劉康博,張萬存,顧月清

(1.中國藥科大學 生物醫(yī)學工程實驗室,江蘇 南京 210009;2.河南省藥品醫(yī)療器械檢驗院(河南省疫苗批簽中心) 生物安全檢測中心,河南 鄭州 450018;3.鄭州大學附屬兒童醫(yī)院,河南 鄭州 450000)

癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉移是一個包含多環(huán)節(jié)、多步驟和多基因的復雜過程。隨著對癌癥發(fā)病機制了解的不斷深入,針對已經明確的癌癥細胞病理性變化,設計出具有選擇性殺傷癌細胞機制的藥物,已經成為了未來抗癌藥物的重要發(fā)展方向。腫瘤細胞超常的新陳代謝速度和不正常的氧化還原調節(jié)會引起細胞中活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的積累,過多ROS會直接氧化破壞胞內正常狀態(tài)下的DNA和氧化游離的dNTPs[1-2]。人MutT同源體1蛋白(Human MutT Homolog-1,MTH1)能夠通過將8-oxod-GTP和2-OH-dATP水解成為8-oxo-dGMP和2-OH-dAMP,清理氧化的脫氧核糖核苷三磷酸池(dNTP pool),阻止氧化核苷酸摻入正在合成的DNA中引起錯配突變,進而防止ROS造成的DNA損傷[3-6]。抑制MTH1的活性,將活化腫瘤細胞DNA損傷壓力反應(DNA damage response,DDR)途徑,最終細胞死亡,MTH1成為維持腫瘤細胞存活的關鍵[7-9]。目前針對MTH1的抑制劑研究尚處于初期階段,已明確的具有抑制作用的化合物較少,因此研究MTH1抑制劑對于抗腫瘤治療具有重要意義。為了進一步研究MTH1抑制劑的結構特征,發(fā)現(xiàn)新的MTH1抑制劑的先導化合物,采用Discovery Studio 3.0中HipHop模塊構建MTH1抑制劑藥效團模型,并對其可靠性進行了驗證,篩選出了具有新穎骨架的先導化合物,為開發(fā)MTH1抑制劑提供了新的思路。

1 實驗材料與方法

1.1 訓練集及測試集化合物的選擇

根據已發(fā)表的MTH1相關文獻和專利,我們收集到24個MTH1小分子抑制劑,按化合物骨架可分為三類:2,4-二氨基嘧啶類衍生物、(S)-克唑替尼衍生物類和喹啉類衍生物[5-6,10]。分子結構采用ChemDraw軟件繪制,并在Discovery Studio 3.0軟件中構建MTH1小分子抑制劑3D數據庫。

為滿足構建HipHop模型所需要的訓練集分子活性高、分子骨架多樣的要求,從MTH1小分子抑制劑數據庫中挑選10個高活性分子,1個中等活性分子和3個非活性分子作為訓練集。使用DUD·E數據庫(A Database Of Useful Decoys: Enhanced,University of California)[11]的Generate功能通過分析上載的20個已知高活性的MTH1抑制劑分子的物理性質,從Zinc數據庫中尋找和其具有相似相對分子質量、logP、氫鍵供/受體數等物理性質,但具有不同拓撲性質的分子150個,與MTH1小分子抑制劑數據庫剩余的10個高活性分子構建Decoy Set共160個分子作為測試集。訓練集分子和測試集活性分子結構、活性以及活性分類信息,如圖1所示。

圖1 訓練集分子(1～14)和測試集分子(15～24)

1.2 HipHop藥效團模型的構建

1.2.1 化合物分子的預處理

挑選出的訓練集分子使用Discovery Studio軟件中的Prepare Ligands進行結構優(yōu)化之后添加Principal屬性和MaxOmitFeat屬性。其中10個高活性分子作為參考分子,需要在藥效團模型構建中考慮和匹配其所有化學特征,其Principal屬性值定義為2,MaxOmitFeat屬性值定義為0。1個中等性分子需要在藥效團構建時考慮其構象空間,并允許部分藥效團特征不匹配,其Principal屬性值定義為1,MaxOmitFeat屬性值定義為1,3個非活性分子Principal 屬性值定義為0,MaxOmitFeat屬性值定義為2。

1.2.2 藥效團特征元素的選取

使用Discovery Studio軟件中的Feature Mapping 模塊來鑒定10個高活性分子所有可能的藥效特征和其空間位置,通過對特征元素進行聚類分析得出此8個分子包含有氫鍵受體(A)、氫鍵供體(D)、正電離子中心(I)、疏水中心(H)和芳香環(huán)中心(R)共5種特征元素類型。

1.2.3 HipHop藥效團的構建

使用Discovery Studio軟件 Common Feature Pharmacophore Generation模塊進行HipHop藥效團的構建,Feature特征選擇HB_ACCEPTOR,HB_DONOR,HYDROPHOBIC_aliphatic,POS_IONIZABLE,RING_AROMATIC等5種特征元素,將構象產生參數Conformation Generation值設為Best,最小特征元素間距離Minimum Interfeature Distance值設置為0.1。構象上限數Maximum Conformation值設為255,能量閾值Energy Threshold值設為10,并設置并行運算,其他參數使用默認值。

1.3 藥效團模型的驗證

1.3.1 Decoy set測試集3D Database的構建

使用Discovery Studio中Build 3D Database將Decoy set測試集構建成為3D Database。設置構象產生個數Number of Conformations為255個,構象產生方法Conformation Generation設置為Best,設置并行運算,其他參數使用默認值。

1.3.2 藥效團篩選及采用的評判參數

使用Discovery Studio中Search 3D Database模塊對Decoy set 3D database 進行篩選,評估藥效團的精確性和富集率,其中Search Method參數設為Best,Limit Hit參數設為All。

以A、S、E和G等4個統(tǒng)計學參數來評價模型預測結果,其計算公式如下:

A=(Ha/n)×100%

S=(Ha/Ht)×100%

E=(Ha/Ht)×(A/N)

G=[(Ha/4Htn)(3n+Ht)×(1-((Ht-Ha)/(N-n)))]

其中,N代表數據庫化合物總數,n為數據庫中活性化合物的個數;Ht為藥效團命中總化合物的個數,Ha為藥效團命中活性化合物的個數。A代表活性成分命中率,S代表有效命中率,E為藥效團模型的富集因子,G為篩選結果的擬合優(yōu)度。

1.4 化合物庫的虛擬篩選

使用和Decoy set相同方法與參數構建Maybrige小分子化合物數據庫的3D Database。并使用最優(yōu)的藥效團使用與篩選Decoy set相同的參數對Maybrige 3D Database進行篩選。

1.5 對接分析

采用DS軟件中的CDOCKER模塊,對篩選獲得的化合物進行相互作用分析。使用PDB ID為4N1T[6]蛋白晶體結構作為對接受體模型,蛋白晶體文件采用DS標準方法處理,將受體活性位點半徑設置為6,以保證對接過程涉及到所有的活性氨基酸。

2 實驗結果

2.1 Hiphop藥效團模型結果

本次模型構建產生了10個藥效團模型,藥效團模型構建結果如表1所示。結果顯示藥效團模型01-08包含5個特征元素:1個芳環(huán)基團(R)、1個疏水基團(H)、1個氫鍵供體(D)和2個氫鍵受體(A)。藥效團模型09和10包含的特征元素簡寫為:RHDA和RRHD。稀有度Rank顯示模型01與訓練集分子匹配程度最高,10個藥效團模型計算評判Direct Hit值及Partial Hit值均為“11111111111”和“00000000000”,表明11個活性分子均對藥效團提供貢獻。藥效團模型01～08的Max Fit值為5,說明模型中5個特征元素能與訓練集分子相匹配,同時模型09～10對應Max Fit為4,說明其包含的4個特征元素與訓練集同樣匹配。藥效團模型01特征元素展示如圖2所示。

表1 藥效團模型構建結果

a—特征元素空間分布圖;b—特征元素間距離示圖圖2 藥效團模型01的特征元素展示圖

依次查看藥效團模型與訓練集分子匹配程度以及內部運算產生的Fit值,并參考其與已知活性值及活性分類吻合程度,評價模型構建的好壞。模型01～05和07～09中分子相吻合程度較高,活性分子和低活性分子的Fit值在區(qū)間3.4～2.1之間,而非活性分子處于更低的水平;模型06和10中訓練集分子吻合度較差,Fit值與活性分類相關性不明顯。其中,模型1中活性最好的化合物1,即TH-287,有最高的打分值3.45,而非活性分子均打分值小于0.8。高活性的TH-287、非活性的(R)-Crizotinib與藥效團模型1匹配情況,如圖3所示。

a—TH-287與藥效團模型01匹配圖;b—(R)-Crizotinib與藥效團模型01匹配圖圖3 TH-287和(R)-Crizotinib與藥效團模型01匹配圖

2.2 藥效團模型的評價

采用的篩選外部Decoy Set方法對所構建的10個藥效團模型進性驗證和評價,統(tǒng)計學參數結果見表2。結果顯示藥效團模型01具有很好的區(qū)分出活性分子能力,活性成分命中率A和有效命中率S分別為90.0%和81.8%,遠高于其他模型最高值的50.0%和60.0%;在考察篩選數據庫所應具備的綜合篩選的能力方面,模型富集因子E和擬合優(yōu)度G值,13.1和0.828,同樣具有遠高于其他模型的分值。綜合以上分析,藥效團模型01擁作為篩選使用的藥效團的條件,可以用于篩選化合物數據庫。

表2 外部Decoy set藥效團篩選統(tǒng)計學參數

2.3 虛擬篩選的結果

使用HipHop算法構建藥效團模型在Maybrige 3D數據庫中篩選出568個化合物。選擇參考打分值Fit Value值大于1.0,并且選擇與報道的3類抑制劑骨架不同的分子。最終獲得了75個化合物,用于下面對接分析研究。

2.4 對接結果分析

經過分子對接分析發(fā)現(xiàn),GK01945和HTS07767能夠與MTH1受體藥效口袋形成較好的相互作用。GK01945能夠與受體的第23位賴氨酸(Lysine,Lys)、第33位天冬酰胺(Asparagine,Asn)、第119位天冬氨酸(Aspartic Acid,Asp)形成4個氫鍵作用,與第23位賴氨酸、第72位苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe)、第117位色氨酸(Tryptophan,Trp)形成3個疏水作用,如圖4 a所示。HTS07767能夠與受體的第33位天冬酰胺、第119位天冬氨酸形成5個氫鍵作用,與第23位賴氨酸、第117位色氨酸形成2個疏水作用,如圖4 b所示。

a—GK01945與MTH1相互作用圖;b—HTS07767與MTH1相互作用圖圖4 GK01945和HTS07767與MTH1 相互作用圖

3 討論

癌癥是機體在多種致癌因素作用下局部組織細胞失去正常的生長調控,具有自給自足的生長信號和抵御抗增殖及凋亡信號的調控等特點[12]?，F(xiàn)有的靶向抗癌治療多以靶向癌癥中發(fā)現(xiàn)的遺傳缺陷為主,即靶向癌基因成癮(Oncogene Addiction,OA),但方法逐漸表現(xiàn)出其局限性,如難以個性化治療、引發(fā)高耐藥性、毒副作用強等[13-15]。運用一個去個性化抗癌策略實現(xiàn)癌癥治療的普適的靶標,可以解決腫瘤內的異質性等問題,并能廣泛用于各類腫瘤治療中。MTH1通過清理癌細胞因新陳代謝異常導致的ROS積累引發(fā)的dNTP pool氧化,防止氧化損傷的堿基在DNA復制過程中的摻入。抑制MTH1的活性,會引起癌細胞出現(xiàn)錯誤配對、突變,導致DNA損傷壓力反應途徑的活化,最終細胞死亡。此外,過表達的MTH1通過抑制DNA損傷的總體水平,逆轉了HRAS誘導的細胞衰老[16]。MTH1抑制劑的開發(fā)可以實現(xiàn)非癌基因成癮(NOA,Non-Oncogene Addiction),成為癌癥治療研究的新熱點之一。

HipHop算法可以最大程度分析利用現(xiàn)有的化合物結構活性信息,通過計算一組的活性化合物三維結構以及所共有的化學特征信息,利用分子疊合和共同藥效特征搜尋的方法,構建基于配體共同特征的定性藥效團,是目前用于先導化合物發(fā)現(xiàn)及構效關系研究有效的方法之一[17-19]。收集現(xiàn)有報道針對MTH1的小分子抑制劑24個,包括兩個最高酶抑制活性值(IC50)的化合物TH-287和TH-588,分別為0.8 nmol/L和5.0 nmol/L。通過HipHop算法得到的藥效團模型Pharmcophore_01經過檢驗具有較好的指標,說明該方法構建的藥效團可以用作虛擬篩選。隨后按照需求對商業(yè)數據庫Maybridge進行篩選,選擇參考打分值Fit Value值大于1.0的化合物,得到了75個候選化合物。進一步對接驗證發(fā)現(xiàn)化合物GK01945和HTS07767能夠和受體形成良好的相互作用,具有新骨架和潛在的抑制作用,可以作為MTH1抑制劑的先導化合物,為該抗腫瘤靶點的藥物設計提供研究基礎。

4 結論

本研究通過構建MTH1抑制劑的藥效團篩選模型,采用虛擬篩選和對接驗證得到兩個潛在的MTH1抑制劑,為研發(fā)MTH1新骨架抑制劑提供了理論基礎。后續(xù)通過研究GK01945和HTS07767與MTH1蛋白疏水口袋的結合能力,結合藥效學試驗和結構修飾改造,提高其活性及改善藥代動力學等特性,為發(fā)現(xiàn)結構新穎、高效的MTH1抑制劑提供理論依據。