劉娜娜 張俊嬌 張樊 吳聰英 姜玉武

（1.北京大學第一醫(yī)院兒科，北京 100034；2.兒科遺傳性疾病分子診斷與研究北京市重點實驗室，北京 100009；3.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院針灸科，北京 101121）

神經(jīng)母細胞瘤（neuroblastoma, NB）是兒童時期最常見的顱外實體瘤，主要見于嬰幼兒，約占兒童癌癥相關(guān)死亡率的15%［1］。它是一種起源于神經(jīng)嵴的發(fā)育性腫瘤［2］。NB 預(yù)后差異較大，可自行消退，發(fā)展為良性神經(jīng)節(jié)細胞瘤，以及逐漸進展為難治性腫瘤［3］。促進腫瘤細胞分化及凋亡的分子可能為治療NB的有效候選藥物。

神經(jīng)元分化是一個復(fù)雜的生物過程，受多種信號通路調(diào)控，包括轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路［4］、SHH 信號通路［5］、Wnt 信號通路［6］、Notch 信號通路［7］和RARs 信號通路［8］等。神經(jīng)元凋亡是神經(jīng)元的程序性死亡，是一種由基因決定的自我破壞過程。誘導腫瘤細胞凋亡有利于阻止腫瘤細胞的無限增殖，能有效抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。明確神經(jīng)元分化及腫瘤細胞凋亡的發(fā)生，有利于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。

阿達帕林是一種人工合成的第三代維甲酸類藥物，目前主要用于普通型痤瘡等皮膚病的外用治療［9-10］。有研究表明，阿達帕林可誘導黑色素瘤細胞（A375 和M14 細胞）［11］和角質(zhì)形成細胞（HaCat 細胞）的增殖和凋亡［12］；阿達帕林可抑制三陰性乳腺癌TNBC 細胞的生長、集落形成和遷移［13-14］；在結(jié)直腸癌細胞系中抑制腫瘤細胞增殖及誘導其凋亡［15］，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，該藥物對NB和神經(jīng)元發(fā)育的影響尚不明確。本研究旨在研究不同濃度阿達帕林對神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y 的影響，為阿達帕林可能用于治療NB提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 SH-SY5Y細胞培養(yǎng)

SH-SY5Y 細胞系由北京大學神經(jīng)科學研究所王韻教授所贈。SH-SY5Y 細胞用含10%胎牛血清（Gibco，美國）和1%青霉素-鏈霉素溶液（Gibco，美國）的DMEM/F12培養(yǎng)基（Thermo Scientific，美國），培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)皿中。置于37℃、5% CO2及95%濕度的培養(yǎng)箱（Thermo Scientific，美國）中孵育。培養(yǎng)基每周更換2次。

1.2 阿達帕林處理

將培養(yǎng)皿中密度為70%～80%的SH-SY5Y 細胞用0.25%胰蛋白酶（Gibco，美國）室溫消化30 s，加入SH-SY5Y細胞培養(yǎng)基終止消化，離心后取SHSY5Y 細胞沉淀，PBS 洗滌3 次后培養(yǎng)于新的培養(yǎng)皿中。SH-SY5Y 細胞傳代后第2 天，采用3 種不同濃度，即0.1 μM（低濃度）、1 μM（低濃度）、10 μM（高濃度）阿達帕林（Med Chem Express，美國）處理SH-SY5Y 細胞。在阿達帕林處理后7 d內(nèi)，觀察SH-SY5Y 細胞的形態(tài)變化過程。細胞實驗分為對照組和0.1 μM、1 μM、10 μM 阿達帕林組。

1.3 延時顯微拍攝

采用延時顯微拍攝技術(shù)觀察各組SH-SY5Y 細胞形態(tài)的動態(tài)變化。將SH-SY5Y 細胞置于INU 顯微鏡培養(yǎng)箱（Tokai Hit，日本）中孵育，設(shè)置該培養(yǎng)箱參數(shù)為37℃和5% CO2。使用CKX41 倒置顯微鏡（Olympus，日本）于第1、3、7 天進行拍攝，觀察并記錄同一區(qū)域SH-SY5Y 細胞及其突起的形態(tài)變化情況。

1.4 免疫熒光染色

1 μM 阿達帕林處理SH-SY5Y 細胞后，用4%多聚甲醛固定20 min，然后用0.3% Triton X-100 處理15 min。用含3%牛血清白蛋白和0.1% Triton X-100 的封閉液在室溫下封閉1 h，加入兔抗β-微管蛋白Ⅲ（βⅢ-tubulin；CST，美國；1∶400）和小鼠抗神經(jīng)絲重鏈多肽（neurofilament heavy polypeptide，NFH；CST，美國；1∶400）一抗，4℃下過夜。PBS 洗滌3 次后，加入Alexa Fluor 488（Invitrogen，美 國；1∶500） 和Alexa Fluor 568（Invitrogen，美國；1∶500）二抗，室溫下孵育1 h。在室溫下用2 μg/mL Hoechst 33258處理15 min以使細胞核染色，于共聚焦顯微鏡（Olympus，日本）下進行觀察。實驗獨立重復(fù)4次。

1.5 多電極陣列記錄

利用多電極陣列（3Brain，瑞士）技術(shù)記錄阿達帕林誘導SH-SY5Y 細胞的自發(fā)放電活動。將未處理的SH-SY5Y細胞培養(yǎng)在多電極陣列CMOS芯片（Plexon，中國香港）上，用1 μM阿達帕林進行處理后，繼續(xù)培養(yǎng)于CO2孵育箱中。予1 μM 阿達帕林處理4 d后進行自發(fā)放電活動監(jiān)測，每組于同一時間點均至少記錄5 min，使用BrainWave 4分析軟件（3Brain，瑞士）進行離線分析。實驗獨立重復(fù)3次。

1.6 細胞凋亡檢測

將SH-SY5Y 細胞培養(yǎng)于共聚焦顯微鏡皿內(nèi)，予10 μM 阿達帕林處理1 d，按照磷脂結(jié)合蛋白Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（C1062L，碧云天，中國）和活細胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3 活性與Annexin V 細胞凋亡檢測試劑盒（C1077M，碧云天，中國）說明書進行檢測。Annexin V/碘化丙啶（propidium iodide， PI）雙染為每皿細胞加入195 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液、5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI 染色液的混合液；caspase-3/Annexin V 雙染為每皿細胞中加入194 μL Annexin V-mCherry 緩 沖 液、 5 μL Annexin VmCherry 和1 μL GreenNuc ? caspase-3 Substrate（1 mM）混合液。將上述混合液分別搖勻后于室溫下避光孵育20 min。隨后于共聚焦顯微鏡下進行觀察。實驗均獨立重復(fù)5次。

1.7 統(tǒng)計學分析

使用GraphPad Prism軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均值±標準差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度阿達帕林對SH-SY5Y 細胞形態(tài)的影響

對照組SH-SY5Y 細胞突起較少且短。給予0.1 μM 阿達帕林處理后，SH-SY5Y 細胞被誘導形成較長突起，且突起可見分支，隨培養(yǎng)時間延長，突起之間可相互連接形成網(wǎng)絡(luò)。1 μM 阿達帕林處理后，SH-SY5Y 細胞被誘導形成較長且分支狀突起，隨培養(yǎng)時間延長，突起之間也可相互連接形成網(wǎng)絡(luò)。10 μM 阿達帕林處理后，第1 天SH-SY5Y細胞突起較長，可見分支；第3、7 天SH-SY5Y 細胞突起消失，胞體呈球形。見圖1。

圖1 不同濃度阿達帕林處理第1、3、7天SH-SY5Y細胞形態(tài)變化（×20） 對照組細胞突起較少且短。不同濃度阿達帕林處理后，0.1 μM、1 μM阿達帕林組細胞突起較長，可見分支；隨培養(yǎng)時間延長，突起之間可相互連接形成網(wǎng)絡(luò)。10 μM阿達帕林組處理后第1天細胞突起較長，可見分支；第3、7天細胞突起消失，胞體呈球形。

圖2 1 μM阿達帕林處理4 d后SH-SY5Y細胞βⅢ-tubulin及NFH表達（共聚焦顯微鏡，×60） βⅢ-tubulin陽性表達為綠色熒光、NFH陽性表達為紅色熒光。與對照組相比，1 μM阿達帕林組βⅢ-tubulin和NFH的相對熒光強度升高。

2.2 1 μM 低濃度阿達帕林誘導SH-SY5Y 細胞突起形成過程中的βⅢ-tubulin和NFH表達

與對照組相比，1 μM 阿達帕林組SH-SY5Y 細胞βⅢ-tubulin 和NFH 的相對熒光強度升高（分別為57.3±6.1 vs 65.4±3.5，44.5±1.7 vs 65.5±13.3；P＜0.05）。提示低濃度阿達帕林可誘導SH-SY5Y 細胞突起形成，即神經(jīng)纖維的形成；同時，可誘導SH-SY5Y細胞向成熟神經(jīng)元分化。

2.3 低濃度阿達帕林誘導SH-SY5Y 細胞的功能變化

結(jié)果顯示，0.1 μM 及1 μM 低濃度阿達帕林處理SH-SY5Y 細胞4 d 后，均可觀察到自發(fā)電活動（圖3）；對照組中未觀察到自發(fā)電活動。提示低濃度阿達帕林可誘導SH-SY5Y 細胞分化成為成熟的功能性神經(jīng)元。

圖3 低濃度阿達帕林處理SH-SY5Y 細胞4 d 后電活動的多電極陣列測定 0.1 μM（A）和1 μM（B）阿達帕林組可觀察到自發(fā)電活動。

2.4 高濃度阿達帕林對SH-SY5Y細胞凋亡的影響

與對照組相比，10 μM 阿達帕林組Annexin V和PI 的相對熒光強度升高（分別為71.2±3.2 vs 96.3±19.5，51.4±1.1 vs 56.4±2.5；P＜0.05），而且可觀察到Annexin V和PI的部分共染現(xiàn)象。見圖4。提示高濃度阿達帕林可誘導SH-SY5Y 細胞的凋亡。

圖4 10 μM阿達帕林處理1 d后SH-SY5Y細胞的細胞凋亡情況（共聚焦顯微鏡，×60） Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。與對照組相比，10 μM阿達帕林組Annexin V和PI相對熒光強度升高。

與對照組相比，10 μM阿達帕林組caspase 3和Annexin V 的相對熒光強度升高（分別為51.6±4.9 vs 77.8±13.5，65.4±3.5 vs 133.6±63.4；P＜0.05），而且可觀察到caspase 3 和Annexin V 的部分共染現(xiàn)象。見圖5。提示高濃度阿達帕林可誘導SH-SY5Y細胞凋亡，這一凋亡作用可能由caspase 途徑介導。

圖5 10 μM 阿達帕林處理1 d 后SH-SY5Y 細胞中caspase 3 活性和細胞凋亡情況（共聚焦顯微鏡，×60）細胞內(nèi)caspase 3 活性高的凋亡細胞核呈綠色熒光，凋亡細胞的細胞膜呈紅色熒光。與對照組相比，10 μM 阿達帕林組caspase 3及Annexin V相對熒光強度升高。

3 討論

SH-SY5Y 細胞是由人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH細胞經(jīng)歷克隆形成，被廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究［16-18］。未分化的SH-SY5Y 細胞不完全具備神經(jīng)元的特征，而分化成熟的SH-SY5Y 細胞可具備成熟神經(jīng)元的特征，如形態(tài)學上可見明顯細胞突起，功能上細胞興奮性增強，可通過添加多種化合物誘導SH-SY5Y 細胞的分化［19］，并可通過添加特定物質(zhì)誘導其分化成特定類型神經(jīng)元［20］。該細胞系狀態(tài)穩(wěn)定且易于生長。

以往研究中，維甲酸是維生素A 活性代謝產(chǎn)物之一，通常被用來將神經(jīng)母細胞瘤細胞系SHSY5Y細胞誘導分化為神經(jīng)元［21］。本研究中，使用阿達帕林研究其對SH-SY5Y細胞的誘導分化作用，使用不同濃度阿達帕林處理SH-SY5Y 細胞，通過采用延時顯微拍攝技術(shù)于不同時間點觀察SHSY5Y 細胞形態(tài)，結(jié)果提示低濃度阿達帕林可促進SH-SY5Y 細胞的突起形成，突起之間形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進而促進細胞之間的相互聯(lián)系。由此可知，SHSY5Y 細胞可被誘導分化為神經(jīng)元樣細胞，可以觀察到神經(jīng)元樣突起形成。為明確低濃度阿達帕林可誘導SH-SY5Y 細胞成神經(jīng)元，本研究通過免疫熒光觀察神經(jīng)元特異性標志物βⅢ-tubulin 和成熟神經(jīng)元標志物NFH 的表達情況。結(jié)果表明，低濃度阿達帕林組SH-SY5Y 細胞βⅢ-tubulin 和NFH 表達高于對照組。NFH具有穩(wěn)定神經(jīng)元軸突的作用，常作為成熟神經(jīng)元的重要標志物。以上提示，低濃度阿達帕林可誘導SH-SY5Y 細胞分化為成熟神經(jīng)元。為了明確低濃度阿達帕林誘導分化的成熟神經(jīng)元功能，本研究采用多電極陣列技術(shù)對誘導分化后的SH-SY5Y 細胞進行電生理記錄，觀察到低濃度阿達帕林誘導分化后的SH-SY5Y 細胞有自發(fā)放電活動，提示低濃度阿達帕林可誘導SHSY5Y 細胞成為成熟的功能性神經(jīng)元。這與以往研究中使用AM580 誘導SH-SY5Y 細胞分化為有功能的成熟神經(jīng)元的研究結(jié)果一致［19］。

促進腫瘤細胞凋亡是大多數(shù)抗腫瘤藥物發(fā)揮藥效的重要機制。既往研究證實，隨培養(yǎng)時間延長，不同濃度阿達帕林（2.5 μM、5 μM、10 μM）可抑制黑色素瘤A375 和M14 細胞的集落形成，通過抑制DNA 修復(fù)進而引發(fā)細胞顯著的S 期阻滯和凋亡［11］；另有研究表明，不同濃度阿達帕林（2 μM、4 μM、6 μM）可抑制HaCat細胞的克隆形成，引起細胞S期阻滯和凋亡，這一機制可能使阿達帕林用于表皮增生性疾病的治療［12］。在本研究中，為了明確高濃度阿達帕林對SH-SY5Y 細胞的影響，阿達帕林處理濃度升至10 μM，發(fā)現(xiàn)SHSY5Y 細胞突起逐漸消失，胞體逐漸回縮成球形，隨培養(yǎng)時間延長，上述現(xiàn)象逐漸明顯。為了進一步明確高濃度阿達帕林對SH-SY5Y 細胞凋亡的影響，通過檢測細胞凋亡標志物，結(jié)果表明，高濃度阿達帕林組SH-SY5Y 細胞表達神經(jīng)元早期凋亡標志物磷脂結(jié)合蛋白Annexin V、晚期凋亡及壞死標志物PI 以及神經(jīng)元凋亡標記物caspase 3 均高于對照組。以上表明，高濃度阿達帕林可以誘導SHSY5Y細胞凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)低濃度和高濃度阿達帕林對SH-SY5Y 細胞分別具有誘導分化為成熟的功能性神經(jīng)元和誘導凋亡的作用。為NB的臨床有效藥物治療提供實驗依據(jù)。

作者貢獻聲明：劉娜娜負責SH-SY5Y 細胞多電極陣列檢測細胞放電實驗及細胞凋亡檢測實驗、實驗數(shù)據(jù)分析、文章撰寫和修改；張俊嬌負責SHSY5Y 細胞的培養(yǎng)及形態(tài)學觀察實驗；張樊負責SH-SY5Y 細胞的培養(yǎng)及不同濃度藥物處理；吳聰英老師提供實驗技術(shù)支持，幫助進行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計，修訂文章初稿；姜玉武教授提供基金支持，負責課題的設(shè)計、指導和監(jiān)督，并在實驗過程中提供寶貴的專業(yè)意見。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。