張家昌,陸金富,沙濤,沈靜茹

(中南民族大學 化學與材料科學學院 分析化學國家民委重點實驗室,湖北 武漢 430074)

在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域,大多數(shù)手性農(nóng)藥是作為外消旋混合物施用的,盡管某種農(nóng)藥的生物活性通常只由一種異構(gòu)體決定,而其他異構(gòu)體通常用處不大(大部分單一手性源的對象,若能使之分離,即可減少一半的施藥量),甚至對非目標生物產(chǎn)生毒副作用,這會誤判其潛在的生態(tài)健康風險[1]。隨著手性農(nóng)藥的概念越來越被接受,目前,學術(shù)界已經(jīng)對其開展了包括手性分離與合成、環(huán)境行為、生物代謝、毒理作用等[2]方面的研究,這對手性農(nóng)藥限制的風險評估和監(jiān)管政策制定至關(guān)重要[3]。

噁唑禾草靈(Fenoxaprop-ethyl,FE)是一種芳氧基苯氧丙酸除草劑,研究表明,R-FE是除草活性異構(gòu)體,FE在生命體中和環(huán)境中的代謝物對生物體表現(xiàn)出對映選擇性[4]。例如,Xu等[5]研究了FE及其手性代謝物2-(4-羥基苯氧基)丙酸乙酯(EHPP)、2-(4-羥基苯氧基)丙酸(HPPA)和6-氯-2,3-二氫苯并噁唑-2-酮(CDHB)對斑馬魚的影響,研究發(fā)現(xiàn)FE、FA、CDHB和EHPP的S型對映體比R型對映體毒性更大。使用FE的單一對映體能有效地降低消旋體施藥對生物體和環(huán)境的負面影響。目前,分離FE對映體的高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)法,多采用的色譜柱為商業(yè)柱。例如,Yan等[6]采用全甲基化β-環(huán)糊精商業(yè)柱作為固定相,以甲醇和水作為流動相,實現(xiàn)了FE對映體的分離,分析時間大于10 min;Liu等[7]使用Chiralpak IC商業(yè)手性柱對R-FE和S-FE的保留時間相差小,且分析時間長。

環(huán)糊精金屬有機框架材料(Cyclodextrin Metal-Organic Frameworks,CD-MOFs)是理想的手性高效液相色譜柱材料[8]。研究人員可以通過選擇不同的金屬離子、有機配體和環(huán)糊精的類型來調(diào)整CD-MOFs的結(jié)構(gòu)和性能。這類MOF材料的多孔結(jié)構(gòu)還可以提高樣品與固定相的相互作用,進一步增強分離效率[9]。其能夠拆分一些傳統(tǒng)手性色譜柱中難以實現(xiàn)的高分子質(zhì)量化合物,CD-MOFs出色的手性選擇性,使之能夠有效地分離和鑒定各種手性分子,包括藥物、天然產(chǎn)物和農(nóng)藥等[10]。在HPLC手性色譜分析領(lǐng)域,CD-MOFs作為手性色譜柱的應用已經(jīng)取得了一定的進展[11-12]。盡管如此,這一領(lǐng)域的研究仍然存在一些挑戰(zhàn),如合成方法的進一步改進優(yōu)化、CD-MOFs的穩(wěn)定性以及對一些復雜樣品的適用性。未來的研究應致力于解決這些問題,并進一步推動CD-MOFs在HPLC手性色譜分析中的應用。

本文采用蒸汽擴散法合成了全新的β-環(huán)糊精和間羧基苯磺酰氯金屬有機骨架材料,通過加入交聯(lián)試劑將其鍵合在全多孔二氧化硅微球表面,形成復合材料(β-CD-MOF-P20@SiO2),以此作為HPLC手性固定相填料。在反相色譜模式下,以乙酸銨-三乙胺/乙酸緩沖液和乙腈作為流動相,對手性農(nóng)藥噁唑禾草靈對映體進行拆分研究,在所探究的色譜條件下,均能實現(xiàn)噁唑禾草靈兩對映體的基線分離,分離度RS大于7.30,說明該新型手性固定相對噁唑禾草靈對映體具有好的對映體選擇性。在最佳分離條件下,分離度可達9.89,與現(xiàn)有文獻報道的工作相比,該體系對噁唑禾草靈對映體分離效果更好,分析速度更快,重現(xiàn)性好,線性范圍寬,為噁唑禾草靈對映體的分離分析及單一對映體定性定量和制備提供了新方法。

1 實驗部分

1.1 化學試劑和藥品

1.2 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀(HITACHI L-7000,Japan);傅里葉紅外光譜儀(Nicolet Nexus 470,USA);紫外-可見-近紅外分光光度計(Agilent Cary 5000,USA);X-射線衍射儀(Bruker D8,Germany);場發(fā)射電鏡(HITACHI SU8010,Japan);真空干燥箱(上海精宏XMTD-8222,中國);集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(武漢科爾DF-101S,中國);自動電位滴定計(上海偉業(yè)ZD-2型,中國);分析天平(Sartorius ALC-210.4,Germany)。

1.3 手性柱材料的合成

1.3.1β-環(huán)糊精摻雜間羧基苯磺酰氯金屬有機骨架材料的合成

采用蒸汽擴散法合成:稱取適量的β-環(huán)糊精、間羧基苯磺酰氯和氯化鉀,置于燒杯中攪拌溶解,過濾后轉(zhuǎn)移至密閉容器中,加熱反應6 h。反應結(jié)束后,自然冷卻至室溫,過濾,用適量甲醇洗滌數(shù)次,烘干,得無色透明晶體產(chǎn)物β-CD-MOF-P20。

1.3.2 手性柱材料β-CD-MOF-P20@SiO2的合成

稱取適量上述β-CD-MOF-P20溶于溶劑中,加入一定量的氫化鈉,室溫下攪拌后將濾液轉(zhuǎn)移至三頸燒瓶中,加入適量偶聯(lián)劑,在氮氣保護下加熱反應5 h。然后,加入活化的全多孔二氧化硅微球,冷凝回流反應24 h;反應結(jié)束后,冷卻至室溫,過濾,產(chǎn)物用適量溶劑依次洗滌,放置烘箱中真空干燥,得白色固體粉末。

1.3.3 手性柱填充

稱取適量1.3.2的手性柱材料分散在50 mL勻漿液中,將其倒入勻漿罐中,以一定比例洗脫液作為流動相,在25 MPa壓力下填充至不銹鋼空柱(4.6 mm×150 mm)。

1.4 實驗前處理

樣品制備:準確稱取噁唑禾草靈標準品,以甲醇作為溶劑,配置成標準品原液,逐級稀釋成所需樣品濃度,并采用微孔濾膜(0.22 μm)過濾備用。

緩沖液制備:準確稱取適量乙酸銨,將其溶于超純水,加三乙胺/乙酸調(diào)節(jié)緩沖液pH值。

流動相前處理:流動相均采用微孔濾膜(0.22 μm)過濾,并進行超聲脫氣處理。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 材料表征

2.1.1 傅里葉紅外光譜表征

使用Nicolet Nexus 470傅里葉紅外光譜儀分別對β-環(huán)糊精、間羧基苯磺酰氯和β-環(huán)糊精摻雜間羧基苯磺酰氯金屬有機骨架材料(β-CD-MOF-P20)進行表征,如圖1A所示。β-CD-MOF-P20譜圖中的3 417 cm-1處的吸收峰為β-CD結(jié)構(gòu)中-OH的伸縮振動吸收,相對于β-CD上-OH的伸縮振動吸收而言,其吸收強度降低,可能是由鉀離子與電離的-OH進行配位而導致的;2 923 cm-1處的吸收峰為β-CD結(jié)構(gòu)中-CH的伸縮振動吸收;1 654 cm-1處的吸收峰對應于間羧基苯磺酰氯中C═O的伸縮振動吸收;1 600 cm-1附近的吸收帶是由芳環(huán)上C═C的伸縮振動引起的,β-CD-MOF-P20的譜圖同時包含有β-環(huán)糊精和間羧基苯磺酰氯的特征吸收峰,部分吸收峰發(fā)生偏移,初步說明β-CD-MOF-P20的成功合成。

(a)傅里葉紅外光譜圖;(B)紫外-可見吸收光譜圖;(C)X-射線粉末衍射譜圖;(a)β-環(huán)糊精;(b)間羧基苯磺酰氯;(c)β-CD-MOF-P20。

2.1.2 紫外可見吸收光譜表征

采用Agilent Cary 5000紫外-可見-近紅外分光光度計分別測定了2.1.1中三種材料的固體紫外可見吸收光譜,結(jié)果如圖1B所示。間羧基苯磺酰氯在218和284 nm處有吸收峰,分別對應苯環(huán)的K吸收帶和E吸收帶;β-CD-MOF-P20的光譜圖顯示,在233和274 nm出現(xiàn)兩處吸收峰,應是由間羧基苯磺酰氯引入導致的,間羧基苯磺酰氯中苯環(huán)的K和E吸收帶引起了吸收峰吸收強度的變化且發(fā)生了位移,說明β-環(huán)糊精和間羧基苯磺酰氯共同參與了β-CD-MOF-P20材料的合成。

2.1.3 X-射線粉末衍射表征

采用HITACHI SU8010 X-射線衍射儀分別對上述三種材料進行表征,如圖1C所示。從圖中信息可以看出,β-CD-MOF-P20在6.7°,9.6°,11.0°,12.9°,13.5°,18.3°處有明顯衍射峰,β-環(huán)糊精中包含相近的衍射峰,β-CD-MOF-P20的X-射線衍射譜圖與β-環(huán)糊精、間羧基苯磺酰氯有不同之處,衍射峰大于20°后其未見明顯吸收峰,說明β-CD-MOF-P20形成了新的晶型,進一步說明β-CD-MOF-P20的成功合成。

2.1.4 掃描電子顯微鏡表征

采用Bruker D8場發(fā)射電鏡分別對二氧化硅微球、β-CD-MOF-P20和β-CD-MOF-P20@SiO2進行表征,如圖2所示,其中圖2a為二氧化硅微球裸珠,表面光滑;圖2b為β-CD-MOF-P20@SiO2,與二氧化硅微球裸珠相比,表面粗糙,表面顆粒粒徑變大且生長均勻,說明β-CD-MOF-P20是成功生長在二氧化硅微球表面的MOF材料。

(a)SiO2裸珠;(b)β-CD-MOF-P20@SiO2。

2.2 分離噁唑禾草靈對映體的色譜條件探究

選擇色譜條件:柱溫箱溫度T=25 ℃;檢測波長λ=254 nm;進樣體積V=20 μL。

2.2.1 流動相配比的影響

以乙酸銨-乙酸(c=20 mmol/L,pH值4.40)和乙腈作為流動相,通過改變流動相配比,探究流動相配比對FE對映體分離的影響,實驗結(jié)果如圖3(a)所示。隨著乙腈占比的下降,R-FE峰型逐漸尖銳,峰高升高,保留時間變化不大;而S-FE峰型逐漸展寬,峰高降低,保留時間增加;分離度逐漸升高,即緩沖液占比的上升有利于FE對映體的分離。手性色譜柱選擇性地保留S-FE,說明緩沖液有利于FE進入β-CD衍生物空腔,形成包埋復合物,而β-CD衍生物與S-FE形成的包埋復合物更加穩(wěn)定,進而影響S-FE的洗脫。

(a)流動相不同比例;(b)乙酸銨-乙酸不同pH值;(c)乙酸-三乙胺不同pH值;(d)緩沖液不同濃度;(e)流動相不同流速;(f)重現(xiàn)性試驗;(g)對照實驗;(h)線性相關(guān)性。

2.2.2 緩沖液pH值的影響

綜合考慮,選定緩沖液和乙腈的體積比為53∶47作為流動相配比,其他色譜條件不變,通過改變緩沖液pH值,探究緩沖液pH值對FE對映體分離的影響,實驗結(jié)果如圖3(b)、(c)所示。緩沖液pH值范圍從酸性到堿性,分析物的保留時間、峰型和分離度均沒有明顯變化,說明在該緩沖液中,R,S-FE對映體分離在較寬的pH值范圍均能被拆分,pH值影響不大,可能是在此環(huán)境下FE的結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定,改變緩沖液pH值并未使其有大的變化。

2.2.3 緩沖液濃度的影響

選定緩沖液pH值為7.40,其他色譜條件不變,通過改變緩沖液濃度,探究緩沖液濃度對FE對映體分離的影響,實驗結(jié)果如圖3(d)所示。隨著緩沖液濃度的升高,除了S-FE的保留時間呈下降趨勢外,其他前后峰的參數(shù)均未出現(xiàn)明顯的變化,結(jié)果導致分離度呈下降趨勢,當緩沖液濃度為20 mmol/L時,分離度最佳,RS達9.09。實驗結(jié)果說明,緩沖液濃度在一定程度上影響了S-FE與β-CD衍生物之間形成的非對映體復合物的穩(wěn)定性。

2.2.4 流動相流速的影響

選定緩沖液濃度為20 mmol/L,其他色譜條件不變,通過改變流動相流速,探究其對FE對映體分離的影響,實驗結(jié)果如圖3(e)所示。隨著流動相流速的升高,前后峰的保留時間和峰面積逐漸減小,峰型逐漸尖銳,分離度先升后降,當流速為0.5 mL/min時,分離度最佳,RS達9.09。

2.2.5 對照實驗

在流動相乙酸銨-三乙胺(20 mmol/L,pH值7.40)和乙腈配比為53∶47(體積比),溫度25 ℃,檢測波長254 nm,流速為0.5 mL/min的色譜條件下,分別測定了溶劑甲醇、R-FE和FE消旋體樣品,實驗結(jié)果如圖3(g)所示。通過對照實驗說明,溶劑甲醇對分離實驗結(jié)果的干擾不大,前峰對應的對映體為R-FE,則后峰對應的對映體為S-FE。

2.2.6 重現(xiàn)性試驗

以2.2.5同樣的色譜條件下,依次進樣7次,通過確定相對標準偏差(RSD)來評估該體系的重現(xiàn)性,實驗結(jié)果如圖3(f)所示。R-FE的保留時間、峰高、峰面積的RSD值分別為0.09%,0.77%和0.68%,S-FE的保留時間、峰高、峰面積的RSD值分別0.59%,1.32%,1.53%,分離度的RSD值為0.91%。實驗結(jié)果表明,該體系分離FE對映體具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

2.2.7 線性相關(guān)性

以2.2.5同樣的色譜條件下,在FE消旋體標準品濃度在6.20×10-6～2.99×10-4mol/L范圍內(nèi)分別分離了8個不同濃度的試樣,依次進樣,將FE兩個對映體的峰高和峰面積分別與樣品濃度進行線性擬合,實驗結(jié)果如圖3(h)所示。S-FE的峰高和峰面積與樣品濃度的線性方程分別為:y=1.255 9x-0.305 5(r=0.996 2)和y=0.481 7x+0.082 9(r=0.999 6),R-FE的峰高和峰面積與樣品濃度的線性方程分別為:y=11.563 9x+0.122 1(r=0.996 7)和y=4.670 2x-0.538 9(r=0.999 9)。結(jié)果表明,FE兩個對映體的峰高和峰面積與樣品濃度(6.20×10-6～2.99×10-4mol/L)線性相關(guān)性好(r=0.996 2～0.999 9),線性范圍寬。

3 結(jié)論

采用以β-CD衍生物為手性源的CD-MOF手性HPLC固定相,開發(fā)了一種分離R,S-FE對映體的反相色譜方法,通過優(yōu)化色譜條件,得到了流動相乙酸銨-三乙胺(20 mmol/L,pH值7.40)和乙腈配比為53∶47(體積比),溫度25 ℃,檢測波長254 nm,流速0.5 mL/min的色譜條件下獲得了好的FE對映體分離,與已有報道的比,該材料對R,S-FE對映體的分離具有更大的分離度和更快速的優(yōu)勢,該工作對更好地評估FE手性農(nóng)藥的環(huán)境和生態(tài)風險具有一定意義,也會促進相關(guān)研究的發(fā)展。