田海軍,姜漢軍,任勝杰,楊治國(guó)

(1.信陽農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院,河南 信陽 464000;2.浙江淡水水產(chǎn)研究所,浙江 湖州 313001)

表面活性劑被廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和日常生活中,可顯著改變表(界)面的物理化學(xué)性質(zhì),具有潤(rùn)濕、乳化、起泡以及增溶、分散、洗滌、防腐、抗靜電等多項(xiàng)功能[1]。據(jù)中國(guó)洗滌用品工業(yè)協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)預(yù)測(cè),2022年我國(guó)表面活性劑市場(chǎng)總量達(dá)461.5萬 t,預(yù)計(jì)未來幾年內(nèi)將呈現(xiàn)增長(zhǎng)的發(fā)展態(tài)勢(shì)[2]。表面活性劑中陰離子型占比最多,約占65%～80%[2]。陰離子型表面活性劑統(tǒng)稱直鏈烷基苯磺酸鈉(LAS),國(guó)內(nèi)檢出頻率較高的是十二烷基苯磺酸鈉(sodium dodecyl benzene sulfonate,SDBS)[3]。此外,水體陰離子表面活性劑相關(guān)分析方法中使用的參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也均為SDBS。

陰離子表面活性劑隨著工農(nóng)業(yè)和生活污水進(jìn)入水環(huán)境中,在水面形成泡沫,會(huì)破壞水體溶解氧的動(dòng)態(tài)平衡,造成水質(zhì)惡化,影響水生生物的生長(zhǎng)。GB 3097—1997《國(guó)家海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定:1類海水中ρ(LAS)≤0.03 mg·L-1,2～4類海水中ρ(LAS)≤0.1 mg·L-1。GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定ρ(LAS) ≤ 0.20 mg·L-1。

諸多學(xué)者開展了表面活性劑對(duì)水生生物毒性研究,水體SDBS的毒性研究對(duì)象有凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[4]、安氏偽鏢水蚤(Pseudodiaptomusannandalei)[5]、黃河鯉(Cyprinuscarpio)[6]、褐點(diǎn)石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus)[7]、刺參(Apostichopusjaponicus)[8]、雙小核草履蟲(Parameciumprimaurelia)[9]、中華倒刺鲃(Spinibarbussinensis)[10]、奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus)[11]和大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)[12]等。上述研究集中在急性毒性及生理生化影響方面,有關(guān)環(huán)境相關(guān)濃度下SDBS對(duì)魚類的亞急性毒性效應(yīng)尤其是神經(jīng)毒性方面的研究尚鮮見報(bào)道。

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)肉質(zhì)鮮美,是我國(guó)的特種經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類之一。環(huán)境問題嚴(yán)重制約了黃顙魚養(yǎng)殖的健康持續(xù)發(fā)展,如水污染等給黃顙魚養(yǎng)殖帶來嚴(yán)重影響[13-14],急需加強(qiáng)水環(huán)境污染物對(duì)黃顙魚影響的機(jī)理研究。當(dāng)前尚未有SDBS對(duì)黃顙魚毒性的相關(guān)研究報(bào)道。黃顙魚作為毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)材料,具有繁殖技術(shù)成熟、胚胎發(fā)育觀察容易、全基因組測(cè)序已完成、便于開展分子毒理學(xué)研究等優(yōu)點(diǎn)。

水環(huán)境暴露能更真實(shí)地反映SDBS等陰離子表面活性劑在實(shí)際環(huán)境中的暴露影響情況,有利于科學(xué)評(píng)估陰離子表面活性劑的水環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。為評(píng)估水體SDBS濃度對(duì)黃顙魚早期發(fā)育階段的胚胎發(fā)育毒性和神經(jīng)毒性的影響,筆者探討了不同SDBS濃度暴露下黃顙魚胚胎的孵化死亡率和畸形率,檢測(cè)了仔魚腦組織的乙酰膽堿酯酶活性及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平以及5-羥色胺含量及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平,探討其神經(jīng)毒性的潛在機(jī)制,為進(jìn)一步評(píng)估水體陰離子表面活性劑污染對(duì)水生動(dòng)物的毒性作用機(jī)制提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用黃顙魚親本來自武漢市水產(chǎn)科學(xué)研究所,親本雌雄比例為1∶1,雌魚體長(zhǎng)(171.3±9.0)mm,體重(101.4±16.5)g;雄魚體長(zhǎng)(242.1±11.6)mm,體重(193.4±19.6)g。親本共300尾在學(xué)院實(shí)訓(xùn)基地水泥池中流水加曝氣方式培育,設(shè)棕櫚產(chǎn)卵巢,半球形(直徑25 cm,深12 cm);培育水溫(24.5±0.3)℃,pH值 為7.0～7.5,ρ(DO)為6.70～9.50 mg·L-1;光暗周期為12 h∶12 h,每日投喂 2 次黃顙魚專用飼料。黃顙魚產(chǎn)卵后收集并清洗受精胚胎,置于培養(yǎng)箱中,溫度設(shè)置為(24.5±0.3)℃,于 4 h 后置于顯微鏡下挑除死亡胚胎,選取正常發(fā)育受精胚胎,分組暴露于不同濃度的SDBS溶液中。

1.2 主要試劑與儀器

試劑:SDBS為分析純(國(guó)藥集團(tuán)河南化學(xué)試劑有限公司),乙酰膽堿酯酶(AChE)和5-羥色胺(5-HT)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

儀器:體式顯微鏡(Olympus-SZ61,日本奧林巴斯),全自動(dòng)樣品冷凍研磨儀(JXFSTPRP-64L,上海凈信),高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5424R,德國(guó)艾本德),酶標(biāo)儀(DR200-BC,無錫德朗),熒光定量PCR儀(CFX-96,美國(guó)Bio-Rad)。

1.3 胚胎及仔魚暴露實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)挑選受精 4 h 后發(fā)育正常、大小相近的黃顙魚胚胎進(jìn)行染毒暴露實(shí)驗(yàn)。參考GB 3838—2002規(guī)定,結(jié)合課題組前期測(cè)定SDBS對(duì)黃河鯉急性毒性和生理生化指標(biāo)的影響[6]以及淮河上游大型水庫(kù)水樣中陰離子表面活性劑濃度部分?jǐn)嗝娉瑯?biāo)(0.3～0.8 mg·L-1)的實(shí)際現(xiàn)狀,確定 0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·L-1作為實(shí)驗(yàn)暴露質(zhì)量濃度(配制SDBS溶液的水質(zhì)為超純水,實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度分別為0、0.19、0.38、0.58、0.77 mg·L-1,后面統(tǒng)一為設(shè)計(jì)暴露濃度),間隔 24 h更換新配制的暴露溶液,以保證濃度恒定。設(shè)置 3 組平行,暴露實(shí)驗(yàn)容器采用 12孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔放置 30 枚胚胎,暴露溶液每 24 h 更換1次,保證各組濃度保持不變。暴露期間水溫保持(24.5±0.3)℃,光暗周期設(shè)置為 12 h∶12 h。及時(shí)挑出死亡胚胎以防對(duì)其他胚胎造成污染,并統(tǒng)計(jì)胚胎孵化累計(jì)死亡率和畸形率(畸形胚胎數(shù)/孵化脫膜胚胎總數(shù)×100%),胚胎發(fā)育中如出現(xiàn)卵黃異常、腦和脊髓分化異常、體彎曲、心包異常等現(xiàn)象均統(tǒng)計(jì)為胚胎畸形。暴露至孵化出5日齡仔魚停止。

1.4 神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿酯(AChE)酶活性和5羥色胺(5-HT)含量

每個(gè)暴露組隨機(jī)取6尾5日齡正常仔魚的腦組織混樣。另外,每個(gè)暴露組采集全部的5日齡成活畸形仔魚腦組織進(jìn)行混樣,共30個(gè)生物學(xué)重復(fù)。用去離子水清洗 2～3 次,加入0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液 300 μL,置于 2.5 mL離心管內(nèi) 4 ℃勻漿 400 s,加入 700 μL磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行清洗轉(zhuǎn)移。4 ℃下 2 500 r·min-1離心 10 min(離心半徑為13.5 cm),取上清液待測(cè)AChE酶活性和5-HT含量。在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度值,記錄并處理數(shù)據(jù)。

1.5 熒光定量 PCR 檢測(cè)相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量

每個(gè)暴露組取10尾5日齡仔魚腦組織混樣作為一個(gè)重復(fù),共3個(gè)生物學(xué)重復(fù),液氮速凍后儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中以進(jìn)行基因表達(dá)分析。置于冰上勻漿,用 TRIzol 試劑抽提總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA,引物序列見表 1。PCR 反應(yīng)程序設(shè)定如下:cDNA 模板2.0 μL,正、反向引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL,熒光預(yù)混液12.5 μL,雙蒸水8.5 μL,95 ℃ 預(yù)變性3 min,95 ℃變性10 s,55 ℃退火10 s,72 ℃ 延伸20 s(循環(huán)40 次),72 ℃最終延伸5～10 min。設(shè)定對(duì)照組仔魚的乙酰膽堿酯酶基因(ache)、5羥色胺基因(5-ht)的 mRNA 相對(duì)表達(dá)量為1.00,結(jié)果采用2-ΔΔCt相對(duì)表達(dá)量算法確定 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和鄧肯檢驗(yàn)(Duncan′s test)比較,檢驗(yàn)時(shí)需驗(yàn)證數(shù)據(jù)的方差齊性(方差不齊時(shí)可采用Welch ANOVA或Brown-Forsythe ANOVA進(jìn)行分析),P<0.05表示有顯著性差異。

表1 神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 胚胎孵化累計(jì)死亡率與畸形率變化

如圖1所示,與對(duì)照相比,不同暴露濃度下黃顙魚胚胎孵化死亡率和胚胎畸形率分別提高7.8～23.4和4.5～14.5百分點(diǎn),均呈顯著上升趨勢(shì)(P<0.05)。

同一幅圖中直方柱上方英文小寫字母不同表示不同暴露濃度間某指標(biāo)差異顯著(P<0.05)。

如圖2所示,顯微鏡(4×10倍)觀察發(fā)現(xiàn),暴露處理后黃顙魚胚胎存在著心包水腫(心臟異常)、卵黃水腫、身體卷曲、脊椎彎曲、頭部畸形等現(xiàn)象。

a—心包水腫,b—卵黃水腫,c—身體卷曲,d—脊椎彎曲,e—頭部畸形。

2.2 神經(jīng)遞質(zhì)AChE酶活性和5-HT含量變化

如圖3所示,伴隨著暴露濃度的升高,黃顙魚仔魚腦組織AChE酶活性和5-HT含量呈下降趨勢(shì),均顯著低于對(duì)照(P<0.05)。與對(duì)照相比,各劑量暴露組正常仔和畸形仔魚腦組織AChE酶活性分別顯著降低12.0%～50.5%和15.0%～53.9%(P<0.05),5-HT含量分別顯著降低2.6%～9.9%和3.0%～11.1%(P<0.05)。

同一幅圖中直方柱上方英文小寫字母不同表示不同暴露濃度間某指標(biāo)差異顯著(P<0.05)。

2.3 腦組織ache和5-ht基因mRNA相對(duì)表達(dá)量變化

如圖4所示,不同暴露濃度下仔魚腦組織ache和5-ht基因相對(duì)表達(dá)量隨SDBS暴露濃度的升高而下降。與對(duì)照相比,ache基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平在高濃度暴露組(0.8 mg·L-1)中被顯著抑制(P<0.05),5-ht基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平在0.4～0.8 mg·L-1濃度暴露組中被顯著抑制(P<0.05)。

同一幅圖中直方柱上方英文小寫字母不同表示不同暴露濃度間某指標(biāo)差異顯著(P<0.05)。

3 討論

3.1 SDBS暴露處理對(duì)黃顙魚胚胎影響及細(xì)胞毒性機(jī)制

SDBS暴露處理的黃顙魚胚胎孵化畸形率提高了4.5～14.5百分點(diǎn)(P<0.05),死亡率提高了7.8～23.4百分點(diǎn)(P<0.05)。與葉遼遼等[12]測(cè)得ρ(SDBS)≥ 2.5 mg·L-1時(shí)大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)胚胎孵化率下降、畸形率上升有一定差異。上述結(jié)果證實(shí)SDBS暴露會(huì)導(dǎo)致胚胎孵化率下降和畸形率上升,但是效應(yīng)濃度不同可能是不同魚種的敏感性及孵化水溫差異等因素導(dǎo)致。分析其胚胎發(fā)育毒性的原因,可能是SDBS與細(xì)胞膜表面疏水部分結(jié)合,破壞了胚胎細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[15]。另外,由于SDBS暴露時(shí)會(huì)形成泡沫,可能導(dǎo)致水體溶解氧濃度下降,間接造成胚胎發(fā)育影響。同時(shí),SDBS能通過抑制機(jī)體的抗氧化作用從而造成細(xì)胞遺傳物質(zhì)的損傷,影響DNA轉(zhuǎn)錄與表達(dá)等[16]。鄭璐[17]研究發(fā)現(xiàn),6種表面活性劑均能引起細(xì)胞質(zhì)粒pBR322的DNA損傷,分析其原因?yàn)楸砻婊钚詣┡c細(xì)胞質(zhì)粒DNA直接結(jié)合導(dǎo)致。在這6種表面活性劑中磺酸型表面活性劑誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷的毒性較強(qiáng),推測(cè)其具有一定的遺傳毒性?？讕沎18]研究了陰離子表面活性劑導(dǎo)致細(xì)胞毒性的完整過程,通過熒光顯微鏡在線觀察到HPTS-Cn陰離子熒光表面活性劑首先與人皮膚成纖維細(xì)胞(HF)、人肝癌細(xì)胞系(HepG2)和人肝星形細(xì)胞(LX-2)細(xì)胞膜結(jié)合,隨后進(jìn)入細(xì)胞并聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腫脹;同時(shí),還觀察到了細(xì)胞骨架的破壞、隧道納米管(TNTs)的斷裂以及囊泡的產(chǎn)生。吳光潔[19]研究發(fā)現(xiàn),隨著十二烷基苯磺酸異丙胺鹽暴露濃度的增加,鯉魚肝細(xì)胞損傷逐漸加重,出現(xiàn)肝細(xì)胞空化、核遷移、核溶解、肝血竇擴(kuò)張充血等現(xiàn)象。以上研究初步探討了陰離子表面活性劑對(duì)細(xì)胞的毒性影響,但具體的細(xì)胞毒性機(jī)制需要更進(jìn)一步的研究。

3.2 SDBS暴露處理對(duì)黃顙魚神經(jīng)毒性及機(jī)制

ACh和5-HT是神經(jīng)元間重要的信息傳遞物質(zhì),其含量水平與黃顙魚的各項(xiàng)生理活動(dòng)密切相關(guān)。測(cè)定黃顙魚腦組織中能夠調(diào)節(jié)ACh信息傳遞活動(dòng)的AChE酶活性來作為神經(jīng)行為變化的進(jìn)一步證據(jù)。AChE酶能夠降解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿,與神經(jīng)傳導(dǎo)密切相關(guān),對(duì)黃顙魚胚胎的神經(jīng)發(fā)育至關(guān)重要,是常被用于評(píng)估神經(jīng)毒性的生理學(xué)指標(biāo)之一[20]。當(dāng)AChE酶活性受到抑制時(shí)會(huì)導(dǎo)致乙酰膽堿在突觸和神經(jīng)肌肉接頭處過度積累,進(jìn)一步影響正常的神經(jīng)傳遞進(jìn)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過十二烷基苯磺酸鈉暴露后,黃顙魚仔魚腦組織中AChE酶活性顯著下降,ache基因的mRNA表達(dá)水平也下調(diào),表明SDBS暴露可能抑制了黃顙魚仔魚AChE酶的合成和表達(dá),妨礙了膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的正常運(yùn)作。吳光潔[19]研究發(fā)現(xiàn),鯉(Cyprinuscarpio)腦AChE酶活性隨著十二烷基苯磺酸異丙胺鹽暴露濃度的升高而降低。金葉飛[21]研究發(fā)現(xiàn),在亞急性濃度的十二烷基苯磺酸鈉暴露14 d,隨著暴露濃度的增加,鯽(Carassiusauratus)魚腦組織的AChE酶活性被顯著抑制(P<0.05)。張江慧[22]研究發(fā)現(xiàn),質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、4和8 mg·L-1的水體十二烷基苯磺酸異丙胺鹽暴露對(duì)異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)腦AChE酶活性產(chǎn)生波動(dòng)影響。 GUIHERMINO等[22]對(duì)十二烷基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉等表面活性劑的研究中發(fā)現(xiàn),無論是體內(nèi)試驗(yàn)還是體外試驗(yàn),這些表面活性劑均會(huì)明顯抑制AChE酶活性。表面活性劑抑制AChE酶活性的原因可能是它改變了蛋白質(zhì)表面的電荷,從而改變了酶在溶液中的性質(zhì),使得酶活性下降[22]。體外試驗(yàn)觀測(cè)到表面活性劑影響AChE酶活性的最低質(zhì)量濃度分別為12.5～100 mg·L-1,而體內(nèi)試驗(yàn)的最低質(zhì)量濃度分別為2～11.9 mg·L-1,這些數(shù)值與受污染的地表水中表面活性劑的質(zhì)量濃度(0.5～10 mg·L-1)基本相當(dāng)[23-25]。

課題組還測(cè)定了黃顙魚腦組織中5-HT含量和5-ht基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平來進(jìn)一步研究SDBS誘導(dǎo)神經(jīng)毒性分子的機(jī)制。其中,暴露后仔魚腦組織中5-HT含量顯著下降,相關(guān)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平也下調(diào)。大量研究證實(shí),5-HT是脊椎動(dòng)物調(diào)劑運(yùn)動(dòng)輸出的重要神經(jīng)遞質(zhì)[26-27]。進(jìn)一步研究表明,5-HT還可以與多巴胺、γ-氨基丁酸和谷氨酸等其他神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)相互作用,共同調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶能力、高水平的認(rèn)知能力以及恢復(fù)認(rèn)知功能等[26-27]。該研究中5-ht基因的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)提示,亞急性SDBS的暴露可能通過干擾5-ht基因的轉(zhuǎn)錄水平影響黃顙魚的神經(jīng)系統(tǒng)。

3.3 SDBS暴露胚胎發(fā)育毒性與仔魚神經(jīng)毒性之間的聯(lián)系

SDBS暴露處理后黃顙魚胚胎孵化畸形率和死亡率均顯著提高。造成胚胎發(fā)育毒性的原因可能有3個(gè)方面:一是SDBS與細(xì)胞膜表面疏水部分結(jié)合,破壞了胚胎細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[15];二是SDBS暴露形成泡沫,導(dǎo)致水體溶解氧濃度下降,對(duì)胚胎發(fā)育造成影響;三是SDBS能通過抑制機(jī)體的抗氧化作用從而造成細(xì)胞遺傳物質(zhì)的損傷,影響DNA轉(zhuǎn)錄與表達(dá)等[16]。魚類的胚胎畸形多發(fā)生于神經(jīng)胚期,此時(shí)神經(jīng)管的正常發(fā)育和分化是器官發(fā)生的基礎(chǔ),胚胎處于神經(jīng)胚時(shí)期對(duì)外界刺激最為敏感[28-30]。推測(cè)SDBS暴露處理對(duì)胚胎神經(jīng)管發(fā)育產(chǎn)生影響,造成其不能正常分化為腦和脊髓,后期會(huì)形成仔魚的頭部畸形和脊椎畸形;在孵化Ⅰ期的畸形胚胎表現(xiàn)為弓背或彎尾、卵黃囊膨大等現(xiàn)象,各種畸形胚胎在發(fā)育進(jìn)程中逐步死亡。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)暴露處理后黃顙魚胚胎存在著心包水腫(心臟異常)、卵黃水腫、身體卷曲、脊椎彎曲、頭部畸形等現(xiàn)象,這些畸形可能和神經(jīng)管發(fā)育分化成器官時(shí)遭受到SDBS暴露引起的胚胎神經(jīng)毒性有關(guān)。

4 結(jié)論

綜上所述,SDBS暴露顯著提高了黃顙魚胚胎孵化的死亡率和畸形率,SDBS通過抑制AChE酶活性和5-HT含量影響神經(jīng)傳導(dǎo),抑制神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因表達(dá),從而對(duì)黃顙魚產(chǎn)生胚胎發(fā)育毒性及神經(jīng)毒性作用。