劉弘飛,胡金龍,彭俊斌,胡知齊

(1.蚌埠醫(yī)科大學(xué) 研究生院,安徽 蚌埠233030;2.安徽省第二人民醫(yī)院 普外科,安徽 合肥230041)

最新WHO全球癌癥流行病學(xué)調(diào)查研究顯示[1],乳腺癌已取代肺癌成為全球最高發(fā)的癌癥,并且是導(dǎo)致女性病人癌癥因素死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤,需引起臨床醫(yī)生的高度重視。腫瘤微環(huán)境(TME)與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),其中,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)浸潤(rùn)是乳腺癌免疫微環(huán)境改變的重要組成部分,白細(xì)胞分化抗原分子68(CD68)被認(rèn)為是TAMs活化、浸潤(rùn)的主要標(biāo)志物之一,研究乳腺癌TAMs浸潤(rùn)情況及可能的調(diào)控手段,對(duì)于乳腺癌診斷和治療具有積極意義[2]。干擾素基因刺激因子(STING)是cGAS-STING信號(hào)通路的核心調(diào)節(jié)分子,近年來(lái),關(guān)于其在惡性腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的相關(guān)研究報(bào)道越來(lái)越多,其表達(dá)與泛腫瘤預(yù)后及免疫治療響應(yīng)性密切相關(guān)[3]。因此,STING信號(hào)通路能夠逐漸成為研發(fā)TME免疫調(diào)節(jié)劑的熱門(mén)靶點(diǎn)[4]。目前,關(guān)于cGAS-STING信號(hào)通路是否參與調(diào)控乳腺癌TAMs浸潤(rùn)鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。因此,我們通過(guò)免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè)乳腺癌及其癌旁組織中cGAS-STING信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白STING和TAMs主要標(biāo)志物CD68的表達(dá),分析這兩種蛋白的表達(dá)與病人臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,結(jié)合癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析,探討STING與CD68表達(dá)、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)性,為臨床診療提供參考?，F(xiàn)作報(bào)道。

1 材料與方法

1.1材料

本研究用于IHC實(shí)驗(yàn)的主要試劑包括:無(wú)水乙醇、二甲苯、包埋石蠟、中性樹(shù)脂,均購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán);蘇木素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;anti-STING抗體、山羊抗兔二抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司;重組anti-CD68抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天公司。

1.2方法

1.2.1 臨床資料 收集2014年7月至2018年10月在安徽省第二人民醫(yī)院普通外科住院接受乳腺癌改良根治術(shù)的乳腺癌病人的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)病理檢查證實(shí)為乳腺癌者;能夠獲取完整的臨床、病理、組織樣本資料者。排除標(biāo)準(zhǔn):資料不全者;合并其他惡性腫瘤者;術(shù)前行新輔助治療者。經(jīng)篩選,共入組83例,均為女性,年齡25～79歲,其中,參考NCCN 乳腺癌指南[5],腫瘤TNM分期:Ⅰ期5例,Ⅱ期64例,Ⅲ期14例;分子分型:LuminaA型26例,LuminaB型34例,人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(HER-2)陽(yáng)性8例,三陰性乳腺癌(TNBC)15例。所有入組病人均簽署知情同意書(shū),本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.2 IHC 采用SP法。常規(guī)進(jìn)行包埋、脫蠟等工作并阻斷過(guò)氧化物酶進(jìn)行封閉;滴加經(jīng)稀釋的一抗(STING與CD68,稀釋比例均為1∶1 000),后于4 ℃濕性環(huán)境中孵育過(guò)夜。PBS沖洗、吸干后滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗,37 ℃孵育20 min。再次PBS沖洗、吸干后滴加新鮮配制的DAB顯色液。再進(jìn)行復(fù)染、脫水、封片及拍照鏡檢。鏡下見(jiàn)STING蛋白和CD68蛋白在乳腺癌組織中主要定位于細(xì)胞質(zhì),呈棕黃色顆粒。

1.2.3 IHC結(jié)果判定 IHC結(jié)果需綜合著色深度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比率來(lái)評(píng)價(jià)。著色深度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下:基本不著色,0分;黃色,1分;棕黃色,2分;棕褐色,3分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比率評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下:隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察并記錄陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比率,取其平均值,≤5%,0分;>5%～25%,1分;>25%～50%,2分;>50%～75%,3分;>75%,4分;著色深度分?jǐn)?shù)×陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比率為最終得分,≥1為陽(yáng)性,<1為陰性。

1.2.4 隨訪資料 所有本組病人術(shù)后常規(guī)進(jìn)行門(mén)診隨訪,以病人術(shù)后出院日期為隨訪起始時(shí)間,截至本文投稿時(shí)間,隨訪2～5年不等。按STING表達(dá)水平進(jìn)行分組,比較各組內(nèi)生存指標(biāo)差異。所關(guān)注生存指標(biāo)為總生存期(OS),指從術(shù)后隨訪開(kāi)始至因任何原因引起死亡的時(shí)間,對(duì)于失訪者將最后一次隨訪時(shí)間計(jì)為死亡時(shí)間,按月計(jì)。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 為進(jìn)一步研究cGAS-STING信號(hào)通路與TAMs浸潤(rùn)的關(guān)系,進(jìn)行生物信息學(xué)分析。首先,通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cancergenome.nih.gov/)下載BRCA臨床數(shù)據(jù)和相應(yīng)的基因組mRNA芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)。然后,采用LI等[6]在線數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)進(jìn)行STING表達(dá)與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)性等數(shù)據(jù)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)和相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1乳腺癌組織及癌旁組織中STING蛋白和CD68蛋白的表達(dá)情況

納入本組研究的83例乳腺癌病人,其癌組織中STING蛋白陽(yáng)性表達(dá)為20例(20/83,24.1%),癌旁組織中為33例(33/83,39.7%),2組間陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.68,P<0.05),癌組織低于癌旁組織。癌組織中CD68陽(yáng)性表達(dá)為58例(58/83,69.8%),癌旁組織中為32例(32/83,38.5%),2組間陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.41,P<0.01),癌組織高于癌旁組織(見(jiàn)圖1)。

2.2乳腺癌組織中STING蛋白和CD68蛋白表達(dá)與病人臨床病理參數(shù)的關(guān)系

納入本組研究的83例乳腺癌病人,其STING蛋白陽(yáng)性表達(dá)與其HER-2陽(yáng)性率、Lumina分型之間有相關(guān)性(P<0.05);與雌激素受體(ER)陽(yáng)性率、孕激素受體(PR)陽(yáng)性率、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。CD68蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況與其Lumina分型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.05);與ER陽(yáng)性率、PR陽(yáng)性率、HER-2陽(yáng)性率之間無(wú)相關(guān)性(P>0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 乳腺癌病人臨床病理參數(shù)與STING、CD68蛋白陽(yáng)性表達(dá)之間的關(guān)系(n)

2.3乳腺癌組織中STING蛋白和CD68蛋白表達(dá)情況的相關(guān)性分析

應(yīng)用Kappa一致性檢驗(yàn)對(duì)本組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,其結(jié)果顯示,本組研究資料中,STING蛋白與CD68蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(Kappa=0.241,P<0.01)。應(yīng)用TIMER在線數(shù)據(jù)庫(kù)針對(duì)TGCA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析,STING蛋白與CD68蛋白的表達(dá)呈明顯正相關(guān)關(guān)系(r=0.636,P<0.01)。

2.4STING蛋白表達(dá)與乳腺癌TME免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的關(guān)系

應(yīng)用TIMER在線數(shù)據(jù)庫(kù)針對(duì)TGCA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。STING表達(dá)與乳腺癌及其各亞型的免疫微環(huán)境中巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞浸潤(rùn)情況普遍具有正相關(guān)性,說(shuō)明cGAS信號(hào)通路深度參與乳腺癌免疫微環(huán)境調(diào)控。其中,TGCA乳腺癌整體隊(duì)列(1 095例)STING表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.01);各分子亞型中,LuminaA+B型乳腺癌病人,STING表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),TNBC病人STING表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.01),HER-2陽(yáng)性病人STING表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)呈無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 STING蛋白表達(dá)與乳腺癌TME免疫細(xì)胞浸潤(rùn)間的相關(guān)系數(shù)(TIMER分析)

再進(jìn)一步分析STING表達(dá)與乳腺癌中巨噬細(xì)胞亞型浸潤(rùn)的相關(guān)性,采用巨噬細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行分類(lèi),TAMs以CD68、CCL2、IL10標(biāo)識(shí),M1型巨噬細(xì)胞以NOS2、IRF5、PTGS2標(biāo)識(shí)、M2型巨噬細(xì)胞以CD163、VSIG4、MS4A4A標(biāo)識(shí),分別比較STING表達(dá)與各標(biāo)志物的相關(guān)性。TGCA數(shù)據(jù)庫(kù)整體乳腺癌隊(duì)列,STING表達(dá)與各標(biāo)志物呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),LuminaA+B型乳腺癌病人,STING表達(dá)與各標(biāo)志物呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),TNBC病人、HER-2陽(yáng)性病人,STING表達(dá)與各標(biāo)志物無(wú)明顯相關(guān)性(見(jiàn)表3)。

表3 STING蛋白表達(dá)與乳腺癌TME中各類(lèi)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的相關(guān)系數(shù)(r)

2.5病人隨訪情況

對(duì)83例乳腺癌病人術(shù)后進(jìn)行密切隨訪,所有病人失訪2例,存活53例,死亡28例,其中因乳腺癌死亡25例;復(fù)發(fā)46,未復(fù)發(fā)37例。全組病人中位OS為25.5個(gè)月,其中,STING高表達(dá)組中位OS為42個(gè)月(95%CI:34.263～49.458),STING低表達(dá)組中位OS為19個(gè)月(95%CI:17.614～23.683)。2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.25,P<0.05)。

3 討論

乳腺癌是女性最常見(jiàn)和最容易導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的惡性腫瘤之一[1],國(guó)內(nèi)外臨床診療指南對(duì)于乳腺癌病人進(jìn)行TNM分期和分子分型有助于其整體治療方案的選擇和預(yù)后的判斷[5,7]。但是在實(shí)際臨床工作過(guò)程中卻存在一定的局限性,特別是隨著以免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICIs)為代表的腫瘤免疫治療的發(fā)現(xiàn)和興起,為調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能正常化,能夠更加準(zhǔn)確地進(jìn)行免疫微環(huán)境分類(lèi)以及如何研發(fā)新的治療方法提高免疫治療效果將會(huì)是新的難題[8]。

TME與惡性腫瘤免疫分型及ICIs響應(yīng)性密切相關(guān),檢測(cè)及評(píng)估TME有助于指導(dǎo)病人進(jìn)行惡性腫瘤的精準(zhǔn)治療[9]。TAMs是TME重要的組成部分,一般以CD68為重要的標(biāo)志物,其表達(dá)與乳腺癌等惡性腫瘤的進(jìn)展及不良預(yù)后密切相關(guān)[10]。本研究中,乳腺癌病人癌組織中CD68陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織,且其表達(dá)情況與病人的TNM分期、分子分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床指標(biāo)相關(guān),這與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果基本一致,反映出TAMs作為乳腺癌病人預(yù)后評(píng)估指標(biāo)及提高免疫治療效果的干預(yù)指標(biāo)的可行性。

TAMs在腫瘤組織內(nèi)充當(dāng)著“多面手”的角色,根據(jù)功能表型的不同,TAMs在腫瘤早期可分化為M1型發(fā)揮吞噬、識(shí)別腫瘤細(xì)胞的作用,腫瘤進(jìn)展期也可分化為M2型分泌大量細(xì)胞因子,促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展,幫助腫瘤細(xì)胞獲得耐藥性[11]。也有觀點(diǎn)認(rèn)為先天性免疫系統(tǒng)功能缺失,在腫瘤早期形成階段,導(dǎo)致癌細(xì)胞基因突變累積及DNA受損修復(fù)機(jī)制的缺失,可能與TAMs早期浸潤(rùn)、識(shí)別相關(guān)[12]。而cGAS-STING作為經(jīng)典的先天性免疫應(yīng)答信號(hào)通路,被證實(shí)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系。其核心調(diào)節(jié)分子是存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的STING,在腫瘤細(xì)胞發(fā)生的早期,自身DNA損傷出現(xiàn)核泄漏時(shí),發(fā)揮類(lèi)似于“哨兵”的識(shí)別作用,并激活下游通路,產(chǎn)生Ⅰ型干擾素(INF-β),達(dá)到募集并激活免疫細(xì)胞、驅(qū)化多種催化因子表達(dá)的作用,進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。多種腫瘤組織內(nèi)STING蛋白處于低表達(dá)狀態(tài),可能與其參與免疫抑制及免疫逃逸相關(guān)[13]。

本研究中,乳腺癌組織中的STING蛋白陽(yáng)性表達(dá)低于癌旁組織,其表達(dá)水平與病人整體預(yù)后密切相關(guān),高表達(dá)STING的病人整體生存率顯著高于低表達(dá)組,可能與STING發(fā)揮免疫識(shí)別作用有關(guān)。為了進(jìn)一步分析STING信號(hào)通路對(duì)于免疫微環(huán)境的影響,課題組結(jié)合TGCA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息分析,發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中,STING表達(dá)水平與幾乎各類(lèi)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)都有關(guān)系,是進(jìn)行免疫微環(huán)境調(diào)控的理想靶點(diǎn)。并且,其表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密切尤為相關(guān),在不同分子表型的乳腺癌中STING的表達(dá)與巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)及分化呈現(xiàn)出明顯的差異,在特定類(lèi)型的乳腺癌,如TNBC、HER-2陽(yáng)性乳腺癌組織中,STING蛋白水平表達(dá)甚至能夠與TAMs是否發(fā)生M1/M2型極化密切相關(guān)。這些研究結(jié)果均反映出STING信號(hào)通路的活化可能深度參與腫瘤微環(huán)境中TAMs的浸潤(rùn)及極化。

STING激動(dòng)劑的研發(fā)是免疫治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn),多種核苷酸類(lèi)藥物和非核苷酸類(lèi)藥物被開(kāi)發(fā)作為免疫治療、增敏藥物或免疫佐劑,能夠發(fā)揮很好的抗腫瘤和協(xié)同抗腫瘤效果[4]。但是,目前關(guān)于STING激動(dòng)劑是否能夠通過(guò)調(diào)控TAMs浸潤(rùn)及M1/M2型巨噬細(xì)胞極化而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用鮮有報(bào)道。TAMs已經(jīng)被證實(shí)與癌癥進(jìn)展,特別是早期TME改變密切相關(guān)[14],但其功能調(diào)控極其復(fù)雜,難以為免疫調(diào)節(jié)提供理想的靶點(diǎn)[15]。雖然cGAS-STING信號(hào)通路不是TAMs的專(zhuān)屬調(diào)控通路,但本研究通過(guò)生物信息分析、IHC及臨床病理分析,充分驗(yàn)證了STING信號(hào)通路參與TAMs調(diào)控的可能性,以期為后續(xù)STING激動(dòng)劑應(yīng)用于乳腺癌,特別是以TAMs為目標(biāo)的,免疫微環(huán)境調(diào)控提供一定的理論和實(shí)踐支持,相關(guān)干預(yù)試驗(yàn)工作有嘗試研究的價(jià)值。

綜上所述,本研究通過(guò)生物信息分析、IHC、臨床病理分析等多種方法,研究了cGAS-STING信號(hào)通路可能參與腫瘤相關(guān)局勢(shì)細(xì)胞的浸潤(rùn)及極化,STING蛋白及CD68蛋白的表達(dá)對(duì)于評(píng)價(jià)腫瘤免疫學(xué)分型及指導(dǎo)乳腺癌治療和預(yù)后判斷均具有一定的參考價(jià)值。但本研究樣本量較小,為回顧性分析,證據(jù)等級(jí)較低,需要進(jìn)行后續(xù)隨機(jī)對(duì)照研究或大樣本調(diào)查獲得更高的臨床證據(jù)支持。