孫洮玉,楊 斌,任軍華,樊茂蓉,徐春英,郭慧娟

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京 100700;2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院,北京 100091)

慢性咳嗽是指時(shí)間超過8周,影像學(xué)檢查無(wú)明顯異常的咳嗽[1]?？人缘牟∫驈?fù)雜,涉及面廣,治療手段缺乏系統(tǒng)化及精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)支持,有相當(dāng)比例的咳嗽患者經(jīng)抗生素及鎮(zhèn)咳藥治療后收效甚微,并存在不良反應(yīng)發(fā)生的可能,對(duì)患者心理、工作、學(xué)習(xí)等造成負(fù)面影響。咳嗽高敏綜合征是針對(duì)慢性咳嗽診治而提出的一個(gè)新概念,認(rèn)為咳嗽并不總是與某種疾病關(guān)聯(lián),而是一種具有獨(dú)特病理生理學(xué)過程的臨床實(shí)體,疾病狀況如哮喘、感染、食管反流等多數(shù)作為觸發(fā)因素,而不是咳嗽的直接原因[2]?？人允苎铀韬粑袠锌刂?大腦皮質(zhì)起調(diào)節(jié)作用,咳嗽反射有自己的神經(jīng)調(diào)節(jié)途徑,速激肽網(wǎng)在呼吸道的廣泛存在以及大腦皮質(zhì)炎癥介質(zhì)的釋放均是引發(fā)咳嗽反射的關(guān)鍵因素。氣道的神經(jīng)源性炎癥是咳嗽高敏綜合征發(fā)生的核心機(jī)制,氣道上皮及氣道平滑肌細(xì)胞表面存在大量速激肽受體,是神經(jīng)源性介質(zhì)作用的主要效應(yīng)細(xì)胞,介導(dǎo)氣道血管通透性增強(qiáng)、氣道管腔分泌物增多,分泌炎癥分子;咳嗽反射弧將信號(hào)傳入咳嗽中樞,大腦皮質(zhì)釋放白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥介質(zhì),調(diào)節(jié)咳嗽反應(yīng)的發(fā)生、持續(xù)[3]。加味芎蝎散是徐榮謙教授由傳統(tǒng)古方芎蝎散加減而來,臨床治療咳嗽變異型哮喘療效顯著[4-5]。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),加味芎蝎散可以調(diào)節(jié)氣道上皮增殖[6]、凋亡[7]、自噬[8]及Th1/Th2比例[9],逆轉(zhuǎn)氣道平滑肌表型轉(zhuǎn)化[10],從而抑制咳嗽反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過建立咳嗽高敏綜合征大鼠模型,觀察肺組織速激肽及受體、大腦皮質(zhì)炎癥介質(zhì)等的表達(dá)變化,探討了加味芎蝎散是否可影響神經(jīng)源性炎癥,以進(jìn)一步明確其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動(dòng)物 36只SPF級(jí)雄性SD大鼠,體重(200±20)g,4～6周齡,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,合格證號(hào):SCXK(京)2016-0001。普通飼料喂養(yǎng),自由飲水,保持室溫(22±2)℃、濕度(50±10)%。本實(shí)驗(yàn)通過中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理研究委員會(huì)審核,倫理批準(zhǔn)號(hào):2021XLC015-1。

1.2藥物 加味芎蝎散由川芎5 g、全蝎3 g、蘆根20 g、蓽茇1 g、半夏5 g、細(xì)辛1 g、五味子10 g、白前10 g組成,所有藥材經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院孫洮玉副教授鑒定為正品。中藥煎藥機(jī)煎制,全蝎炮制入藥,制成含生藥量3.0 g/mL的濃縮液。磷酸可待因片(國(guó)藥集團(tuán)工業(yè)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H11020673,規(guī)格:30 mg/片)。

1.3試劑及儀器 紅塔山過濾嘴香煙(焦油含量10 mg、尼古丁含量1.0 mg、CO含量10 mg),紅塔煙草集團(tuán);P物質(zhì)(SP)小鼠單克隆抗體(貨號(hào):ab14184)、瞬態(tài)電壓感受器陽(yáng)離子通道(TRPV1)小鼠單克隆抗體(貨號(hào):ab203103)、IL-6小鼠單克隆抗體(貨號(hào):ab9324)、TNF-α小鼠單克隆抗體(貨號(hào):ab220210),英國(guó)Abcam公司;降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)兔單克隆抗體(貨號(hào):#14959)、IL-1β小鼠單克隆抗體(貨號(hào):#12242),美國(guó)CST公司;二抗酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物(批號(hào):1919D0516),北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;TPl020型全自動(dòng)脫水機(jī)、RM2235型組織切片機(jī),德國(guó)Leica公司;HI1220烤片機(jī),德國(guó)Leica公司;BX53型光學(xué)顯微鏡,日本Olymplus公司。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 隨機(jī)選取6只大鼠作為正常組,剩余大鼠參照文獻(xiàn)[11-12]實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行咳嗽高敏綜合征造模:每天于固定時(shí)間將大鼠放入自制的動(dòng)物飼養(yǎng)敞箱(長(zhǎng)40 cm、寬40 cm、高30 cm),箱子接近頂部同時(shí)點(diǎn)燃10支香煙,然后箱子上方蓋上用來封閉的木板,60 min后取出大鼠,該場(chǎng)景用來模擬大鼠的被動(dòng)吸煙狀態(tài),2次/d,持續(xù)2周后抽取大鼠行咳嗽反應(yīng)檢測(cè),以確定是否造模成功。將造模成功大鼠隨機(jī)分成模型組、加味芎蝎散高劑量組、加味芎蝎散中劑量組、加味芎蝎散低劑量組、磷酸可待因組,每組6只。按照大鼠/人體表面積法換算,加味芎蝎散高、中、低劑量組分別給予加味芎蝎散12 g/(kg·d)、6 g/(kg·d)、3 g/(kg·d)灌胃,磷酸可待因組給予磷酸可待因10 mg/(kg·d)灌胃,正常組及模型組給予等量蒸餾水灌胃,均1次/d,連續(xù)灌胃3周。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1咳嗽次數(shù) 在灌胃1周、2周、3周末,分別將各組大鼠放入密閉箱內(nèi),霧化吸入濃度104 mol/L的辣椒素溶液,持續(xù)1 min,取出后記錄3 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)。

1.5.2肺組織病理形態(tài) 末次灌胃結(jié)束后,以氯胺酮(3 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,頸椎脫臼法處死,迅速剖取左肺,置入10%中性福爾馬林溶液中固定后,常規(guī)脫水、包埋、切片,HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5.3大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞存活狀態(tài) 取大鼠大腦組織,置入10%中性福爾馬林溶液中固定,石蠟包埋,4 μm切片,二甲苯脫蠟,梯度酒精入水,常溫下用0.1%尼氏染色液染色50 min,染色結(jié)束后流水洗滌、脫水、透明、封片,顯微鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞染色情況(尼氏體是神經(jīng)元的特征性結(jié)構(gòu)之一,廣泛存在于神經(jīng)元的胞體和樹突內(nèi),與堿性染料結(jié)合顯示出藍(lán)紫色,能反映細(xì)胞的存活狀態(tài))。

1.5.4支氣管組織中SP、CGRP、TRPV1蛋白及大腦皮質(zhì)中IL-6、IL-1β表達(dá)情況 采用免疫組化法檢測(cè):肺組織及腦組織石蠟切片脫蠟至水后,檸檬酸緩沖液(pH 6.0)高壓修復(fù)抗原3 min,10% H2O2室溫封閉10 min,PBS洗滌后加入一抗(濃度分別為1∶300,1∶200,1∶100,1∶200,1∶50,1∶200),用PBS代替一抗做陰性對(duì)照,4 ℃冰箱孵育過夜。次日PBS充分洗滌后,加入即用型二抗PV6000,室溫孵育30 min,PBS沖洗,DAB顯色,鏡下觀察目標(biāo)細(xì)胞著色情況,自來水終止反應(yīng),充分洗滌后蘇木精復(fù)染、鹽酸酒精分化、氨水反藍(lán)、梯度酒精脫水、封片。在光學(xué)顯微鏡下,每張切片選取3個(gè)高倍視野,醫(yī)學(xué)圖像分析軟件(Image Pro-plus 6.0)分析測(cè)定每張圖像的積分光密度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠咳嗽次數(shù)比較 實(shí)驗(yàn)過程中,正常組大鼠的咳嗽次數(shù)少且未見明顯波動(dòng);模型組大鼠灌胃1周、2周、3周末的咳嗽次數(shù)均明顯多于正常組(P均<0.05),且隨時(shí)間遷移呈緩慢增多趨勢(shì);加味芎蝎散高、中劑量組及磷酸可待因組大鼠灌胃2周、3周末的咳嗽次數(shù)均明顯少于模型組(P均<0.05),此3個(gè)給藥組大鼠的咳嗽次數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);加味芎蝎散低劑量組大鼠的咳嗽次數(shù)有減少,但與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)比較次)

2.2各組大鼠肺組織病理形態(tài)比較 正常組大鼠支氣管黏膜結(jié)構(gòu)正常,上皮細(xì)胞未見變性,平滑肌排列有序,未見增厚,管壁未見炎細(xì)胞浸潤(rùn);模型組大鼠支氣管管腔擴(kuò)張,黏膜上皮輕度變性,平滑肌層增生且排列無(wú)序,管壁充血、水腫,可見大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較,各藥物組病變均有不同程度的減輕,其中加味芎蝎散組高、中劑量組黏膜上皮變性明顯減輕,平滑肌組織排列較有序,炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少;加味芎蝎散低劑量組與磷酸可待因組炎性反應(yīng)明顯減輕,黏膜上皮變性及平滑肌增生改變不明顯。見圖1。

圖1 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠肺組織病理形態(tài)(HE染色,×200)

2.3各組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞存活狀態(tài)比較正常組神經(jīng)元細(xì)胞胞體形態(tài)正常,排列均勻,胞質(zhì)豐盈,尼氏體明顯;模型組神經(jīng)元細(xì)胞部分分布稀疏,形態(tài)不規(guī)則,尼氏體變少;與模型組比較,各藥物組細(xì)胞分布較密集,形態(tài)較規(guī)則,尼氏體增多,以加味芎蝎散組高、中劑量組和磷酸可待因組改善更明顯。見圖2。

圖2 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞存活狀態(tài)(尼氏染色,×200)

2.4各組大鼠支氣管黏膜組織中SP、CGRP、TRPV1蛋白表達(dá)情況比較 SP、CGRP、TRPV1陽(yáng)性表達(dá)呈黃色至棕黃色,主要表達(dá)在支氣管黏膜上皮細(xì)胞胞漿及胞膜,部分間質(zhì)神經(jīng)纖維及血管內(nèi)皮細(xì)胞上亦有表達(dá),本次實(shí)驗(yàn)僅統(tǒng)計(jì)黏膜上皮部分。模型組大鼠黏膜上皮中SP、CGRP、TRPV1蛋白表達(dá)積分光密度值均明顯高于正常組(P均<0.05),加味芎蝎散組高、中劑量組大鼠黏膜上皮中SP、CGRP、TRPV1蛋白表達(dá)積分光密度值均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖3～5及表2。

圖3 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠支氣管組織中SP蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色,×200)

圖4 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠支氣管組織中CGRP蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色,×200)

圖5 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠支氣管組織中TRPV1蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色,×200)

表2 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠支氣管組織中SP、CGRP及TRPV1蛋白表達(dá)積分光密度值比較

2.5各組大鼠大腦皮質(zhì)中IL-6、IL-1β表達(dá)情況比較 IL-6、IL-1β表達(dá)在神經(jīng)細(xì)胞胞漿,為黃棕色顆粒狀。模型組大鼠大腦皮質(zhì)中IL-6、IL-1β表達(dá)積分光密度值均明顯高于正常組(P均<0.05),各藥物組大鼠大腦皮質(zhì)中IL-6、IL-1β表達(dá)積分光密度值均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖6、圖7及表3。

圖6 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠大腦皮質(zhì)中IL-6表達(dá)情況(免疫組化染色,×200)

圖7 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠大腦皮質(zhì)中IL-1β表達(dá)情況(免疫組化染色,×200)

表3 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠大腦皮質(zhì)中IL-6、IL-1β表達(dá)積分光密度值比較

3 討 論

咳嗽是呼吸系統(tǒng)重要的防御機(jī)制,可以及時(shí)清除氣道分泌及呼吸道異物;當(dāng)其功能失調(diào)時(shí),表現(xiàn)為咳嗽不可抗拒的發(fā)作,甚至對(duì)輕微的環(huán)境刺激都產(chǎn)生高敏反應(yīng)?？人砸呀?jīng)成為全球普遍存在的醫(yī)學(xué)問題,亞太國(guó)家的一項(xiàng)調(diào)查顯示,約10%的成年人被咳嗽困擾,老年人所占比重較大[13]。一項(xiàng)針對(duì)老年人的調(diào)查發(fā)現(xiàn),慢性持續(xù)性咳嗽對(duì)精神健康的影響與中風(fēng)或帕金森病相當(dāng)[14]。盡管對(duì)慢性咳嗽有細(xì)致的診療方案,但仍有12%～42%的患者無(wú)法解釋病因或難以治愈。此外,缺乏有效和安全的治療咳嗽藥物,歐洲進(jìn)行的一項(xiàng)調(diào)查研究顯示,慢性咳嗽患者止咳藥治療有效率僅為57%,而無(wú)效率達(dá)到36%[15],這一數(shù)據(jù)也說明在治療咳嗽方面需要尋求更為有效的治療藥物和治療策略。

咳嗽高敏綜合征概念來源于2014年7月在倫敦舉行的第八屆國(guó)際咳嗽會(huì)議。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,咳嗽依托于疾病,通常與其病因密切相關(guān)。而咳嗽高敏綜合征概念的基礎(chǔ)是咳嗽神經(jīng)通路,認(rèn)為疾病僅僅起到觸發(fā)作用,而不是咳嗽的直接原因,強(qiáng)調(diào)咳嗽反射通過外周神經(jīng)和中樞神經(jīng)共同調(diào)控保持平衡,外周刺激信號(hào)主要通過迷走神經(jīng)介導(dǎo),而大腦中樞在咳嗽反射調(diào)控過程中發(fā)揮著更重要的作用[16]。

辣椒素是辣椒的有效成分,可引起機(jī)體疼痛、燒灼感以及咳嗽,研究中一般作為咳嗽的誘發(fā)劑。TRPV1是辣椒素的受體,廣泛存在于氣道壁感覺神經(jīng)元、氣道平滑肌和支氣管黏膜上皮細(xì)胞中,其在慢性咳嗽患者中表達(dá)增加[17]。最近的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)探討了TRPV1拮抗劑SB-705498對(duì)辣椒素誘導(dǎo)咳嗽反應(yīng)的影響,發(fā)現(xiàn)盡管TRPV1拮抗劑可以降低咳嗽反射對(duì)辣椒素的敏感性,但是24 h咳嗽次數(shù)、患者自評(píng)咳嗽嚴(yán)重程度、咳嗽沖動(dòng)和咳嗽特異性生活質(zhì)量相對(duì)于安慰劑組未見明顯差異[18]。神經(jīng)源性炎癥過程需要神經(jīng)遞質(zhì)介導(dǎo),SP和CGRP是具有多種生物活性的速激肽,二者可通過刺激感覺神經(jīng)末梢介導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥發(fā)生,引起鈣內(nèi)流、支氣管平滑肌收縮、氣道上皮損傷、黏液分泌及血管通透性增加、血漿滲出等多種生物學(xué)表現(xiàn)[19-20]。白細(xì)胞介素參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、信息傳遞、免疫細(xì)胞激活以及介導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖和分化等多種作用,IL-6和IL-1β是白細(xì)胞介素家族中介導(dǎo)中樞神經(jīng)炎癥的主要促炎分子,據(jù)研究多種中藥或其有效成分可降低IL-6、IL-1β水平,增加皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量,減輕神經(jīng)損傷[21-23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組大鼠出現(xiàn)了病理組織結(jié)構(gòu)性損傷,上皮變性,平滑肌層增生、紊亂,且伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)等;大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞中尼氏體變少;支氣管黏膜上皮中SP、CGRP、TRPV1和大腦皮質(zhì)中IL-6、IL-1β表達(dá)上調(diào)。提示煙熏建立的咳嗽高敏綜合征模型可引發(fā)腦組織的功能性損傷,這可能與神經(jīng)炎癥有關(guān),但目前未見到有關(guān)咳嗽與腦組織關(guān)系的報(bào)道,其深層機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為咳嗽屬于“久咳”“頑咳”范疇?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》提出“五臟六腑皆令人咳,非獨(dú)肺也”,認(rèn)為咳嗽作為癥狀,與其他臟器的功能障礙有密切聯(lián)系。中醫(yī)既往對(duì)咳嗽辨證分型較多,現(xiàn)刪繁就簡(jiǎn),一般分為外感咳嗽和內(nèi)傷咳嗽兩大類,其病因病機(jī)多為外邪所傷,臟腑虛損等而致祛邪不盡,留伏于內(nèi),成為伏邪,復(fù)因外邪引動(dòng),內(nèi)外合邪,肺氣上逆而作咳嗽[24]。芎蝎散源自宋代陳文中《小兒病源方論》的家傳累世名方,原方為川芎、蓽茇各1兩,蝎稍去毒尖1錢,細(xì)辛、半夏各2錢。加味芎蝎散是在前人基礎(chǔ)上加白前、五味子、蘆根等藥而成方,方中川芎活血行氣、祛風(fēng)止咳;全蝎搜風(fēng)通絡(luò),以散肺風(fēng);配合細(xì)辛、蓽茇、半夏溫肺化痰止咳;白前降氣止咳;五味子斂肺止咳;蘆根清肺止咳。該方在臨床使用中療效確切,不良反應(yīng)率低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與模型組比較,加味芎蝎散高、中劑量組大鼠咳嗽次數(shù)明顯減少,病理變化均有不同程度的減輕,支氣管組織中SP、CGRP、TRPV1和大腦皮質(zhì)中IL-6、IL-1β表達(dá)積分光密度值均明顯降低。證實(shí)加味芎蝎散方可以減少咳嗽高敏綜合征大鼠的咳嗽次數(shù),減輕肺組織炎癥,保護(hù)腦神經(jīng)元,下調(diào)神經(jīng)源性炎癥因子表達(dá)。

綜上所述,加味芎蝎散方可以抑制咳嗽高敏綜合征大鼠的咳嗽反射,減輕肺組織和腦神經(jīng)元損傷,其作用機(jī)制可能與抑制神經(jīng)源性炎癥有關(guān)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。