蘇羚子,焦麗靜,許 玲,周 迪

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200437)

癌痛特指由腫瘤直接壓迫、致痛介質(zhì)(炎性因子等)分泌、癌細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移等原因,累及空腔及實(shí)質(zhì)器官,誘發(fā)局部壞死、炎癥等,引起疼痛,常伴有牽涉痛。疼痛作為與生活治療相關(guān)的一個重要的因子(HRQOL),提供了生存的預(yù)后信息,對惡性腫瘤患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響。據(jù)統(tǒng)計,90%患者在病情發(fā)展的不同階段出現(xiàn)癌痛癥狀,80%晚期患者可出現(xiàn)中重度疼痛[1]。自世界衛(wèi)生組織推廣實(shí)施三階梯止痛方案以來,癌痛的治療已取得了較大的進(jìn)步,對于中重度的癌痛患者,阿片類止痛藥無可取代,但其引起便秘、惡心、呼吸抑制等不良反應(yīng)給患者造成了很大的困擾[2]。近年來,中醫(yī)藥逐漸成為臨床治療癌痛的輔助手段,有研究證實(shí)中醫(yī)藥與止痛藥的結(jié)合使用,可以提高止痛藥的療效并減輕不良反應(yīng)[3]。龍?zhí)偻ńj(luò)方由上海中醫(yī)藥大學(xué)特聘教授許玲教授創(chuàng)制,是基于長期大量臨床實(shí)踐而總結(jié)的經(jīng)驗方,由穿山龍、延胡索、川楝子、乳香、沒藥、絡(luò)石藤、海風(fēng)藤組成,具有解毒化瘀、活血通絡(luò)功效。經(jīng)過1項中美NIH國際合作項目,3項國家自然科學(xué)基金的研究,已授權(quán)國家發(fā)明專利(專利號:ZL201510580078.X)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)龍?zhí)偻ńj(luò)方外用治療肺癌、乳腺癌、前列腺癌、腸癌等導(dǎo)致的疼痛臨床療效顯著、使用安全,可減少阿片類藥物的應(yīng)用,減輕不良反應(yīng),提高生活質(zhì)量[4]?；A(chǔ)研究提供了龍?zhí)偻ńj(luò)方外用治療大鼠骨癌痛的行為學(xué)支撐,初步闡明了止痛的外周機(jī)制和部分中樞機(jī)制[5-8]。然而,目前龍?zhí)偻ńj(luò)方治療癌痛的機(jī)制及分子作用機(jī)制尚未明確。因此,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,探討龍?zhí)偻ńj(luò)湯治療癌痛的潛在成分、作用靶點(diǎn)及分子通路,闡明其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1龍?zhí)偻ńj(luò)方藥物活性成分和相關(guān)靶點(diǎn)的篩選利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺[9](https://tcmspw.com/tcmsp.php)收集龍?zhí)偻ńj(luò)湯中延胡索、乳香、沒藥、絡(luò)石藤、海風(fēng)藤、川楝子的化合物成分。以口服生物利用度為≥30%、藥物相似性≥0.18為閾值設(shè)置ADME屬性,獲取藥物相關(guān)活性成分,再利用該平臺獲取活性成分作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息。由于TCMSP數(shù)據(jù)庫中未找到穿山龍相關(guān)的靶點(diǎn),因此,穿山龍的化合物成分通過Batman-TCM數(shù)據(jù)庫[10](http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)進(jìn)行補(bǔ)充,選取得分>20分的成分靶點(diǎn)納入。所有靶點(diǎn)經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫[11](https://www.uniprot.org/)校正, 去掉非人類靶點(diǎn)。

1.2癌癥疼痛相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 以“cancer pain”為關(guān)鍵詞,在GeneCards數(shù)據(jù)庫[12](https://www.genecards.org/),NCBI基因數(shù)據(jù)庫[13](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)以及DisGeNET數(shù)據(jù)庫[14](https://www.disgenet.org/)進(jìn)行人類基因檢索。其中,GeneCards數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn)根據(jù)得分進(jìn)行中位值的篩選以獲得更加相關(guān)的靶點(diǎn)。

1.3龍?zhí)偻ńj(luò)湯活性成分-癌痛靶點(diǎn)的可視化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用網(wǎng)絡(luò)在線工具Venny 2.1.0 (http://bioinfogn.cnb.csic.es/tools/venny/),針對龍?zhí)偻ńj(luò)湯活性成分的作用靶點(diǎn)與癌痛的靶點(diǎn)繪制韋恩圖,所得的交集靶點(diǎn)即為龍?zhí)偻ńj(luò)湯作用于癌痛的靶點(diǎn)。利用Cystoscape 3.8.0對前期收集到的關(guān)于藥物成分和交集靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理,構(gòu)建“藥物活性成分-癌痛靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),選擇Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)的獲取將藥物疾病共有靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫[15](https://string-db.org/cgi/input.pl)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)模型,選擇生物種類為“Homo sapiens”,可信度>0.9,得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscape 3.8.0[16]中,構(gòu)建通過NetworkAnalyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治?通過degree排序,選取分值大于平均分的基因作為關(guān)鍵靶點(diǎn),總共篩選出個61關(guān)鍵靶點(diǎn),將前20個靶點(diǎn)使用R 4.0.3進(jìn)行圖片繪制,橫坐標(biāo)為每個靶點(diǎn)的度值。通過插件MCODE[17]進(jìn)行基因簇的分析以及核心靶點(diǎn)的篩選。

1.5基因本體(Gene ontology,GO)生物過程分析將藥物疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO的生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、細(xì)胞組分(cell component,CC)富集,引用String 數(shù)據(jù)庫,將校正P值<0.05的項目進(jìn)行篩選。

1.6京都基因與基因組百科全書(Kypyo encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析 將藥物疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析,引用String 數(shù)據(jù)庫,將校正P值<0.05的項目進(jìn)行篩選, 且從小到大排序作為篩選條件, 選取符合條件的前20位的KEGG通路。

1.7“成分-疾病-通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Cytoscape 3.8.0中的關(guān)聯(lián)功能, 合并活性成分-疾病-通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,在輸出結(jié)果中,以不同顏色的節(jié)點(diǎn)分別表示活性成分、疾病、通路和靶點(diǎn)。化合物和潛在靶點(diǎn)通過邊緣(edge)相連,目標(biāo)蛋白和通路也通過邊緣相連。

2 結(jié) 果

2.1龍?zhí)偻ńj(luò)湯藥物活性成分和相關(guān)作用靶點(diǎn)通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索檢索延胡索、乳香、沒藥、絡(luò)石藤、海風(fēng)藤、川楝子的化合物成分和靶點(diǎn),經(jīng)匯總刪重后,獲得延胡索活性成分49種及其作用靶點(diǎn)201個;獲得乳香活性成分8種及其作用靶點(diǎn)11個;獲得沒藥活性成分45種及其作用靶點(diǎn)184個;獲得絡(luò)石藤活性成分9種及其作用靶點(diǎn)112個;獲得海風(fēng)藤活性成分21個及其作用靶點(diǎn)54個;獲得川楝子活性成分9種及其作用靶點(diǎn)144個;獲得穿山龍活性成分3種及其作用靶點(diǎn)128個靶點(diǎn)。

2.2癌癥疼痛靶點(diǎn) 在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中根據(jù)關(guān)鍵詞“cancer pain”獲得癌痛相關(guān)靶點(diǎn)2 946個;在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲癌痛相關(guān)靶點(diǎn)447個;在DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲得62個相關(guān)靶點(diǎn)。將這3個數(shù)據(jù)庫的基因合并刪重之后,得到8 019個癌痛相關(guān)基因。

2.3龍?zhí)偻ńj(luò)湯活性成分-癌癥疼痛靶點(diǎn)的可視化網(wǎng)絡(luò) 將篩選出的藥物有效成分靶點(diǎn)與癌痛靶點(diǎn)輸入軟件Venny 2.1,制作韋恩圖,得到215個交集靶點(diǎn),見圖1。交集靶點(diǎn)對應(yīng)龍?zhí)偻ńj(luò)湯中的113個化學(xué)成分,見表1。為了更好地理解成分、疾病以及相應(yīng)靶點(diǎn)之間的復(fù)雜作用關(guān)系,使用Cytoscape 3.8.0構(gòu)建成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,見圖2。將成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0進(jìn)行拓?fù)浞治?將成分按度值大小排序,度值越高成分越重要,度值最高的藥物活性成分為槲皮素(度值為121,介度為0.144 852,緊密度為0.510 638),其次為木樨草素(度值為51,介度為0.409 756,緊密度為0.025 654)、豆甾醇(度值為28,介度為0.400 955,緊密度為0.014 448),推測槲皮苷、木樨草素、豆甾醇為龍?zhí)偻ńj(luò)湯治療癌痛的主要成分,見表2。

表1 交集靶點(diǎn)對應(yīng)龍?zhí)偻ńj(luò)湯中的113個化學(xué)成分信息

表2 MCODE聚類分析詳細(xì)信息

圖1 龍?zhí)偻ńj(luò)方-癌痛的共有靶點(diǎn)韋恩圖

注:網(wǎng)絡(luò)中黃色為活性成分,粉色為藥物作用于疾病的靶點(diǎn),綠色為中藥,藍(lán)色矩形為疾病

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)的獲取 將交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)輸入String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建,該網(wǎng)絡(luò)中有215個節(jié)點(diǎn),723條邊,平均度值為6.67,見圖3和圖4(圖3為string網(wǎng)站導(dǎo)出的PPI網(wǎng)絡(luò)圖,圖2為Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖)。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscape 3.8.0中,通過Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治?通過degree排序,選取分值大于平均分的基因作為關(guān)鍵靶點(diǎn),總共篩選出個61關(guān)鍵靶點(diǎn),將前20個靶點(diǎn),即STAT1、NCOA1、AR、RXRA、CCND1、EGFR、CDKN1A、RB1、MYC、IL6、CAV1、FOS、MAPK14、ESR1、TNF、RELA、JUN、MAPK1、AKT1、HSP90AA1,使用R 4.0.3進(jìn)行圖片繪制,橫坐標(biāo)為每個靶點(diǎn)的度值,見圖5。度值越大,節(jié)點(diǎn)越大,則蛋白之間的關(guān)系越密切,其中度值排名前4位的靶點(diǎn)即HSP90AA1、AKT1、MAPK1。通過MCODE分析進(jìn)行核心基因的篩選。將已經(jīng)構(gòu)建好的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0中,使用MCODE模塊進(jìn)行基因簇的分析以及核心靶點(diǎn)的篩選?？偣驳玫?0個基因簇和8個核心基因,核心基因為PARP1、CXCL8、CDK2、CHRNA7、PPARG、GRIN2A、VCAM1、MMP3,見表2。

圖3 龍?zhí)偻ńj(luò)方活性成分癌痛交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

注:圖中的節(jié)點(diǎn)顏色和大小根據(jù)度值調(diào)整,越大,顏色越深,度值越大;線的粗細(xì),從粗到細(xì)表示edge betweenness從大到小

圖5 龍?zhí)偻ńj(luò)湯作用靶點(diǎn)拓?fù)浞治霭悬c(diǎn)的度值

2.5GO功能富集分析及KEGG通路富集分析通過R語言軟件的clusterProfiler對交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析,結(jié)果富集到生物進(jìn)程條目2 682項,分子功能188項,細(xì)胞組成124項。結(jié)果顯示,龍?zhí)偻ńj(luò)湯治療癌痛相關(guān)靶點(diǎn)參與的生物進(jìn)程主要包括對藥物的反應(yīng)、對金屬離子的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌起源分子的反應(yīng)等。涉及的主要細(xì)胞組分包括膜閥、膜微區(qū)、膜區(qū)域、等離子膜伐等。涉及的分子功能包括神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、核受體活性、配體活化、轉(zhuǎn)錄因子活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。輸出各組分排名前10的條目,繪制成氣泡圖,見圖6。通過R語言軟件的clusterProfiler對交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析,結(jié)果富集到龍?zhí)偻ńj(luò)湯治療癌痛的信號通路共175條,參與通絡(luò)主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等。龍?zhí)偻ńj(luò)湯的有效成分可能通過作用于這些信號通路達(dá)到治療癌痛的目的。將富集結(jié)果繪制出氣泡圖,見圖7。

注:BP、CC、MF分別代表生物進(jìn)程、細(xì)胞組分、分子功能

圖7 龍?zhí)偻ńj(luò)湯治療癌痛交集靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析(僅展示前20位)

2.6成分-疾病-通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 選取核心的-個基因,制作“成分-疾病-通路-靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系表,將其導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件,構(gòu)建出龍?zhí)偻ńj(luò)湯治療癌痛的通路網(wǎng)絡(luò)圖,更直觀地展示中藥活性成分在治療疾病過程中的多成分-多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn),見圖8。

注:綠色為化合物,黃色為中藥作用于疾病的靶點(diǎn),藍(lán)色為最顯著的前20條通路,紫色為疾病,紅色為中藥

3 討 論

癌性疼痛是中、晚期癌癥患者最常見、最痛苦的癥狀之一,對患者臨床治療的依從性與生活質(zhì)量均有較大的影響。目前,三階梯止痛藥物在癌性疼痛中的應(yīng)用十分普遍,但并不能讓所有患者受益,且該類藥物會導(dǎo)致便秘、惡心、呼吸抑制等不良反應(yīng), 如何有效止痛,并最大限度地改善晚期癌痛患者地生活質(zhì)量是臨床面臨地重大課題。

古代中醫(yī)典籍中,對疼痛的認(rèn)識,《內(nèi)經(jīng)》《諸病源候論》《千金方》《證治要訣》等經(jīng)典中皆有記載,早在《內(nèi)經(jīng)》就記載有“寒入經(jīng)而稽遲,泣潤而不行,客于脈外則血少,客于脈中則氣不通,故猝然而痛……”在古代典籍中雖無癌痛的直接命名,但有許多類似于癌痛的具體描述。如《內(nèi)經(jīng)》中有“大骨枯槁、大肉下陷、胸中氣滿、喘息不便、內(nèi)痛引肩頸”的描述,極似肺癌晚期疼痛?！蹲C治要訣》中“痞積在胃脘,大如覆杯,痞塞不通,背痛心痛”是對臨床肝癌痛表現(xiàn)的描述。許玲教授在長期臨床實(shí)踐的基礎(chǔ)上,認(rèn)為氣滯血瘀、脈絡(luò)不通為癌痛的主要病機(jī),并貫穿其整個病理過程,治療時強(qiáng)調(diào)行氣活血、通絡(luò)止痛,并組方龍?zhí)偻ńj(luò)方。方中穿山龍活血舒筋,延胡索、川楝子理氣散瘀,乳香、沒藥活血化瘀、消腫止痛,佐以海風(fēng)藤、絡(luò)石藤加強(qiáng)祛風(fēng)通絡(luò)、理氣止痛之功效。此方在行氣活血的同時,又可解毒散結(jié)、通絡(luò)止痛。中藥單體及復(fù)方的研究是現(xiàn)代中醫(yī)治療疾病的主要方法,通過潛在的多成分、多靶點(diǎn)相互作用起到治療效果,在復(fù)雜疾病的治療中發(fā)揮了重要作用。通過現(xiàn)代藥理學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等研究可進(jìn)一步對藥物成分及生物信息得以進(jìn)一步的認(rèn)識,從而呈現(xiàn)藥物、疾病、靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系?，F(xiàn)代藥理學(xué)對龍?zhí)偻ńj(luò)方中諸藥已有一定的認(rèn)識。其中,穿山龍具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用,其機(jī)制可能與抑制體內(nèi)IL-1β與IL-6表達(dá)有關(guān)[18]。延胡索味辛、苦,性溫,具有活血散瘀、理氣止痛的功效,現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示,延胡索總堿的鎮(zhèn)痛效價是嗎啡的40%,其鎮(zhèn)痛高峰可維持約2 h[19]。川楝子味苦,性寒,具有瀉熱疏肝、行氣鎮(zhèn)痛功效,研究表明川楝子醇提取物具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用[20]。沒藥味辛、苦,性平,乳香味辛、苦,性溫,具有活血化瘀止痛功效,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,乳香和沒藥具有抗炎、抗腫瘤、抗菌、鎮(zhèn)痛等作用,其中對神經(jīng)性疼痛的止痛效果顯著[21]。海風(fēng)藤味辛、苦,性微溫,具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、止痹痛的功效。研究表明海風(fēng)藤提取物能通過抑制環(huán)氧合酶-1(COX-1)和5-LOX減少前列腺素和白細(xì)胞三烯的生物合成,海風(fēng)藤正丁醇提取物可減緩炎癥反應(yīng),并可延長疼痛反應(yīng)出現(xiàn)的時間[22-23]。絡(luò)石藤主要成分為絡(luò)石藤總黃酮,實(shí)驗證明該物質(zhì)可明顯提高小鼠熱板反應(yīng)的痛閾值,具有抗炎鎮(zhèn)痛作用[24]。

本研究直觀地呈現(xiàn)了113個化合物成分、10個基因簇、8個核心基因和175條作用通路和癌性疼痛疾病間的關(guān)聯(lián)。經(jīng)初步篩選發(fā)現(xiàn),龍?zhí)偻ńj(luò)方作用于癌性疼痛靶基因的主要活性成分以槲皮素、木樨草素、豆甾醇為主。槲皮素是植物界分布廣泛,具有多種生物活性的黃酮醇類化合物,已被證明有抗氧化、抗炎和抗增殖作用,具有潛在的抗癌特性[25]。動物和細(xì)胞實(shí)驗表明,槲皮素可在各種惡性腫瘤中下調(diào)AKT1、PTGS2和VEGFA的表達(dá)并上調(diào)TP53的表達(dá),這些惡性腫瘤包括乳腺癌、前列腺癌和非小細(xì)胞肺癌,它們是最容易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的排名前3位的惡性腫瘤。木犀草素是一種在植物中發(fā)現(xiàn)的類黃酮。它可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,激活細(xì)胞周期阻滯,通過不同的信號通路誘導(dǎo)凋亡,在體外和體內(nèi)阻止癌癥的發(fā)展[26]。木犀草素還可通過細(xì)胞骨架收縮、誘導(dǎo)上皮生物標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)以及下調(diào)間充質(zhì)生物標(biāo)志物N-cadherin、snail和vimentin等機(jī)制逆轉(zhuǎn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[27]。豆甾醇屬于植物甾醇,具有較強(qiáng)的生理活性和表面活性。體外試驗研究發(fā)現(xiàn),豆甾醇能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的環(huán)氧合酶-2(COX-2)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA和蛋白水平的提高,抑制前列腺E2和一氧化氮的釋放,具有抗炎的作用[28]。有研究發(fā)現(xiàn),口服0.3～3 mg/kg豆甾醇,對醋酸誘導(dǎo)的扭體試驗、手術(shù)切口引起的機(jī)械性疼痛、部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎等多種急慢性疼痛模型表現(xiàn)出非常有效的鎮(zhèn)痛作用[29]。

PPI分析結(jié)果顯示,度值排名前3的靶點(diǎn)分別是HSP90AA1、AKT1、MAPK1、JUN。熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)是一類高度保守的蛋白質(zhì),參與多種生物過程,HSP90AA1作為家族的重要成員,可通過其C末端結(jié)構(gòu)域嵌入脂質(zhì)雙層中,在應(yīng)激條件下對膜穩(wěn)定具有重要作用。Lei等[30]實(shí)驗發(fā)現(xiàn),HSP90通過ERK機(jī)制調(diào)節(jié)疼痛行為,能夠提高嗎啡的鎮(zhèn)痛效果,減少嗎啡的不良反應(yīng)。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)的激活可導(dǎo)致各種刺激引起的疼痛[31]。AKT1是3種蛋白激酶之一,參與多個炎癥、免疫、代謝和細(xì)胞增殖相關(guān)的信號通路[32]。AKT蛋白在大多數(shù)癌癥類型中都高度表達(dá),包括肺癌、肝癌、乳腺癌和結(jié)腸癌,其中AKT1是治療癌癥的主要靶點(diǎn),在細(xì)胞增殖和抗凋亡的過程中發(fā)揮作用。mTOR是AKT通路的下游激酶之一,在疼痛相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中被激活,并作為阿片類藥物誘導(dǎo)痛覺過敏的有效靶點(diǎn)。AKT-mTOR信號級聯(lián)參與了一些生理和病理過程,如嗎啡耐受、痛覺過敏、血管生成等[33]。JUN屬于轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白1,包括c-Jun、JunB、JunD, 其中多以c-Jun為主。c-Jun被活性氧激活后,可上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2表達(dá),從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力,促進(jìn)癌細(xì)胞擴(kuò)散,加速癌癥病程進(jìn)展,加重癥狀表現(xiàn)。

GO和KEGG富集分析進(jìn)一步揭示了龍?zhí)偻ńj(luò)湯治療癌痛的作用機(jī)制。通過對龍?zhí)偻ńj(luò)方治療癌性疼痛的8個核心基因進(jìn)行GO生物進(jìn)程富集,顯示龍?zhí)偻ńj(luò)方治療癌痛主要涉及對藥物的反應(yīng)、對金屬離子的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌起源分子的反應(yīng)等生物進(jìn)程,膜閥、膜微區(qū)、膜區(qū)域、等離子膜伐等細(xì)胞組分,神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、核受體活性、配體活化、轉(zhuǎn)錄因子活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),上述生物進(jìn)程的主要通路涉及AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等。AGE-RAGE信號通路通過激活PKC/JNK/NF-κB信號通路,促進(jìn)炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α等的表達(dá)與釋放,從而引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生[34]。除此之外,它還可以激活PCK/PK-1信號通路,使得MCP-1、MMP-2、ICAM-1等蛋白過表達(dá),使得血液黏滯度增加。IL-17信號通路和腫瘤壞死因子通路與炎癥、免疫調(diào)節(jié)相關(guān),IL-17可與TNF-α共同誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子IL-6,而IL-6不僅可促進(jìn)C反應(yīng)蛋白的生成,也對IL-17有正向反饋?zhàn)饔?三者互相影響加重炎癥反應(yīng)[35]。此外,已有研究發(fā)現(xiàn)IL-17與其他疾病(如多發(fā)性硬化癥)的疼痛癥狀有關(guān)[36]。腫瘤壞死因子α是一種促炎因子,可由腫瘤或受腫瘤刺激的周圍組織產(chǎn)生,與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Constantin等[37]發(fā)現(xiàn),TNF-α拮抗劑對于降低熱源性痛覺和機(jī)械性疼痛敏感性具有一定作用。

本研究初步闡釋了龍?zhí)偻ńj(luò)方治療癌性疼痛的潛在活性成分及其可能的作用機(jī)制,篩選出槲皮苷、木樨草素、豆甾醇等活性成分,JUN、MAPK1、AKT1、HSP90AA1等作用靶點(diǎn),以及AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等與疾病發(fā)生相關(guān)的通路。通過調(diào)控上述靶點(diǎn)和信號通路,減少癌細(xì)胞增殖,減少致痛介質(zhì)釋放,緩解因腫瘤生長引起的牽涉痛及炎性因子相關(guān)性疼痛,從而達(dá)到治療癌痛的目的。為研究龍?zhí)偻ńj(luò)湯的分子機(jī)制提供了依據(jù),為癌痛的治療提供了新的選擇。然而,本研究基于網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)得到的預(yù)測,存在一定的局限性,結(jié)果還需要通過動物體內(nèi)實(shí)驗和細(xì)胞體外實(shí)驗進(jìn)一步驗證。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。