分子仍待進(jìn)一步研究。

細(xì)胞外基質(zhì)成分包括蛋白聚糖、糖蛋白、層粘連蛋白、膠原蛋白和彈性板等,這些蛋白共同維持著血管壁的彈性[11]。MMP2和MMP9可以降解細(xì)胞外基質(zhì),炎癥細(xì)胞釋放的炎性因子會刺激動脈壁使得MMP9的表達(dá)量增加[1]。此外,有研究[12]顯示可通過D5DR調(diào)節(jié)多巴胺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使得腦腫瘤中MMP9表達(dá)降低。在本研究中,小鼠腹腔注射FNDP后,細(xì)胞外基質(zhì)降解減緩可能與炎癥反應(yīng)的減輕有關(guān),也可能與FNDP激活多巴胺一型受體信號通路密切相關(guān),這可能是FNDP在TAA中具有保護(hù)作用的機制。

平滑肌細(xì)胞可以在收縮表型和合成表型之間轉(zhuǎn)換。收縮型平滑肌細(xì)胞會表達(dá)高水平的收縮蛋白,包括α-SMA和SM22α等;平滑肌細(xì)胞在受到刺激的情況下會轉(zhuǎn)換為合成表型。在TAA中,平滑肌細(xì)胞會由收縮表型轉(zhuǎn)化為合成表型,這意味著平滑肌細(xì)胞收縮蛋白的表達(dá)減少,對于主動脈壁強度和正常收縮功能的維持不利[1, 13]。本研究在BAPN誘導(dǎo)的TAA中,主動脈平滑肌細(xì)胞收縮蛋白α-SMA和SM22α顯著降低,與文獻(xiàn)[14]報道一致。過往研究[7, 15]顯示激動多巴胺一型受體可以通過硫化氫影響小鼠平滑肌細(xì)胞的增殖,本研究表明FNDP對平滑肌收縮蛋白α-SMA和SM22α無顯著影響。這提示FNDP對TAA進(jìn)展的減緩可能與平滑肌細(xì)胞向收縮表型轉(zhuǎn)化無關(guān)。