楊肖念,鄒多宏,2

糖尿病、牙周炎和骨質(zhì)疏松癥等疾病患者,其骨缺損常伴隨著高活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平環(huán)境,會損害口腔種植體植入后的骨整合,不利于口腔種植術(shù)后獲得良好預(yù)后[1]。引導(dǎo)骨再生(guided bone regeneration,GBR)技術(shù)在臨床實(shí)踐中已被廣泛用于治療口腔頜面部骨缺損,是實(shí)現(xiàn)成骨最有效、最可靠的方法之一。 GBR 膜充當(dāng)機(jī)械屏障,阻止快速生長的非成骨細(xì)胞(如上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)進(jìn)入骨缺損,并為緩慢生長的成骨細(xì)胞的增殖和分化提供空間,從而促進(jìn)骨再生[2]。在高 ROS 水平的環(huán)境中,過量的 ROS 激活破骨細(xì)胞的形成,并阻礙骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化,從而不利于骨愈合[3]。該研究使用殼聚糖(chitosan,CS),通過蒸發(fā)干燥和取向冷凍制備出具有光滑致密、粗糙疏松多孔的雙層屏障膜,同時負(fù)載單寧酸(tannic acid,TA),使其兼?zhèn)淇山到庑?、生物相容性、抗菌性?ROS 清除作用,探究其作為 GBR 膜使用的可行性。

1 材料與方法

1.1 合成材料中粘度殼聚糖(200～400 mPa.s,上海阿拉丁生化科技股份有限公司),冰醋酸(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),單寧酸(上海麥克林生化科技股份有限公司)。

1.2 主要試劑和儀器氨水(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),嗎啉乙磺酸一水合物(MES)、4-羧基苯硼酸(上海麥克林生化科技股份有限公司), 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、 N-羥基琥珀酰亞胺(NSH)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司), 1, 1-二苯基- 2 苦基肼(DPPH)(北京索萊寶科技有限公司), α-MEM、胰酶消化液、青霉素-鏈霉素溶液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);活死細(xì)胞染色試劑盒(美國 Proteintech 公司);胎牛血清(美國 Gibco 公司); CCK-8 試劑(日本同仁公司)。酶標(biāo)儀、二氧化碳孵育箱(美國 Thermo 公司);掃描電子顯微鏡(Supra 40,德國蔡司公司);高溫高壓滅菌鍋[致微(廈門)儀器有限公司];傅里葉紅外光譜儀(Nicolet 8700, 美國熱電尼高力儀器公司);冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1CS雙層膜制備 稱取2 g殼聚糖放入100 ml 0.2 mol/L冰醋酸水溶液中,磁子攪拌至溶解,離心除泡,倒入方形培養(yǎng)皿中,放在 40 ℃ 加熱臺上24 h后自蒸發(fā)成膜,取出后放入氨水中浸泡除酸,去離子水沖洗幾遍后置于 40 ℃加熱臺上,干燥后備用。將干燥后的 CS 膜平鋪在銅板上,滴加2%的CS溶液,刮刀刮平,放入液氮中, 10 s后取出,放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48 h以獲得CS雙層膜。

1.3.2CS@TA雙層膜的制備 CS雙層膜接枝TA前預(yù)處理:配制 0.1 mol/L 的 MES 溶液 100 ml,pH=6,分別加入1 g 4-羧基苯硼酸、 100 mg NSH和200 mg EDC后調(diào)節(jié)pH至 7.5, 30 min 后加入 1 g CS 雙層膜,磁子攪拌6 h,結(jié)束后用去離子水沖洗薄膜以去除表面未反應(yīng)的4-羧基苯硼酸。

CS 雙層膜接枝TA:取出分別放入濃度為0.02%、0.04%、0.08%、0.16% 50 ml 水溶液中,放入37 ℃搖床6 h,結(jié)束后用去離子水沖洗薄膜以去除表面未反應(yīng)的TA,最終以獲得負(fù)載不同含量TA的雙層殼聚糖屏障膜,根據(jù)負(fù)載TA含量分別記為CS@TA1、CS@TA2、CS@TA3、 CS@TA4, CS雙層膜接枝TA前預(yù)處理、未接枝TA的CS雙層膜記為 CS@TA0),結(jié)束后將各組雙層膜臨界點(diǎn)干燥后真空儲存以備后續(xù)使用。其中,根據(jù)各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果,挑選出CS雙層膜上最佳TA負(fù)載量組的雙層膜記為CS@TA。

1.3.3結(jié)構(gòu)表征 低真空下噴金后使用掃描電鏡在15.0 kV的加速電壓下拍攝樣品的光滑面、粗糙面與截面,取 CS、 TA 粉末和 CS@TA0、 CS@TA1、 CS@TA2、CS@TA3、 CS@TA4各組雙層膜采用傅立葉變換紅外光譜儀分析各成分。

1.3.4DPPH·自由基清除實(shí)驗(yàn) 按照試劑盒使用說明配制DPPH工作液,將 CS@TA0、CS@TA1、CS@TA2、CS@TA3、CS@TA4雙層膜制備成直徑5 mm的圓形樣品,分別放置于48孔板中,每孔加入200 μl DPPH工作液,Blank組只加200 μl DPPH工作液,37 ℃避光孵育30 min后取出,將48孔板內(nèi)的液體轉(zhuǎn)移至96孔板中,使用酶標(biāo)儀讀取在517 nm處的吸光度值。吸光度值記為A,根據(jù)公式DPPH清除率=[A空白-A(CS@TA0、CS@TA1、CS@TA2、CS@TA3、CS@TA4)]/A空白×100計(jì)算各組雙層膜的 DPPH·自由基清除效率。

1.3.5細(xì)胞生物相容性實(shí)驗(yàn) 將CS@TA0、CS@TA3、CS@TA4雙層膜制備成直徑5 mm的圓形樣品,經(jīng)高溫高壓消毒滅菌。

CCK-8 細(xì)胞毒性檢測:在48孔板內(nèi)接種細(xì)胞,每組每個時間點(diǎn)3個復(fù)孔,每孔接種5×103個 MC3T3-E1細(xì)胞。接種24 h后加入各組雙層膜,Blank組不加雙層膜材料僅使用培養(yǎng)基培養(yǎng),此后每 3 d 換液1次。在1、4、7 d 時分別取出各組雙層膜,棄去培養(yǎng)基,使用 PBS 清洗2次,每孔加入 CCK-8 溶液(CCK-8 ∶α-MEM=1 ∶9) 200 μl , 37 ℃孵2 h后將48孔板內(nèi)孵育后的液體轉(zhuǎn)移至96孔板,每孔100 μl,使用酶標(biāo)儀讀取每孔在450 nm處的吸光度值。

細(xì)胞活力檢測:在48孔板內(nèi)每孔接種1×104個MC3T3-E1細(xì)胞,每組3個復(fù)孔,接種24 h后加入各組雙層膜,Blank組不加雙層膜材料僅使用培養(yǎng)基培養(yǎng),此后每3 d換液1次。在1、4、7 d時分別取出各組雙層膜,棄去培養(yǎng)基,PBS 清洗2次,后按照活死細(xì)胞染色試劑盒使用說明進(jìn)行染色操作,使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn):將CS@TA3雙層膜制備成直徑10 mm的圓形樣品。在每個樣品的粗糙面上接種2×104個MC3T3-E1,24 h后,PBS清洗3次,用4%多聚甲醛固定樣品30 min后 PBS 清洗3次,使用掃描電鏡拍攝樣品。

1.3.6抗菌實(shí)驗(yàn) 分別將CS@TA0、CS@TA3、CS@TA4雙層膜制備成直徑10 mm的圓形樣品,經(jīng)高溫高壓消毒滅菌。金黃色葡萄球菌(S.aureus)菌液濃度為1.777×108CFU/ml,大腸埃希菌(E.coli)菌液濃度為2.55×108CFU/ml,分別將菌液稀釋1 000倍后取10 μl加入放有雙層膜的24孔板中,每組3個復(fù)孔,Blank組直接加入孔板內(nèi),每組加入500 μl肉湯吹打均勻后,取出后孔加入500 μl PBS,超聲3 min,每孔取出100 μl分別涂抹均于瓊脂板上,放入37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱24 h后觀察和計(jì)數(shù)每個瓊脂板中的菌落數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 樣品表征掃描電鏡可見CS雙層膜光滑面表面致密光滑(圖1A、1B),粗糙面疏松多孔(圖1C、1D),截面可見粗糙面呈縱向有序多孔(圖1E、1F);從FTIR光譜中, CS@TA0 是未負(fù)載單寧酸的純殼聚糖雙層膜,其酰胺I基團(tuán)位于1 650 cm-1處,酰胺 II基團(tuán)位于1 590 cm-1處,TA 中的羧基吸收峰位于1 707 cm-1,苯環(huán)中的C=C吸收峰位于 1 613 cm-1,當(dāng) TA 通過4-羧基苯硼酸接枝到CS雙層膜后, TA中的羧基由原來的1 707 cm-1向左偏移至 1 725 cm-1,峰強(qiáng)度減弱。苯環(huán)中C=C由原來的 1 613 cm-1向右偏移至1 555 cm-1,且形成的峰強(qiáng)度與CS酰胺II基團(tuán)處的峰相延續(xù),形成較寬且弱的峰形,CS中的酰胺 I 基團(tuán)由原來的 1 650 cm-1位移至1 654 cm-1,酰胺II基團(tuán)特征峰被TA中苯環(huán)中C=C拉伸振動掩蓋,由此證明TA成功負(fù)載到CS上(圖1G、1H,其中1H為1G圖中部分放大圖)。

圖1 掃描電鏡下CS@TA雙層膜的微觀結(jié)構(gòu)

2.2 DPPH·自由基清除率未負(fù)載TA 的CS@TA0組, DPPH·自由基清除率僅為13.93,其中負(fù)載TA的各組CS@TA1、CS@TA2、CS@TA3、CS@TA4各組清除率分別可達(dá)到84.80%、87.44%、91.31%、91.30%,與CS@TA0 組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=832.6,P<0.000 1)(圖2A); DPPH 溶液在浸泡各組雙層膜30 min后,顏色由紫色變?yōu)榈S色,表明DPPH溶液中的電子與TA的氫原子完全配對,并形成還原的DPPH(圖2B)。根據(jù)DPPH·自由基清除率結(jié)果,選取清除效率較高的CS@TA3、CS@TA4兩組負(fù)載TA的雙層膜繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同TA負(fù)載量的CS@TA雙層膜的DPPH自由基清除率

2.3 CS@TA雙層膜體外生物相容性CCK-8法檢測結(jié)果顯示,雙層膜與細(xì)胞共培養(yǎng)1、4、7 d后CS@TA0、CS@TA3與Blank組吸光度值無明顯差異,CS@TA4 組1、4、7 d時與Blank 組相比吸光度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.84,P=0.001 9;F=589.8,P<0.000 1;F=839.3,P<0.000 1),但在 4、7 d時的細(xì)胞存活率明顯低于80%,不具有良好的生物相容性,不適宜作為雙層膜的備選材料(圖3A);MC3T3-E1 細(xì)胞接種到CS@TA3雙層膜的粗糙面上24 h,掃描電鏡結(jié)果表明細(xì)胞可以較好地黏附在CS@TA3雙層膜的粗糙面上(圖3B、3C);活死細(xì)胞染色結(jié)果如圖3顯示,活細(xì)胞為綠色熒光,死細(xì)胞為紅色熒光,CS@TA0、CS@TA3組與Blank組的活死細(xì)胞比例無明顯差異,CS@TA4組顯示與Blank組相比有較多的死細(xì)胞存在,且活細(xì)胞數(shù)量明顯較少(圖3D)。

圖3 CS@TA 雙層膜的生物相容性

2.4 CS@TA雙層膜體外抗菌性能與 Blank、CS@TA0組相比,CS@TA3組的E.coli和S.aureus細(xì)菌稀釋涂板結(jié)果顯示細(xì)菌菌落數(shù)明顯減少(圖4A),菌落計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示與Blank組菌落數(shù)相比,CS@TA0(E.coli:F=166.3,P=0.000 2;S.aureus:F=61.82,P=0.001 8)和CS@TA3組(E.coli:F=166.3,P<0.000 1;S.aureus:F=61.82,P<0.000 1)的菌落數(shù)顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4B、4C)。

圖4 CS@TA雙層膜對E.coli和S.aureus的抗菌性能

3 討論

GBR技術(shù)已在臨床廣泛使用,它是利用在骨缺損部位植入屏障膜,阻礙上皮細(xì)胞及結(jié)締組織長入缺損區(qū),達(dá)到屏障作用,以促進(jìn)缺損部位骨組織的修復(fù)與再生。目前臨床上使用的屏障膜分為可吸收和不可吸收兩種,不可吸收性屏障膜需要二次手術(shù)取出,給患者帶來二次創(chuàng)傷,同時術(shù)后增加了感染風(fēng)險(xiǎn);而可吸收性屏障膜術(shù)后無需取出,術(shù)后可在體內(nèi)緩慢吸收降解,但其機(jī)械強(qiáng)度低,缺乏抗菌能力,使其使用仍受到限制[4-6]。此外臨床使用的商用 GBR 屏障膜缺乏一定的抗菌和ROS清除能力[6]。

葡萄氨聚糖是胞外基質(zhì)的重要成分,具有維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、調(diào)節(jié)細(xì)胞活性的功能。殼聚糖作為胞外基質(zhì)成分葡萄氨聚糖的結(jié)構(gòu)類似物,不僅具有良好的生物活性、生物可降解性和親水性,還具有一定的抗菌性能,可以抑制某些細(xì)菌的生長,這種特性使得殼聚糖可以應(yīng)用于制備抗菌材料、藥物緩釋系統(tǒng)等領(lǐng)域。據(jù)報(bào)道殼聚糖可增強(qiáng)細(xì)胞黏附、增殖、成骨細(xì)胞分化和礦化,這些特性使得殼聚糖在組織工程、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[7]。骨缺損常伴有ROS水平升高的問題,這意味著在受損骨組織中存在過多的ROS物質(zhì),如超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基等,這些ROS物質(zhì)會引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡失調(diào),誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡和壞死。這些損傷會導(dǎo)致骨細(xì)胞數(shù)量減少和功能下降,抑制間充質(zhì)細(xì)胞的成骨分化,從而延遲骨重建。間充質(zhì)細(xì)胞是一種具有多重分化潛能的干細(xì)胞,可以分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞等[8-9]。TA是一種具有豐富酚羥基的植物衍生多酚,由于存在多個具有還原性的酚羥基被廣泛認(rèn)為是一種抗炎、抗菌和抗氧化劑[10]。

本實(shí)驗(yàn)通過蒸發(fā)干燥、取向冷凍及冷凍干燥技術(shù)制備出具有光滑致密層和疏松多孔的雙層CS屏障膜。光滑致密層朝向軟組織方向,可有效阻止上皮和結(jié)締組織長入骨缺損區(qū),為骨再生和修復(fù)提供空間;疏松多孔層朝向骨缺損方向,為成骨相關(guān)細(xì)胞提供黏附位點(diǎn)。在此基礎(chǔ),在CS雙層膜上先接枝4-羧基苯硼酸后使其具有硼酯鍵,通過硼酯鍵與TA結(jié)合得到CS@TA雙層膜并形成ROS響應(yīng)性藥物橋接連接體。在遇到高水平ROS時,硼脂鍵發(fā)生斷裂,TA從CS雙層膜中解離緩慢釋放TA清除過多ROS。 DPPH·自由基清除率結(jié)果表明CS@TA雙層膜具有較高的ROS清除效率。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,具有一定TA負(fù)載量的CS@TA雙層膜具有良好的生物相容性;抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CS@TA雙層膜對E.coli和S.aureus均有一定的抑制效果。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CS雙層膜通過雙層結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)兼具了屏障和促細(xì)胞黏附遷移功能,具有良好的生物安全性,同時通過修飾 TA 不僅賦予了 CS@TA雙層膜的良好ROS清除功能,還增強(qiáng)了其抗菌作用。