尉樺聰,張新茹,姚吉,高云,全艷玲,徐靜

(遼寧科技大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院,遼寧 鞍山 114051)

橙子主要盛產(chǎn)于我國南部地區(qū),栽植范圍在甘肅、陜西二省南部、湖北、湖南、江蘇、貴州、廣西及云南東北部的高山地區(qū)均有分布[1-2]。橙子作為水果在日常食用或果蔬行業(yè)食品加工的同時(shí)會(huì)殘留無法直接食用的果皮等廢物。目前,橙子果皮的處理除少量用于生產(chǎn)動(dòng)物飼料外,其余被歸類為廚余垃圾,長(zhǎng)期的堆積給環(huán)境帶來一定的負(fù)擔(dān)。因此,對(duì)橙皮中富含的活性成分首先進(jìn)行提取和分離后再進(jìn)行殘?jiān)幚?不僅可以實(shí)現(xiàn)自然資源物盡其用,而且能提高橘橙柚等農(nóng)產(chǎn)品綜合利用效率和產(chǎn)品的附加值,又能減少因果皮堆積產(chǎn)生的環(huán)境污染問題[3-4]。橙皮經(jīng)過一定的物理和化學(xué)處理,可得到具有高利用價(jià)值的橙香精油,提取的精油中有90%以上的成分為檸檬烯。檸檬烯是存在于橙皮中的芳香油,具有令人愉快的香味,具有特殊的抑菌和殺菌等微生物的特性,是一種常見的天然香料、脫脂劑和抗菌消炎劑,在醫(yī)藥、食品、化妝品和日用化學(xué)品等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[5-8]。

近年來,國內(nèi)外學(xué)者逐漸關(guān)注對(duì)橘橙柚果皮的化學(xué)活性成分分布及有機(jī)化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究。檸檬烯的密度為0.840 2 g/cm3,在常溫常壓下是一種淡黃色或者接近無色的油狀液體,不溶于水。從橙皮中提取檸檬烯的實(shí)驗(yàn)室方法諸多,如索氏溶劑提取法、超臨界固-液萃取法和水蒸氣蒸餾法等[8]。水蒸汽蒸餾法是實(shí)驗(yàn)室提取不與水反應(yīng)且具有較高沸點(diǎn)和一定揮發(fā)性物質(zhì)(100 ℃時(shí)蒸氣壓至少為1.3 kPa)的最簡(jiǎn)單最常用的方法。

以新鮮橙皮為原料,對(duì)影響水蒸氣蒸餾法提取檸檬烯的因素進(jìn)行了分析,確定提高檸檬烯產(chǎn)率最佳實(shí)驗(yàn)條件。提供一種方便、快捷,且產(chǎn)率較高的檸檬烯提取方法,為柑橘橙柚類果皮資源廢棄物的綜合利用提供一定理論依據(jù)和借鑒參考。文章最后對(duì)橙皮中提取的檸檬烯進(jìn)行定量和定性的表征分析,并對(duì)檸檬烯的抑菌性能和最小抑菌濃度測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 原料和試劑

橙皮來源于湖北宜昌的秭歸臍橙,2023年9月份網(wǎng)購于上述產(chǎn)地。氯化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、無水硫酸鈉和乙醇均為分析純?cè)噭┵徲趪幵噭＝瘘S色葡萄球菌等生物試劑購買于青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將新鮮橙皮切成不同尺寸碎片備用。稱取經(jīng)過預(yù)處理的橙皮質(zhì)量m1=50 g,置于250 mL裝有兩粒沸石的三口圓底燒瓶中,加入100 mL蒸餾水,三口圓底燒瓶的左右瓶口分別連接水蒸氣發(fā)生器的導(dǎo)管與直型冷凝管,提取的橙皮油經(jīng)過直型冷凝管引流到錐形瓶中。水蒸氣發(fā)生裝置產(chǎn)生的水蒸氣導(dǎo)入三口瓶中,使瓶?jī)?nèi)保持微沸狀態(tài),從錐形瓶?jī)?nèi)的第一滴餾出液開始計(jì)時(shí)直到精油量不再增加后停止反應(yīng),大約1 h。將少量無水硫酸鈉放入錐形瓶中去除水分,得到檸檬烯的質(zhì)量為m2,檸檬烯的產(chǎn)率計(jì)算依據(jù)公式:Y=m2/m1。

1.3 分析與表征

采用美國安捷倫科技有限公司7890A/5975C氣相質(zhì)譜分析儀分析檸檬烯的成分和純度。以氦氣作為載氣,EI 源作為質(zhì)譜電子轟擊離子源,溫度設(shè)定為230 ℃,全掃描模式的掃描范圍為 50～500 amu。

采用Thermo Electron公司的 NICOLET 380紅外光譜儀(FT-IR)分析橙皮精油的有機(jī)物化學(xué)官能團(tuán)。樣品以溴化鉀干燥、研磨和制粒,其光譜記錄在4 000～400 cm-1的范圍內(nèi),分辨率為4 cm-1,每個(gè)樣品掃描20次。

1.4 檸檬烯抑菌效果及最小抑菌濃度測(cè)定

采用牛津杯法對(duì)檸檬烯原液進(jìn)行抑菌效果測(cè)定。將1 mL 稀釋后金黃色葡萄菌懸液于一次性培養(yǎng)皿內(nèi),使培養(yǎng)基與菌懸液混合均勻,待培養(yǎng)基凝固后用無菌鑷子夾取牛津杯放置于培養(yǎng)基上,按壓牛津杯直至接觸到培養(yǎng)皿底部,用鑷子將牛津杯及牛津杯內(nèi)部培養(yǎng)基取出。分別吸取 10 μL檸檬烯原液垂直滴至培養(yǎng)基上的小孔內(nèi),將培養(yǎng)皿放置于 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)24 h,進(jìn)行抑菌圈直徑測(cè)量。將檸檬烯用體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液稀釋,通過二倍稀釋法至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.00‰,5.00‰,2.50‰,1.25‰,0.63‰,0.31‰。設(shè)置對(duì)照組A(體積分?jǐn)?shù)40%乙醇)和B(只接種菌懸液)。分別吸取 0.3 mL 檸檬烯稀釋液及陽性對(duì)照 A 和B于試管中,加入 3 mL 稀釋后菌液密閉狀態(tài)反應(yīng) 30 min。反應(yīng)結(jié)束后取 1 mL溶液置于一次性培養(yǎng)皿中,確保溶液與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合均勻。待培養(yǎng)基完全凝固后,將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保持37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),確定最小抑菌濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 橙皮尺寸對(duì)檸檬烯提取率的影響

將新鮮橙皮破碎成不同尺寸,考察原料尺寸(0.2 cm×0.2 cm,0.4 cm×0.4 cm,0.6 cm×0.6 cm,0.8 cm×0.8 cm)對(duì)檸檬烯提取率的影響。設(shè)定的水蒸氣蒸餾時(shí)間30 min,優(yōu)化水蒸氣蒸餾提取新鮮橙皮中液相產(chǎn)物進(jìn)而獲得提取高純度檸檬烯的工藝參數(shù),橙皮尺寸對(duì)檸檬烯提取率的影響如圖1所示。

圖1 橙皮尺寸對(duì)檸檬烯提取率的影響

由圖1可知,橙皮尺寸由0.2 cm×0.2 cm 增大到0.6 cm×0.6 cm,檸檬烯的提取率呈現(xiàn)上升趨勢(shì);當(dāng)尺寸繼續(xù)增大到0.8 cm×0.8 cm,提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能是由于橙皮尺寸較大時(shí),橙皮組織中液態(tài)化合物擴(kuò)散到表層的距離增加,擴(kuò)散過程橙皮組織的內(nèi)部熱傳遞阻力有所提高,橙皮在水氣中不完全反應(yīng),組織內(nèi)部富含精油的化合物不容易被提取出來。橙皮尺寸為0.6 cm×0.6 cm時(shí),橙皮組織中液態(tài)化合物擴(kuò)散到表層的距離減小,擴(kuò)散過程橙皮組織的內(nèi)部熱傳遞阻力有所降低,橙皮在水氣中反應(yīng)完全,促使組織內(nèi)部富含精油的化合物被充分提取出來。但是,當(dāng)橙皮尺寸減小至0.2 cm×0.2 cm時(shí),橙皮組織之間的空隙相對(duì)較小,水氣難以擴(kuò)散到橙皮內(nèi)部,并且阻塞富含精油的化合物從表層逸出,檸檬烯在反應(yīng)體系中滯留時(shí)間延長(zhǎng),檸檬烯提取率下降。綜上所述,確定橙皮尺寸0.6 cm×0.6 cm為水蒸氣蒸餾提取橙皮中檸檬烯的最佳工藝參數(shù)。

2.2 橙皮浸泡時(shí)間對(duì)檸檬烯提取率的影響

橙皮中水分含量是影響水蒸氣蒸餾法提取檸檬烯產(chǎn)率的重要影響因素。橙皮本身水分含量高,在水蒸氣蒸餾的反應(yīng)體系中自身的水分可以促進(jìn)檸檬烯成分從橙皮中轉(zhuǎn)移出來。然而,當(dāng)橙皮中的水含量較低時(shí),由于缺少自身原位水將富含檸檬烯的化合物從橙皮中萃取出來。但是當(dāng)橙皮中含水率高于70%時(shí),橙皮易腐爛變質(zhì)導(dǎo)致提取率降低。因此水蒸氣蒸餾前對(duì)橙皮進(jìn)行一定浸泡是必要的,考察時(shí)間(0,2,4,6,8,10 h),結(jié)果如圖2所示。

圖2 橙皮浸泡時(shí)間對(duì)檸檬烯提取率的影響

圖2表明,當(dāng)橙皮碎片的預(yù)先浸泡時(shí)間為8 h時(shí),檸檬烯最終的提取率最高。水蒸氣蒸餾前,橙皮碎片的浸泡時(shí)間對(duì)檸檬烯的提取率影響較大,當(dāng)橙皮的浸泡時(shí)間不足8 h時(shí),橙皮中的富含檸檬烯的化合物不能被最大化的帶出,隨著浸泡時(shí)間的增加檸檬烯提取率逐漸升高;當(dāng)浸泡時(shí)間高于8 h時(shí),橙皮溶脹現(xiàn)象嚴(yán)重,目標(biāo)產(chǎn)物分離困難,且含有少量雜質(zhì),提取率略有下降。

2.3 添加劑種類對(duì)檸檬烯提取率的影響

采用水蒸氣蒸餾的方法時(shí),添加無機(jī)鹽助劑是影響檸檬烯的提取率的重要因素。本實(shí)驗(yàn)選擇NaCl、Na2CO3、NaHCO3、CaCO3為添加助劑。由圖3可知,加入四種無機(jī)鹽助劑后,檸檬烯的提取率高于不添加無機(jī)鹽時(shí)的提取率。不同試劑的加入對(duì)檸檬烯提取率的促進(jìn)作用大小順序如下:Na2CO3>NaHCO3>NaCl>CaCO3。CaCO3極難溶于水,不易與橙皮中的檸檬烯發(fā)生鹽析作用。強(qiáng)電解質(zhì)NaCl的加入,使檸檬烯的提取率略有提高,這是由于中性的鹽溶液中的鹽離子與溶液中大部分自由水結(jié)合,使橙皮中的檸檬烯更容易聚集析出。Na2CO3和NaHCO3的鹽析作用大于中性鹽NaCl,由于Na2CO3和NaHCO3的水溶液都是強(qiáng)堿性,堿處理可解構(gòu)橙皮碎片中纖維細(xì)胞壁,從而可有效促進(jìn)檸檬烯組分的萃取。無機(jī)鹽Na2CO3的堿性強(qiáng)于NaHCO3,以Na2CO3為添加助劑時(shí),水蒸氣蒸餾橙皮中檸檬烯的提取率為3.43%。

圖3 不同添加劑對(duì)檸檬烯提取率的影響

2.4 添加劑比例對(duì)檸檬烯提取率的影響

選擇Na2CO3的添加比例分別為新鮮橙皮質(zhì)量的2%,4%,6%,8%,考察Na2CO3在水溶液中添加比例對(duì)檸檬烯提取率的影響,結(jié)果如圖4所示。

圖4 添加劑質(zhì)量比例對(duì)檸檬烯提取率的影響

Na2CO3的添加質(zhì)量比例從0%增加到2%的過程中,檸檬烯的提取率顯著增加;當(dāng)Na2CO3的添加質(zhì)量比例從2%增加到4%的過程中,檸檬烯的提取率增加緩慢,添加質(zhì)量比例超過4%以后檸檬烯的提取率開始下降。在Na2CO3添加質(zhì)量比例低于4%時(shí),在橙皮水溶液中鹽的濃度相對(duì)較低,體系內(nèi)的飽和蒸氣壓隨著Na2CO3濃度的增加而降低,故在恒定大氣壓的情況下,水的沸點(diǎn)升高[10],水蒸氣蒸餾中水蒸氣產(chǎn)量減少造成檸檬烯提取率下降。綜合考慮檸檬烯提取率和能耗等方面因素,確定最佳的Na2CO3添加質(zhì)量比例為4%。

2.5 檸檬烯的氣相質(zhì)譜分析

本實(shí)驗(yàn)確定的最佳實(shí)驗(yàn)條件為:選取0.6 cm×0.6 cm橙皮50 g,預(yù)先浸泡8 h后加入4%的碳酸鈉,進(jìn)行水蒸氣蒸餾 1 h提取檸檬烯。檸檬烯的分子式為C10H16,C10H16具有多種同分異構(gòu)化合物,如表1所示。其中,CAS號(hào)99-84-3為本實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)產(chǎn)物d-檸檬烯。

表1 C10H16的同分異構(gòu)化合物

將最佳工藝條件下,橙皮中提取的揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS 測(cè)定,以確定提取物中d-檸檬烯的純度。GC-MS 分析的檸檬烯總離子流圖如圖5所示。根據(jù) NIST標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫對(duì)GC-MS采集的色譜峰進(jìn)行定性匹配,結(jié)果表明保留時(shí)間為 7.791 min 的組分確定為目標(biāo)產(chǎn)品d-檸檬烯,氣相體積含量為96.3%。

圖5 橙皮中揮發(fā)性成分的總離子流圖

2.6 檸檬烯的紅外光譜分析

檸檬烯的紅外光譜如圖6所示,相關(guān)紅外光譜特征吸收峰歸屬如下:797.04和885.46 cm-1為碳?xì)滏I( C-H) 的彎曲振動(dòng),1 644.62 cm-1為碳碳雙鍵(C=C) 的平面伸縮振動(dòng),2 917.15 cm-1和2 965.02 cm-1為碳?xì)滏I(C-H) 的伸縮振動(dòng)峰。

圖6 檸檬烯的紅外譜圖

2.7 檸檬烯的抑菌性能及最小抑菌濃度

檸檬烯對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌作用明顯,抑菌圈直徑(32.47±1.26)mm。檸檬烯對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌測(cè)試結(jié)果,如圖7所示。

圖7 檸檬烯對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果

當(dāng)采用 40%乙醇做乳化劑稀釋檸檬烯原液時(shí),當(dāng)檸檬烯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.31‰時(shí),抑菌率低于10%;當(dāng)檸檬烯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.63‰時(shí),抑菌率均為82%;當(dāng)檸檬烯質(zhì)量分?jǐn)?shù)等于或高于1.25‰時(shí),檸檬烯的抑菌率均為100%,檸檬烯的最小抑菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.25‰。

3 結(jié)論

水蒸氣蒸餾法提取新鮮橙皮中檸檬烯具有設(shè)備簡(jiǎn)單、流程方便、適合實(shí)驗(yàn)室操作的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選擇原料破碎尺寸、原料預(yù)處理時(shí)間、無機(jī)添加物、添加劑比例作為影響因素,確定橙皮中檸檬烯提取工藝的最優(yōu)條件為0.6 cm×0.6 cm橙皮50 g,預(yù)先用100 mL蒸餾水浸泡8 h后加入4%的碳酸鈉,水蒸氣蒸餾時(shí)間為1 h。在此條件下,檸檬烯的產(chǎn)率為3.66%,對(duì)金黃色球葡萄菌的最小抑菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.25‰。以水蒸氣蒸餾的方法從橙皮中提取檸檬烯的實(shí)驗(yàn)研究,可為橘橙柚類果皮中有用成分的提取和分離工藝研究提供數(shù)據(jù)參考,并具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。