馬瑞麟，岳亮，贠志敏，樓張蓉，劉琦，崔宏圖，鐘鵬飛，高卓，檀英霞，吳成君

（1.大連理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116024；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院衛(wèi)生勤務(wù)與血液研究所，北京 100850；3.空軍特色醫(yī)學(xué)中心腎病科，北京 100089）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是指由多種病因造成腎功能在短期內(nèi)的迅速下降［1］。導(dǎo)致AKI 的原因眾多，如藥物腎毒性、腎血流減少、重大手術(shù)后遺癥和敗血病等［2］。藥物不良反應(yīng)是導(dǎo)致AKI 的一個重要誘因，如西多福韋（cidofovir）、阿德福韋（adefovir）和替諾福韋（tenofovir）等抗病毒藥物會導(dǎo)致急性腎小管壞死等癥狀繼而導(dǎo)致AKI 發(fā)生［3］。藥物的腎毒性與AKI 患者發(fā)病率和死亡率相關(guān)，也是藥物研發(fā)臨床試驗失敗的重要原因?？鼓[瘤藥物順鉑（cisplatin）是典型的致AKI 藥物，可誘導(dǎo)胱天蛋白酶介導(dǎo)的腎近端小管細(xì)胞急性凋亡［4］。因此，其抗腫瘤療效受到嚴(yán)重腎毒性的限制。

AKI 在病因?qū)W、病理生理學(xué)和腎疾病進(jìn)展方面是一種高度異質(zhì)性疾病，而腎作為人體的重要代謝器官和藥物毒性的主要靶器官，合適的篩選腎毒性化合物平臺對于早期預(yù)測新藥安全和改善腎毒性藥物的臨床管理至關(guān)重要。然而每種生物模型都有其固有的優(yōu)點和局限性，因種屬差異性動物很難用于表征人類對藥物的真實反應(yīng)、2D細(xì)胞系對藥物暴露的敏感性低等問題，限制了對AKI 致病機(jī)制的研究［5］。因此，開發(fā)基于人類的體外模型對于闡明AKI致病機(jī)制、探尋新的治療方法具有重要意義［6］。

類器官是類似于組織器官的細(xì)胞培養(yǎng)物，是由多能干細(xì)胞（pluripotent stem cells，PSC）在體外培育而成的具有來源器官顯微解剖特征的多細(xì)胞3D結(jié)構(gòu)，是目前生物醫(yī)學(xué)中極具特色而且富有活力的新興技術(shù)［7-8］。腎類器官通過模擬生理狀態(tài)下人胚胎腎發(fā)育過程，誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ES）或誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）朝腎發(fā)育［9］。在Wnt 通路和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，Bmp）的作用下［10-11］，ES 或iPSC 被誘導(dǎo)成為原條細(xì)胞［12］，繼而分化為中胚層。中胚層可劃分為軸旁、側(cè)板及中間中胚層（intermediate mesoderm，IM）［13］。源自IM 發(fā)育而來的輸尿管芽（ureteric bud）與后腎間充質(zhì)（metanephric mesenchyme）互相誘導(dǎo)分化，最終產(chǎn)生成熟的腎［14］。成熟的腎類器官由1 或2 個腎單位樣結(jié)構(gòu)組成，包括腎小球、腎小管（遠(yuǎn)端腎小管和近端腎小管）、不同節(jié)段的管狀細(xì)胞、足細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等，可以實現(xiàn)腎實質(zhì)細(xì)胞間的交互作用（cross-talk）。

腎類器官避免了動物實驗因種屬差異帶來的實驗誤差，臨床相關(guān)性更強(qiáng)，比動物模型更容易操作，在培養(yǎng)皿中可實現(xiàn)高通量操作，是藥物毒性篩選及研究AKI潛在機(jī)制的理想模型［15-17］。本研究建立源自iPSC 的腎類器官，以此為體外研究模型，構(gòu)建廣譜抗腫瘤藥物順鉑誘發(fā)的AKI 模型，并對其進(jìn)行了細(xì)胞存活和腎損傷標(biāo)志物檢測，進(jìn)而確定不同濃度順鉑導(dǎo)致的AKI損傷程度。本研究以人腎類器官作為藥物致腎毒性的人體外研究模型，以期為開發(fā)更安全的藥物和改善腎毒性藥物的臨床管理提供重要研究平臺。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

人iPSC（RC01001-A）,中國中盛溯源公司。mTeSR1 培養(yǎng)基和Accutase 細(xì)胞消化液，加拿大Stem Cell 公司；臺盼藍(lán)染色液、Advanced RPMI 1640、IMDM 培養(yǎng)基、谷氨酰胺（GlutaMax，Glu）、MEM非必需氨基酸溶液（MEM non-essential amino acids solution，NEAA）、HEPES 緩沖液、血清替代物（KnockOutTMSerum Replacement-MultiSpecies）、β-巰基乙醇（2-mercaptoethanol）、PFHM-Ⅱproteinfree hybridoma 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基，Ham′s F12 nutrient mixture、青鏈霉素（penicillin streptomycin，PS）、化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物（chemically defined lipid concentrate，CD Lipid concentrate）、杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS）、牛血清白蛋白（ProbuminTMbovine serum albumin，BSA）和胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-氨基乙醇（insulin-transferrin-seleniumethanolamine，ITS-X），美國Gibco公司；溴乙啡錠二聚體Ⅰ（ethidium homodimer-Ⅰ，EthD-Ⅰ）、鈣黃綠素AM（Calcein AM），中國優(yōu)逸蘭迪生物公司；ROCK抑制劑Y-27632、聚乙烯醇（poly vinyl alcohol，PVA）、L-抗壞血酸2-磷酸鹽倍半鎂鹽水合物（L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate，AA2P）和α-硫代甘油（1-thioglycerol），美國Sigma 公司；支原體去除劑Normocin，法國Invivogen 公司；Wnt 信號激動劑CHIR99021，美國Selleck 公司。標(biāo)記遠(yuǎn)端腎小管的一抗為鼠上皮鈣黏蛋白（epithelialcadherin，ECAD）單克隆抗體，美國BD Biosciences 公司；對應(yīng)二抗為羊抗鼠IgG2a多克隆抗體（Alexa Fluor 568），美國賽默飛公司。標(biāo)記遠(yuǎn)端腎小管的一抗為鼠GATA 結(jié)合蛋3（GATA-binding protein 3，GATA3）單克隆抗體，美國Invitrogen公司；對應(yīng)二抗為羊抗鼠IgG1多克隆抗體（Alexa Fluor 647），美國賽默飛公司。標(biāo)記近端小管的一抗為蓮藕凝集素（lotustetragonolobuslectin，LTL），美國Vector公司；對應(yīng)二抗為Alexa FluorTM 488 鏈霉親和素偶聯(lián)物，美國賽默飛公司。標(biāo)記腎間質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞的一抗為兔血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）單克隆抗體，英國Abcam 公司；對應(yīng)二抗為羊抗兔IgG 多克隆抗體（Alexa Fluor 647），美國賽默飛公司。標(biāo)記足細(xì)胞的一抗為兔足細(xì)胞特異性蛋白（podo-calyxin，PODXL）多克隆抗體，美國Sigma 公司；對應(yīng)二抗為羊抗兔IgG 多克隆抗體（Alexa Fluor 488），美國賽默飛公司。標(biāo)記腎小管上皮細(xì)胞的一抗為小鼠上皮細(xì)胞黏附分子（epithelialcelladhe-sionmolecule，EPCAM）單克隆抗體，英國Abcam 公司；對應(yīng)二抗為羊抗鼠IgG1多克隆抗體（Alexa Fluor 647），美國賽默飛公司。腎損傷標(biāo)志物腎損傷因子1（kidney injury molecule-1，Kim-1）和炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素8（interleukin-8，IL-8）PCR 引物序列見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。高速離心機(jī)（centrifuge 5810R），德國艾本德公司；恒溫培養(yǎng)箱（HERAcell 150iCO2）、超微量分光光度計（ND8000），美國賽默飛公司；分體式搖床，中國MIULAB 公司；全自動定量分析系統(tǒng)（Vectra），美國Perkin elmer 公司；細(xì)胞計數(shù)儀（TC20TM）、細(xì)胞計數(shù)板和CFX96TMReal-Time System，美國伯樂公司；PCR 儀（PCR System 2400），美國GeneAmp 公司；封口膜，美國PARAFILM 公司；0.2 μm 濾器，美國Pall 公司；低黏附6孔板和干細(xì)胞生長基質(zhì)膠Matrigel354277，美國康寧公司。

1.2 腎類器官構(gòu)建和鑒定

1.2.1 腎類器官構(gòu)建

將長到70%匯合度的人iPSC 用Accutase 酶消化為單細(xì)胞狀態(tài)；300×g離心5 min，保留細(xì)胞沉淀；1 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色計數(shù)，以每孔3 500 細(xì)胞接種在低黏附96 孔板內(nèi)。48 h 后形成球形擬胚體，將其吸出轉(zhuǎn)移到低黏附6孔板內(nèi)，放入搖床培養(yǎng)24 h；在第3 天更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基。此后每2～3 d 更換1 次培養(yǎng)基，約8 d 類胚體出現(xiàn)腎類器官典型管狀結(jié)構(gòu)，12 d后腎類器官成熟［9］。

1.2.2 腎類器官鑒定

為檢測所構(gòu)建腎類器官是否具有人胚胎腎臟相似的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞類型，對體外分化成熟的腎類器官（培養(yǎng)12～15 d）進(jìn)行HE染色和免疫熒光鑒定。

HE 染色鑒定：①類器官樣品固定：4%多聚甲醛固定腎類器官過夜；②脫水：加入80%乙醇過夜，90%乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、二甲苯脫水各5 min；③制備石蠟切片，厚度4 μm，烘干；④脫蠟：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、90%乙醇、80%乙醇和60%乙醇各脫蠟5 min；⑤蘇木素染細(xì)胞核：切片置蘇木素染液染3～8 min，自來水洗，1%氨水溶液返藍(lán)3～5 s 或自來水泛藍(lán)10 min，流水沖洗；⑥伊紅染細(xì)胞質(zhì)：切片置伊紅染液中染色3～5 min，流水漂洗；⑦脫水封片待觀察。用組織切片全自動定量分析系統(tǒng)（Vectra）分析HE染色結(jié)果。

免疫熒光鑒定：使用帶熒光標(biāo)記的腎特異性抗體在組織細(xì)胞內(nèi)與對應(yīng)抗原結(jié)合，對待測腎類器官中的細(xì)胞類型進(jìn)行定位及定性研究。步驟包括：抗原修復(fù)和封閉液封閉。用封閉液按比例稀釋一抗〔ECAD（1∶200）；GATA3（1∶200）；LTL（1∶200）；CD31（1∶200）；PODXL（1∶100）；EPCAM（1∶100）〕，室溫孵育2 h，PBS溶液清洗，封閉液稀釋二抗（1∶500），避光孵育1 h；PBS溶液洗去二抗后DAPI染色10 min?？篃晒獯銣鐒┑卧诮M織上，熒光顯微鏡觀察類器官中是否表達(dá)特異性腎組織的生物標(biāo)志物［18］，如表達(dá)于近端小管的生物標(biāo)志物L(fēng)TL，表達(dá)于遠(yuǎn)端小管的生物標(biāo)志物ECAD 和GATA3等，以確定構(gòu)建的類器官是否成功。

1.3 腎類器官急性腎損傷模型構(gòu)建和鑒定

將腎類器官用DPBS 漂洗后轉(zhuǎn)移至低黏附96 孔板中，順鉑20，50 和75 μmol·L-1與腎類器官于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中共同孵育48 h，測定細(xì)胞存活率和腎損傷標(biāo)志物。

1.3.1 Live/Dead 染色法測定急性腎損傷模型的細(xì)胞存活率

將Live/Dead 染色試劑EthD-Ⅰ和Calcein AM用培養(yǎng)基配制成終濃度分別為4 和2 μmol·L-1的染色工作液，與腎類器官于37 ℃孵育1 h 后用激光共聚焦顯微鏡的488 激光通道拍攝綠色熒光圖像，568 激光通道拍攝紅色熒光圖像，觀察不同濃度順鉑處理的腎類器官中細(xì)胞凋亡率。類器官中的活細(xì)胞顯示為綠色且邊緣清晰，類器官中的死細(xì)胞顯示為紅色。同時顯微鏡觀察腎類器官給藥后的形態(tài)變化。

1.3.2 RT-qPCR檢測Kim-1和IL-8 mRNA表達(dá)水平

Trizol 試劑提取總RNA，用超微量分光光度計ND8000進(jìn)行濃度測定。取1 μg RNA 作為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄程序：55 ℃孵育5 min，85 ℃加熱5 s，4 ℃冷卻。將所得cDNA作為模板進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系：1～2 μL 模板cDNA，2×SYBR Mix 和正、反向引物各1 μL，補(bǔ)充無RNA酶水至20 μL。RT-qPCR程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，40個循環(huán)，獲得各樣品的熔解曲線。以hGAPDH作為內(nèi)參，以2-△△Ct法計算目的基因mRNA相對表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)用±s表示，使用R語言軟件進(jìn)行分析。兩組之間差異的統(tǒng)計學(xué)分析用studentst檢驗（符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)）或Wilcoxon rank sum 檢驗（非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)）。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎類器官構(gòu)建及鑒定

以人iPSC 為起始細(xì)胞（圖1A），誘導(dǎo)發(fā)育成腎類器官的過程及各階段的形態(tài)如圖1 所示。第0 天消化為單細(xì)胞狀態(tài)（圖1B），離心后細(xì)胞聚集在U型孔底部。48 h 后，細(xì)胞開始在U 型孔底部形成類胚體球體（圖1C）。第2 天更換培養(yǎng)基后腎類器官開始加速生長。直至第8 天，腎類器官開始出現(xiàn)典型的管狀結(jié)構(gòu)（圖1D），第12 天即可成熟（圖1E），HE染色可查看到培養(yǎng)的腎類器官有著典型的原始的腎小管樣結(jié)構(gòu)（圖1F）。

Fig.1 Morphology of key node cells in renal organoid culture process recorded by optical microscope.Human induced pluripotent stem cells（hiPSCs）were used as starting cells（A），and digested into single-cell state on day 0（B）.After 48 h，bubble-like spheroids formed at the bottom of the U-shaped wells（C）.After changing the medium on day 2，renal organoids began to grow at an accelerated rate，and began to exhibit typical tubular structures on day 8（D），and matured on day 12（E）.HE staining showed that the cultured renal organoids had typical primitive tubule-like structure（F，left is the 12th day stage，right is the 18th day stage）

利用免疫熒光染色技術(shù)鑒定構(gòu)建的腎類器官中關(guān)鍵腎組織標(biāo)志物的表達(dá)，結(jié)果見圖2。培養(yǎng)12 d后的腎類器官具有LTL 表達(dá)陽性（LTL+）近端小管、GATA3+和ECAD+遠(yuǎn)端小管、CD31+腎間質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞、PODXL+足細(xì)胞等典型的腎組織結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的腎細(xì)胞種類。其中，標(biāo)記遠(yuǎn)端小管的GATA3和ECAD表達(dá)定位基本重合（圖2B 和2D），且與LTL 標(biāo)記的近端小管存在位置上的連續(xù)性（圖2A），證明腎類器官中腎小管樣結(jié)構(gòu)的完整性。此外，腎間質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞主要在遠(yuǎn)端小管部分表達(dá)（圖2A和2C）。表明本研究成功構(gòu)建了包含近端小管、遠(yuǎn)端小管、足細(xì)胞、腎間質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞類型和組織結(jié)構(gòu)的腎臟類器官。

Fig.2 lmmunofluorescence identification of renal organoids which contained proximal tubules，distal tubules，podocytes，tubular epithelial cells，interstitial endothelial cells and other cell types observed by immunofluorescence staining.After 12 days of renal organion cultrure，epithelial cadherin（ECAD）was used for labeling distal tubules，while lotustetragonolobus lectins（LTL）for proximal tubules，platelet endothelial cell adhesion molecule-1（CD31）for renal interstitial endothelial cells，gata-binding protein 3（GATA3）for distal tubules，capsulin-specific protein antibody（PODXL）for podocytes，and epithelial cell adhesion molecules（EPCAM）for kidney tubular epithelial cells.A：yellow ECAD，red CD31，green LTL；B：yellow ECAD，green LTL，red GATA3；C：blue DAPI，green LTL，red CD31；D：green PODXL，yellow ECAD，red EPCAM.

2.2 急性腎損傷模型構(gòu)建及鑒定

為構(gòu)建急性腎損傷模型，本研究選擇順鉑20，50 和75 μmol·L-1，作用后48 h 可觀察到隨順鉑濃度增加，腎類器官結(jié)構(gòu)遭到破壞，類器官個體減小，外側(cè)結(jié)構(gòu)解離，細(xì)胞大量脫落，腎類器官變黑且管狀結(jié)構(gòu)明顯減少，球體變得致密（圖3）。結(jié)合圖2免疫熒光染色結(jié)果可知，近端小管標(biāo)志物L(fēng)TL 和遠(yuǎn)端小管標(biāo)志物ECAD主要表達(dá)于腎類器官中管狀結(jié)構(gòu)位置，可以認(rèn)為順鉑主要對腎小管結(jié)構(gòu)造成損傷。

Fig.3 Morphology of organoid injury model induced by cisplatin under a microscope.For mature renal organoids，medium containing cisplatin 20，50 or 75 μmol·L-1 was added and left for 48 h in the incubator.

Live/Dead染色結(jié)果（圖4）表明，順鉑20 μmol·L-1組腎類器官細(xì)胞存活率＜50%，隨順鉑濃度升高細(xì)胞存活率逐漸降低，75 μmol·L-1組細(xì)胞存活率接近0。

Fig.4 Kidney organoid cell activity of organoid injury model induced by cisplatin by Live/Dead staining and laser confocal observation.After treatment with cisplatin for 48 h，cell activity of kidney organoids was observed by Live/Dead staining and then laser confocal observation.

RT-qPCR 結(jié)果（圖5）表明，順鉑處理48 h 后，順鉑20，50和75 μmol·L-1均能顯著誘導(dǎo)腎類器官細(xì)胞Kim-1mRNA（P＜0.01）和IL-8mRNA（P＜0.01）表達(dá)。

Fig.5 Expressions of kidney injury molecule-1（A）and interleukin-8 mRNA（B）in organoid injury model induced by cisplatin.After treatment with cisplatin for 48 h，mRNA expressions were detected by RT-qPCR.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

3 討論

人腎類器官作為新的體外模型平臺，常用于發(fā)育、疾病模型、藥物毒性和再生修復(fù)的研究［19］。越來越多的研究表明，人腎類器官作為藥物致腎損傷的人體外研究模型是可行的，如多柔比星、慶大霉素、紅霉素、IL-1β、他克莫司（tacrolimus）和脂多糖等均通過腎類器官構(gòu)建了腎損傷模型，并開展了相關(guān)損傷機(jī)制的研究［20］，為開發(fā)更安全的藥物和改善腎毒性藥物的臨床管理提供了重要的研究平臺，同時減少實驗動物的使用。本研究成功構(gòu)建了具有原始腎小管樣結(jié)構(gòu)，含近端小管、遠(yuǎn)端小管、足細(xì)胞、腎間質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞類型的腎類器官，并基于此模型重點關(guān)注了抗癌藥物順鉑的腎毒性。

順鉑是一種用于治療多種癌癥的化療藥物。順鉑化療后致AKI 是一種常見的嚴(yán)重不良反應(yīng)，主要損傷近端小管。AKI的診斷基于非臨床或臨床生物標(biāo)志物水平，血清肌酐和尿素氮均AKI 晚期的生物標(biāo)志物，缺乏敏感性［21］。

為了提高預(yù)測發(fā)生AKI的能力以便及時進(jìn)行治療，越來越多的研究致力于尋找比血肌酐更早更敏感的AKI 診斷的新的生物標(biāo)志物。Kim-1 是甲型肝炎病毒和含T-細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白域蛋白4（T-cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 4）的膜受體，是腎近曲小管上皮細(xì)胞的一種跨膜糖蛋白，與腎損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。正常情況下，腎組織幾乎不表達(dá)Kim-1蛋白，但在腎損傷后數(shù)小時內(nèi)Kim-1 的表達(dá)水平即顯著升高。Kim-1作為AKI 發(fā)生早期的生物標(biāo)志物，在體外和體內(nèi)研究中均能特異識別腎損傷，在藥物誘導(dǎo)的AKI 腎毒性中具有很好的預(yù)測作用［22］。本研究結(jié)果表明，隨著順鉑濃度增加，Kim-1mRNA 表達(dá)水平顯著升高，即Kim-1mRNA 表達(dá)水平與順鉑存在劑量依賴效應(yīng)，表明Kim-1 作為評估AKI標(biāo)志物具有可行性。后期本課題組計劃檢測AKI 患者尿液中Kim-1 濃度，以期為診斷、監(jiān)控和量化腎損傷提供非侵入性和更敏感的生物標(biāo)志物。IL-8 又稱CXCL8，是趨化因子家族的細(xì)胞因子，通過對中性粒細(xì)胞的細(xì)胞趨化作用而實現(xiàn)其對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。將Kim-1 聯(lián)合其他早期診斷標(biāo)志物（如IL-8）和中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白等，可為臨床診斷提供可靠的依據(jù)。本研究結(jié)果表明，IL-8mRNA 表達(dá)水平在給藥后顯著升高，但未呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)，后續(xù)需進(jìn)一步驗證。

本研究結(jié)果表明，在順鉑致AKI 模型中，Kim-1作為腎損傷標(biāo)志物更穩(wěn)定，可為順鉑的臨床安全應(yīng)用提供參考，進(jìn)而為該類藥物相關(guān)用藥決策制定和不良反應(yīng)的應(yīng)對措施提供科學(xué)依據(jù)和判斷標(biāo)準(zhǔn)。