梁林輝,梁大偉 ,章斌,林浩

(雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)院,四川 雅安 625000)

川牛膝(CyathulaofficinalisKuan,CNX)為莧科植物川牛膝的干燥根又稱為白牛膝、拐牛膝、甜牛膝,具有逐瘀通經(jīng),通利關(guān)節(jié),利尿通淋的功效[1]。川牛膝在治療高血壓病中使用非常廣泛,通過中醫(yī)藥治療高血壓病總體用藥規(guī)律發(fā)現(xiàn),常用中藥中川牛膝使用率排第二[2]。同時(shí),在高血壓病診治中,將川牛膝作為降壓的基礎(chǔ)方之一來使用,降壓效果非常明顯[3]。在藥理學(xué)研究方面,發(fā)現(xiàn)川牛膝醇提物可能通過下調(diào)肺組織PI3K/Akt信號(hào)通路來抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而降低肺血管重構(gòu),因此可以降低野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓[4]。目前,川牛膝治療高血壓的具體作用機(jī)制不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析可作為一種研究由復(fù)雜成分的中藥或制劑的有效手段來揭示藥物發(fā)揮作用的藥理機(jī)制。因此,本研究借用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,通過分析川牛膝的有效成分,預(yù)測(cè)川牛膝治療高血壓的靶點(diǎn)和信號(hào)通路,期望揭示川牛膝治療高血壓的分子機(jī)制,為川牛膝進(jìn)一步臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究提供參考。

1 方法

1.1 川牛膝的活性成分和靶蛋白的獲得

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform ,TCMSP)獲得川牛膝化學(xué)成分,然后基于藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)吸收、分布、代謝、排泄(absorption、distribution、metabolism、excretion,ADME)中的口服利用度(Oral Availability,OB)≥20%,類藥性(Drug Like,DL)≥0.1進(jìn)行活性成分篩選[5],同時(shí)通過查閱已公開發(fā)表文獻(xiàn)資料川牛膝中重要藥理活性的成分,結(jié)合兩種途徑獲得川牛膝化學(xué)成分。將篩選出的活性成分再通過TCMSP、本草組鑒(High-throughput Experiment and Reference Guided Database,HERB)數(shù)據(jù)庫中及瑞士靶點(diǎn)預(yù)測(cè)工具(Swiss Target Prediction,STP)獲取對(duì)應(yīng)的靶蛋白,利用通用蛋白質(zhì)資源庫(Universal Protein,Uniprot)進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 川牛膝治療肺高血壓關(guān)鍵靶點(diǎn)的獲取

通過在線《人類孟德爾遺傳》(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)數(shù)據(jù)庫,藥物數(shù)據(jù)庫(Drugbank),治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(Therapeutic Target Database,TTD),毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫(Comparative Toxicogenomics Database,CTD)和疾病基因網(wǎng)絡(luò)(Disease Gene Network,DISGENT)數(shù)據(jù)庫中,以“Hypertension”為檢索詞檢索疾病靶蛋白,其中CTD數(shù)據(jù)庫以“Inference Score”≥9.63為篩選條件,再對(duì)5個(gè)數(shù)據(jù)庫獲得的靶蛋白進(jìn)行合并和去重,得到高血壓疾病靶點(diǎn)。

將川牛膝靶點(diǎn)與高血壓相關(guān)靶點(diǎn)利用在線作圖工具(http://www.biovenn.nl),獲取川牛膝與高血壓的共同靶點(diǎn),獲得川牛膝治療高血壓關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.3 關(guān)鍵靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

藥物發(fā)揮藥理作用除了作用于直接靶點(diǎn)調(diào)控之外,更多是直接靶點(diǎn)和間接靶點(diǎn)互相結(jié)合的調(diào)控方式。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用(Protein-Protein Interaction,PPI)分析有助于從系統(tǒng)的角度研究和挖掘藥物新靶點(diǎn)和闡明藥物治療疾病的分子機(jī)制。將川牛膝治療高血壓關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫獲得PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)信息,并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.0軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析。

1.4 GO功能富集分析和KEGG分析

將川牛膝治療高血壓關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體論(Gene ontology,GO)以及京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析。以智人為篩選條件,顯著性閾值設(shè)為以P<0.01為選擇標(biāo)準(zhǔn),對(duì)結(jié)果進(jìn)行篩選,并做氣泡圖進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 川牛膝的活性成分和靶蛋白的獲得

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中搜索川牛膝得到藥物有效成分共41個(gè)。按ADME參數(shù)口服生物利用度OB≥20%,類藥性DL≥0.1篩選得到11個(gè)潛在活性成分;另外,通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)cyasterone具有治療高血壓的潛在藥理作用[6],共組成12個(gè)川牛膝潛在活性成分。通過TCMSP、HERB、獲得活性成分靶蛋白,對(duì)于沒有靶蛋白的活性成分進(jìn)行Swiss Target Prediction 靶點(diǎn)預(yù)測(cè),對(duì)靶蛋白進(jìn)行去重、通過Uniprote、Drugbank或美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因名轉(zhuǎn)換,刪除重復(fù)及無法獲得基因的蛋白,最終得到9個(gè)活性成分(見表1)及211個(gè)活性成分靶點(diǎn)。

表1 川牛膝主要活性成分

2.2 川牛膝治療高血壓關(guān)鍵靶點(diǎn)的獲取

以“Hypertension”為檢索詞收集高血壓相關(guān)靶點(diǎn),在OMIM數(shù)據(jù)庫獲得148個(gè)靶點(diǎn),在TTD數(shù)據(jù)庫獲得106個(gè)靶點(diǎn),在CTD數(shù)據(jù)庫獲得1050個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)(Inference Score≥100),在Disgenet數(shù)據(jù)庫獲得445個(gè)靶點(diǎn),在Drugbank數(shù)據(jù)庫獲得178個(gè)靶點(diǎn)。將五個(gè)數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)集合并去掉重復(fù)最終得到高血壓相關(guān)靶點(diǎn)1540個(gè)。通過對(duì)疾病靶點(diǎn)與川牛膝作用靶點(diǎn)映射取交集,得到二者交集靶點(diǎn)170個(gè)。見圖1。

圖1 疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 川牛膝治療高血壓的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 關(guān)鍵靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將川牛膝治療高血壓的170個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)分析和網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè),所得結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析。隱藏?zé)o線的節(jié)點(diǎn),用自由度Degree值表示圈的大小和顏色深淺,Degree值越大,圓圈越大,顏色越偏紅色,代表參與生物信號(hào)路徑越多,如圖3所示,發(fā)揮關(guān)鍵作用的靶點(diǎn)為IL6(Degree=78)、AKT1(Degree=74)、TP53(Degree=71)、VEGFA(Degree=70)、TNF(Degree=69)、PTGS2(Degree=64)、EGFR(Degree=63)、CASP(Degree=62)、MMP9(Degree=61)和STAT3(Degree=61)等。

圖3 川牛膝治療高血壓靶點(diǎn)的GO富集分析

2.4 GO功能富集分析和KEGG分析

將川牛膝治療高血壓的170個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫,進(jìn)行基因本體論GO和KEGG分析,其中,GO分子功能(Molecular function,MF)富集最高的20個(gè)涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、血紅素結(jié)合、激酶結(jié)合等;GO細(xì)胞學(xué)組分(Cellular Component,CC)共15個(gè),富集最高的涉及細(xì)胞膜筏、膜的側(cè)面、細(xì)胞頂端、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、細(xì)胞外基質(zhì)等;GO生物學(xué)進(jìn)程(Biological process,BP)富集最高的20個(gè)涉及炎癥反應(yīng)、對(duì)傷害的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、活性氧代謝過程、凋亡信號(hào)通路等。KEGG分析富集最高的20條信號(hào)通路主要涉及糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE 信號(hào)路徑、腫瘤的途徑、乙型肝炎、TNF信號(hào)通路、腫瘤中的蛋白質(zhì)多糖等。川牛膝治療高血壓的生物學(xué)進(jìn)程分析和KEGG分析如圖3～4。

圖4 川牛膝治療高血壓靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

3 討論

高血壓是常見的心血管疾病,以體循環(huán)動(dòng)脈血壓持續(xù)高于正常水平為主要特征,能導(dǎo)致人的心、腦、腎、視網(wǎng)膜、血管等病理性改變,可誘發(fā)腦血管硬化和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化,嚴(yán)重威脅人類的健康。高血壓在中醫(yī)中歸屬“眩暈”“頭痛”等范疇,臨床表現(xiàn)有頭痛、頭暈、目眩、耳鳴等[7]。其中醫(yī)病因病機(jī)主要為營液內(nèi)虛,水不涵木,木氣偏亢,甚則化風(fēng),治法治則以滋營陰、養(yǎng)肝腎為基礎(chǔ),并結(jié)合風(fēng)、痰、火、瘀等癥,隨證治之[3,8]。

川牛膝具有活血通經(jīng)、滋肝補(bǔ)腎,強(qiáng)筋健骨、利水通淋、引火(血)下行的功效,中醫(yī)在治療高血壓用藥規(guī)律表明,川牛膝使用頻率極高[9]。現(xiàn)代藥理學(xué)表明,川牛膝主要成分為三萜皂苷、甾酮、多糖,及少量黃酮類等成分[10],通過數(shù)據(jù)整理篩選出9種有效成分,主要為黃酮類槲皮素、葛根素以及甾體類如杯莧甾酮、紅莧甾酮、β-谷甾醇、齊墩果酸、西托糖苷等。槲皮素藥理作用廣泛,具有擴(kuò)張血管及降壓作用,臨床試驗(yàn)表面,槲皮素能直接激活人類血管平滑肌細(xì)胞KCa,提示槲皮素激活鈣激活鉀通道可能是其降血壓的一種機(jī)制[11]。同樣動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,在高血壓合并腦卒中小鼠中,槲皮素能通過活化血小板,減少血小板炎性因子的釋放,進(jìn)而降低腦血栓中血小板堆積的致密程度和覆蓋率,降低小鼠的腦梗死體積和神經(jīng)評(píng)分,增加小鼠存活率[12]。槲皮素也可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群,下調(diào)TLR4/NF-κB途徑,降低自發(fā)性高血壓大鼠血壓及改善心室重構(gòu)[13]。葛根素主要存在豆科植物野葛的根,與槲皮素結(jié)構(gòu)相似,葛根素通過 TRPC3 抑制 NF-κB 激活從而下調(diào)Cx43的表達(dá),促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞向收縮表型轉(zhuǎn)化,進(jìn)而改善血管舒縮功能[14],并且在瘀血內(nèi)阻型原發(fā)性高血壓疾病研究中發(fā)現(xiàn),葛根素注射液聯(lián)合厄貝沙坦能有效控制血壓,改善臨床癥狀[15]。齊墩果酸作為一種具有廣泛活性的三萜類化合物,在高血壓動(dòng)物模型上研究較多,可明顯改善高血壓動(dòng)物收縮壓的升高,齊墩果酸的降壓作用也與其利尿作用相關(guān)[16]。通過SwissTargetPrediction 預(yù)測(cè)分析得到的川牛膝有效成分靶點(diǎn)Carboxylesterase 2[17]、11-beta-hydroxysteroid dehydrogenase 1[18]、Progesterone receptor[19]等明顯與高血壓有相關(guān)性,為進(jìn)一步在體外或體內(nèi)研究川牛膝治療高血壓的機(jī)制提供了方向。

高血壓的發(fā)病機(jī)制未完全清晰,疾病的發(fā)生可能是由多基因和環(huán)境共同照成的,與炎癥反應(yīng)、脂多糖、活性氧代謝等因素密切相關(guān)[20-22]。本研究構(gòu)建川牛膝治療高血壓PPI網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)IL-6、AKT1、TP53等核心靶點(diǎn)。IL-6為白細(xì)胞介素-6,研究表明,越來越多的證據(jù)支持炎癥和免疫與高血壓有關(guān),炎癥的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致IL-6釋放,進(jìn)而刺激單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為抗原呈遞細(xì)胞并產(chǎn)生IL-1β和IL-23等細(xì)胞因子,進(jìn)一步影響T細(xì)胞功能以產(chǎn)生IL-17A。這些細(xì)胞因子能導(dǎo)致高血壓產(chǎn)生以及終末器官損傷[23],這也為高血壓的治療提供了新的方向。AKT磷酸化激活內(nèi)皮一氧化氮合成酶,導(dǎo)致內(nèi)皮血管松弛,進(jìn)而影響血壓[24]。腫瘤抑制劑蛋白p53與動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制有關(guān),直接參與高血壓的發(fā)病機(jī)制[25]。

川牛膝治療高血壓關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO功能富集發(fā)現(xiàn),涉及炎癥反應(yīng)、對(duì)傷害的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、活性氧代謝過程、凋亡信號(hào)通路等。KEGG分析富集最高的20條信號(hào)通路主要涉及糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE 信號(hào)路徑、腫瘤的途徑、乙型肝炎、TNF信號(hào)通路、腫瘤中的蛋白質(zhì)多糖等。通過富集分析及文獻(xiàn)可以推出,川牛膝治療高血壓主要通過以下幾個(gè)通路發(fā)揮調(diào)控血壓的作用。Ⅰ:炎癥反應(yīng)相關(guān)通路。高血壓與免疫系統(tǒng)活化及遷移至多種靶器官如血管系統(tǒng)、腎臟、大腦、心臟等密切相關(guān),炎癥機(jī)制對(duì)血壓調(diào)節(jié)及靶器官至關(guān)重要[26-28]。Ⅱ:糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE相關(guān)通路。AGE-RAGE在在高血壓患者的血漿中表達(dá)較高,影響動(dòng)脈結(jié)構(gòu)及血管功能。糖基化與受體反應(yīng)可以導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生,AGE與RAGE的相互作用可通過活性氧的產(chǎn)生,交感神經(jīng)活性增加,NF-kB因子的活化以及細(xì)胞因子、細(xì)胞粘附分子和TGF-β的表達(dá)增加而產(chǎn)生高血壓[29-30]。目前,常用的降壓藥如卡托普利、氯沙坦等均為通過AGE-RAGE相關(guān)通路起到降低血壓的作用。Ⅲ:腫瘤及細(xì)胞凋亡信號(hào)路徑。高血壓以及持續(xù)性高血壓會(huì)誘發(fā)心肌形態(tài)學(xué)變化及心肌功能障礙,可導(dǎo)致心肌間質(zhì)纖維化或心肌細(xì)胞凋亡[31-32]。減少心肌細(xì)胞的凋亡對(duì)預(yù)防和治療高血壓有重要的臨床意義。

總體來說,通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了川牛膝可通過多靶點(diǎn)、多通路來治療高血壓。高血壓的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,而川牛膝有效成分多,需要系統(tǒng)研究中藥治療疾病的作用機(jī)制。本研究基于活性成分、核心靶點(diǎn)以及信號(hào)通路進(jìn)行歸納分析,為進(jìn)一步研究川牛膝治療高血壓的作用機(jī)制提供一定的方向。同時(shí),也為中醫(yī)藥治療高血壓提供了思路及理論基礎(chǔ)。