王勇懿，葉雨萌，李小宇，王雪佳，段敏，楊雪楓，左紅艷，郝延輝，李楊，周平坤

（1.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南衡陽(yáng) 421200；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

放射損傷主要發(fā)生于臨床腫瘤放療和多種核輻射突發(fā)事件?；谀c、肺和腦的生理功能及其組織的放射敏感性，其放射損傷及防治受到關(guān)注［1］。小腸為電離輻射高度敏感組織，肺和腦分別為中度和低敏感組織［2-4］。放射性小腸損傷導(dǎo)致消化、吸收功能和腸免疫屏障功能下降，引起一系列并發(fā)癥甚至死亡［5］。放射性肺纖維化為放射病的非隨機(jī)性遠(yuǎn)后效應(yīng)之一，嚴(yán)重者也可導(dǎo)致呼吸衰竭而死亡。放射性腦損傷能引起腦組織長(zhǎng)期慢性炎癥反應(yīng)，持續(xù)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙和細(xì)胞死亡［6］。

抗放射藥物主要分為放射保護(hù)劑、放射緩解劑和放射治療藥物［7］。放射保護(hù)劑指機(jī)體在受照射前使用能夠緩解放射對(duì)機(jī)體造成損傷的藥物，如含硫化合物氨磷?。╝mifostine）等［8］。放射緩解劑需要在受照后24 h 內(nèi)使用，減輕放射損傷，如帕利夫明（palifermin）［9］等。放射后的救治藥物稱為放射治療藥物，美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)的4 種放射治療藥物為非格司亭（filgrastim）、硫培非格司亭（mecapegfilgrastim）、沙格司亭（sargramostim）和羅米司亭（romiplostim），其發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵在于促進(jìn)造血功能恢復(fù)［10-11］。放射導(dǎo)致機(jī)體多組織多類型損傷，造血系統(tǒng)的功能恢復(fù)為放射損傷治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，但尋找其他機(jī)制的放射治療藥物仍至關(guān)重要。

重組人胸腺素β4（recombinant human thymosin β4，rh-Tβ4）是我國(guó)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重組蛋白。前期研究表明，rh-Tβ4 能夠減輕電離輻射所致細(xì)胞DNA 損傷，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)照射后細(xì)胞增殖，減輕炎癥，其作用機(jī)制尚未闡明［22］。PCR 芯片從技術(shù)上以其高通量、高準(zhǔn)確性、高速和少污染等優(yōu)勢(shì)解決了傳統(tǒng)核酸檢測(cè)技術(shù)操作繁雜、檢測(cè)效率低等不足，且具有通路特異性，能針對(duì)某通路或某生物學(xué)過(guò)程篩選出特異差異基因及差異通路［12-14］。炎癥小體和凋亡PCR 芯片可以檢測(cè)放射及給藥后相關(guān)的炎癥小體和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平。本研究選擇放射敏感程度不同的小腸、肺和腦3 個(gè)組織作為主要研究對(duì)象，通過(guò)炎癥小體及凋亡PCR 功能分類基因芯片初步探討rh-Tβ4 對(duì)急性放射多組織損傷的治療作用及其可能機(jī)制，并篩選有價(jià)值的并需進(jìn)行深入機(jī)制研究的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 藥物、主要試劑和儀器

rh-Tβ4凍干粉劑（每支0.1 mg），純度＞95%，生物學(xué)活性為1.51，每支內(nèi)毒素含量＜1 EU，批號(hào)：C20210401，由北京諾思蘭德生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)。用生理鹽水配制成0.1 g·L-1原液，臨用前用生理鹽水稀釋至0.4 mg·L-1備用。

放射免疫沉淀測(cè)定（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液，中國(guó)Bioworld公司；蛋白酶抑制劑，美國(guó)Bimake 公司；Trizol（R411-01）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Q712）和PCR試劑盒（R233-01），南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、白細(xì)胞介素4（interleukin-4，IL-4）、IL-13 和IL-18 放射免疫檢測(cè)試劑盒，福瑞潤(rùn)澤生物技術(shù)有限公司；炎癥小體及凋亡功能分類PCR芯片，上海卓灝醫(yī)藥科技有限公司；使用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增基因引物，引物序列（表1）由上海卓灝醫(yī)藥科技有限公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）儀（CFX Opus 96），伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

Tab.1 Primer sequences for real-time quantiative PCR（RT-qPCR）

1.2 動(dòng)物、分組和處理

90 只SPF 級(jí)雄性C57BL/6N 小鼠，體重20～22 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（溫度22～23 ℃，濕度40%）。將小鼠隨機(jī)均分為3組：正常對(duì)照組、模型組、模型+rh-Tβ4 5 μg·kg-1組，每組25只。

小鼠裝入電離輻射專用照射盒中，模型組和模型+rh-Tβ4 組小鼠采用60Co-γ 射線單次照射，照射劑量為8 Gy，靶距為4 m，劑量率59.84 cGy·min-1。將正常對(duì)照組置于相同時(shí)間和條件下假照射。

照射后24 h ip給予rh-Tβ4 5 μg·kg-1，每天1次，連續(xù)3 d。正常對(duì)照組和模型組給予等體積生理鹽水。

1.3 組織樣品制備

照射后第3，7 和11 天進(jìn)行取材，每組每時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選5 只小鼠，根據(jù)體重ip給予0.5%戊巴比妥鈉麻醉后處死，取全腦、全肺和全小腸并用生理鹽水洗凈，濾紙吸干水分后，取右腦、右肺和空腸2 cm（幽門下11 cm）用于細(xì)胞因子檢測(cè)；取左腦、左肺、空腸1 cm（幽門下10 cm）用于PCR 功能分類基因芯片檢測(cè)；組織樣品均凍存于液氮中備用。細(xì)胞因子檢測(cè)和炎癥小體PCR 芯片差異基因驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的取材時(shí)間點(diǎn)為照射后第11 天，凋亡PCR 芯片差異基因驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的取材時(shí)間點(diǎn)為照射后第3，7和11天。

1.4 放射免疫法檢測(cè)小鼠腦、肺和小腸組織中細(xì)胞因子TNF-α，lL-4，lL-13，lL-18和TGF-β含量

取1.3 制備的組織樣品，稱重，按照1∶10 加入RIPA 裂解液（含10%蛋白酶抑制劑），并用超聲儀將組織震碎，離心（15 294×g，10 min）后取上清液。根據(jù)說(shuō)明書(shū)，用放射免疫試劑盒檢測(cè)TNF-α，IL-4，IL-13，IL-18和TGF-β含量。

1.5 PCR 功能分類基因芯片檢測(cè)小鼠炎癥小體及凋亡相關(guān)差異基因

取1.3 制備的組織樣品，采用Trizol 法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，加入熒光定量PCR 擴(kuò)增試劑（染料法）550 μL，cDNA 10 ng，無(wú)RNA 酶純水補(bǔ)至總體積1100 μL；將上述混合液加到PCR 芯片各孔，室溫離心；后將芯片置于RT-qPCR 儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。程序設(shè)置如下：聚合酶激活/變性95 ℃，30 min后，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)（95 ℃，15 s；60 ℃，1 min）。使用多個(gè)內(nèi)源參考基因β 肌動(dòng)蛋白（β-actin，ACTB）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，DAPDH）、次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hypoxanthine phosphoribosyltransferase，HPRT）、核糖體蛋白側(cè)柄亞基P1（ribosomal protein lateral stalk subunit P1，RPLP1）和葡萄糖醛酸酶β（glucuronidase beta，GUSB）對(duì)mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算每組基因表達(dá)倍數(shù)變化。P＜0.05 且差異倍數(shù)＞1.5 確定為差異基因。

1.6 RT-qPCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因

取1.3 制備的組織樣品，用Trizol 法提取組織RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，加入2×TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，正反引物1 μL，無(wú)RNA酶水補(bǔ)至總體積20 μL；將配制好的反應(yīng)體系放入qPCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃30 s；95 ℃10 s，60 ℃30 s，循環(huán)40 次；65 ℃5 s；95 ℃，5 s。用GAPDH為內(nèi)參，通過(guò)2-ΔΔCt方法計(jì)算待測(cè)基因相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，應(yīng)用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。細(xì)胞因子和RT-qPCR 結(jié)果分析采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法；PCR基因芯片結(jié)果分析采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 rh-Tβ4對(duì)照射后小鼠小腸、肺和腦組織炎癥細(xì)胞因子TNF-α，TGF-β，lL-4，lL-13和lL-18含量的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠小腸、肺及腦組織中細(xì)胞因子TNF-α，TGF-β 和IL-18 含量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），IL-4 和IL-13 含量無(wú)明顯變化；與模型組相比，模型+rh-Tβ4 組小鼠小腸、肺及腦組織中TNF-α含量顯著降低（P＜0.05），小腸和腦組織中TGF-β 和IL-18 含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），且與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異（圖1）。

Fig.1 Effect of recombinant human thymosin β4（rh-Tβ4）on contents of TNF-α（A），TGF-β（B），lL-4（C），lL-13（D）and lL-18（E）in small intestine，lung and brain tissues of mice after irradiation.C57BL/6N mice were randomly divided equally into 3 groups：normal control group，model group，and model+rh-Tβ4 5 μg·kg-1 group.Mice in the model and model+rh-Tβ4 groups were radiated with 60Co-γ rays in a single exposure at a dose of 8 Gy，and the mice in normal control group were placed under sham irradiation at the same time and under the same conditions.The mice in model+rh-Tβ4 group were ip administered rh-Tβ4 5 μg·kg-1 24 h after irradiation，once a day for 3 consecutive days.Equal volumes of saline were given to the mice in normal control and model groups.Mice were sacrificed on day 11 after irradiation，and the right brain，right lung，and 2 cm of jejunum（11 cm below the pylorus）were removed for cytokine detection.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.2 rh-Tβ4 對(duì)照射后小鼠炎癥小體通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.2.1 小腸組織

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠小腸組織中差異基因共13 個(gè)：上調(diào)基因3 個(gè)，其中Ccl12和Ccl7為NOD-樣受體下游信號(hào)通路基因，IL-18屬于炎癥小體下游信號(hào)基因；下調(diào)基因10個(gè)，其中Nlrc4是炎癥小體相關(guān)基因，P2rx7是其下游信號(hào)基因，Bcl2l1為炎癥小體負(fù)調(diào)節(jié)基因，Irf4，Ccl5，Chuk，Birc3，Xiap，Mapk3和Mapk8屬于NOD-樣受體下游信號(hào)基因。模型+rh-Tβ4 組上調(diào)基因3 個(gè)，其中Casp12為炎癥小體相關(guān)基因，Bag3和Bax是其下游信號(hào)基因；下調(diào)基因2 個(gè)，Bak1和Casp8屬于下游信號(hào)基因。與模型組相比，模型+rh-Tβ4組下調(diào)基因1個(gè)，為Ciita，屬于NOD-樣受體（表2，圖2）。

Fig.2 Volcano plot of effect of rh-Tβ4 on expressions of inflammasome-related genes in small intestinal tissues of mice after irradiation.See Fig.1 for the mouse treatment.Mice were sacrificed on day 11 after irradiation，and 1 cm of jejunum（10 cm below the pylorus）was removed for inflammasome PCR gene chip assay.Significant difference was defined as P＜0.05，and a fold change（FC）＞1.5 was used as a criterion for differential gene determination.A：model group compared to normal control group；B：model+rh-Tβ4 group compared to model group；C：model+rh-Tβ4 group compared to normal control group.

Tab.2 Effect of rh-Tβ4 on expressions of inflammasome-related genes in small intestinal tissue of mice after irradiation

2.2.2 肺組織

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織中差異基因共9個(gè)：上調(diào)基因7個(gè)，其中Nod2屬于NOD-樣受體，Ccl12，Cflar，Chuk，Mapk8，Mok和Notch1是其下游信號(hào)基因；下調(diào)基因2 個(gè)，其中Ccl5為NOD-樣受體下游信號(hào)通路基因，Tnfsf14屬于炎癥小體負(fù)調(diào)節(jié)基因。模型+rh-Tβ4 組上調(diào)基因1 個(gè)，為Bag3，屬于炎癥小體下游信號(hào)基因；下調(diào)基因2 個(gè)，為Mif和Trp53，屬于炎癥小體下游信號(hào)基因。與模型組相比，模型+rh-Tβ4 組上調(diào)基因4 個(gè)，Nlrp12和Nlrp9b屬于NOD-樣受體，IL-6和Tnf是其下游信號(hào)基因（表3，圖3）。

Fig.3 Volcano plot of effect of rh-Tβ4 on expressions of inflammasome-related genes in lung tissues of mice after irradiation.See Fig.1 for the mouse treatment.Mice were sacrificed on day 11 after irradiation，and the left lung was removed for inflammasome PCR gene chip assay.Significant difference was defined as P＜0.05，and FC＞1.5 was used as a criterion for differential gene determination.A：model group compared to normal control group；B；model+rh-Tβ4 group compared to model group；C：Model+rh-Tβ4 group compared to normal control group.

Tab.3 Effect of rh-Tβ4 on expressions of inflammasome-related genes in lung tissues of mice after irradiation

2.2.3 腦組織

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織中差異基因共11 個(gè)，上調(diào)基因10 個(gè)，其中Naip1屬于炎癥小體相關(guān)基因，Ifng是其下游信號(hào)基因，Tnfsf11，Tnfsf4和Mefv屬于炎癥小體負(fù)調(diào)節(jié)基因，Nlrp4b，Nlrp4e，Nlrp5和Nlrp9b屬于NOD-樣受體，IL-6是其下游信號(hào)基因；下調(diào)基因Ciita屬于NOD-樣受體。模型+rh-Tβ4 組上調(diào)基因1 個(gè)，Igf1r屬于炎癥小體下游信號(hào)基因，下調(diào)基因2 個(gè)，Bcl2l1屬于炎癥小體負(fù)調(diào)節(jié)基因，Trp53屬于炎癥小體下游信號(hào)基因。與模型組相比，模型+rh-Tβ4 組有20 個(gè)差異基因，全部為下調(diào)基因，其中Naip1和Naip5屬于炎癥小體相關(guān)基因，Ifng，IL-12b，IL-1b和Irf4是其下游信號(hào)基因，Cd40lg，Tnfsf11，Tnfsf14，Tnfsf4和Mefv屬于炎癥小體負(fù)調(diào)節(jié)基因，Nlrp12，Nlrp4b，Nlrp4e，Nlrp5和Nlrp9b屬于NOD-樣受體，Ifnb1，IL-6和Tnf是其下游信號(hào)基因（表4，圖4）。

Fig.4 Volcano plot of effect of rh-Tβ4 on expressions of inflammasome-related genes in brain tissue of mice after irradiation.See Fig.1 for the mouse treatment.Mice were executed on day 11 after irradiation and the left brain was removed for inflammasome PCR gene chip assay.Significant difference was defined as P＜0.05，and FC＞1.5 was used as a criterion for differential gene determination.A：model group compared to normal control group；B：model+rh-Tβ4 group compared to model group；C：model+rh-Tβ4 group compared to normal control group.

Tab.4 Effect of rh-Tβ4 on expressions of inflammasome-related genes in brain tissues of mice after irradiation

2.3 炎癥小體PCR芯片差異基因驗(yàn)證

根據(jù)炎癥小體基因芯片篩選出的差異基因及其功能，小腸、肺和腦組織各選擇3 個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證。小腸選擇炎癥小體相關(guān)基因Nlrc4、炎癥小體負(fù)向調(diào)節(jié)基因Bcl2l1和NOD-樣受體下游信號(hào)基因Xiap；肺組織選擇NOD-樣受體下游信號(hào)基因IL-6，Tnf和炎癥小體下游信號(hào)基因Ifng；腦組織選擇炎癥小體相關(guān)基因Naip、負(fù)向調(diào)節(jié)基因Mefv和Tnfsf11。

2.3.1 小腸組織

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠小腸組織中Nlrc4mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；模型+rh-Tβ4組無(wú)顯著差異，且與模型組相比亦無(wú)顯著差異；與PCR 芯片結(jié)果不一致。與正常對(duì)照組相比，模型組Bcl2l1mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；模型+rh-Tβ4組無(wú)顯著差異，但較模型組顯著上調(diào)（P＜0.05）；與PCR 芯片結(jié)果一致。與正常對(duì)照組相比，模型組XiapmRNA 表達(dá)有升高趨勢(shì)，模型+rh-Tβ4 組較模型組有下調(diào)趨勢(shì)，但均無(wú)顯著性差異，與PCR 芯片結(jié)果不一致（圖5A）。

Fig.5 Effect of rh-Tβ4 on inflammasome-related genes in small intestine（A），lung（B）and brain（C）tissues of mice after irradiation.See Fig.1 for the mouse treatment.Mice were sacrificed on day 11 after irradiation，and the left brain，left lung，and 1 cm of jejunum（10 cm below the pylorus）were removed for inflammasome PCR microarray differential gene validation.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the normal control group；#P＜0.05，compared with model group.

2.3.2 肺組織

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織中IL-6mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）；模型+rh-Tβ4 組無(wú)顯著差異，但較模型組顯著下調(diào)（P＜0.05）；與PCR芯片結(jié)果不一致。與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織中TnfmRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）；模型+rh-Tβ4組無(wú)顯著差異，但較模型組顯著下調(diào)（P＜0.05）；與PCR 芯片結(jié)果不一致。與正常對(duì)照組相比，模型和模型+rh-Tβ4 組Ifng表達(dá)均無(wú)顯著差異，與PCR芯片結(jié)果不一致（圖5B）。

2.3.3 腦組織

與正常對(duì)照組相比，模型組及模型+rh-Tβ4 組小鼠腦組織中MefvmRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），模型+rh-Tβ4 組較模型組無(wú)顯著差異，與PCR 芯片結(jié)果一致。與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠腦組織中NaipmRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）；模型+rh-Tβ4 組無(wú)顯著差異，較模型組亦無(wú)顯著差異；與基因芯片結(jié)果一致。與正常對(duì)照組相比，模型組腦組織中Tnfsf11mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）；模型+rh-Tβ4 組無(wú)顯著差異，但較模型組顯著下調(diào)（P＜0.05）；與PCR芯片結(jié)果一致（圖5C）。

2.4 rh-Tβ4 對(duì)照射后小鼠凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

采用凋亡PCR芯片分析了84個(gè)參與細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因的表達(dá)。該芯片包括TNF 配體及其受體、死亡結(jié)構(gòu)域、死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域以及P53 和DNA損傷途徑中涉及的基因。

2.4.1 小腸組織

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠小腸組織中差異表達(dá)基因共3 個(gè)，全部為上調(diào)基因，Birc5為抗凋亡基因，Cideb為DNA 損傷基因，Tnfsf10b為死亡域受體；模型+rh-Tβ4 組差異基因共10 個(gè)，上調(diào)基因Bax和Casp14為促凋亡基因，下調(diào)基因Casp1，Casp4和Casp7為促凋亡基因，Naip1，Pycard和Tnfsf10為抗凋亡基因。與模型組相比，模型+rh-Tβ4組無(wú)差異基因（表5，圖6）。

Fig.6 Volcano plot of effect of rh-Tβ4 on expressions of apoptosis-related genes in small intestinal tissues of mice after irradiation.See Fig.1 for the mouse treatment.Mice were sacrificed on day 11 after irradiation and 1 cm of jejunum（10 cm below the pylorus）was used for apoptosis PCR microarray assay.Significant difference was defined as P＜0.05，and FC＞1.5 was used as a criterion for differential gene determination.A：model group compared to normal control group；B；model+rh-Tβ4 group compared to model group；C：model+rh-Tβ4 group compared to normal control group.

Tab.5 Effect of rh-Tβ4 on apoptosis-related gene expressions in small intestinal tissues of mice after irradiation

2.4.2 肺組織

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織中差異表達(dá)基因共6 個(gè)：上調(diào)基因Bax為促凋亡基因，Tnfsf10b為死亡域受體基因；下調(diào)基因Birc5和Cd40lg為抗凋亡基因，Casp1和Fasl屬于促凋亡基因。模型+rh-Tβ4組差異基因共4個(gè)，上調(diào)基因Bax為促凋亡基因，Tnfrsf10b為死亡域受體基因，下調(diào)基因Birc5和Cd40lg為抗凋亡基因。與模型組相比，模型+rh-Tβ4組較模型組無(wú)差異基因（表6，圖7）。

Fig.7 Volcano plot of effect of rh-Tβ4 on expressions of apoptosis-related genes in lung tissues of mice after irradiation.See Fig.1 for the mouse treatment.Mice were sacrificed on day 11 after irradiation，and the left lung was taken for apoptosis PCR microarray detection.Significant difference was defined as P＜0.05，and FC＞1.5 was used as a criterion for differential gene determination.A：model group compared to normal control group；B：model+rh-Tβ4 group compared to model group；C：model+rh-Tβ4 group compared to normal control group.

Tab.6 Effect of rh-Tβ4 on apoptosis-related gene expressions in lung tissue of mice after irradiation.

2.4.3 腦組織

與正常對(duì)照組相比，模型組腦組織中差異表達(dá)基因共12 個(gè)，上調(diào)基因Bax和Casp14屬于促凋亡基因；下調(diào)基因IL-10，Cd40lg，Naip1，Pycard，Tnfsf10和Traf屬于抗凋亡基因，F(xiàn)asl屬于促凋亡基因。模型+rh-Tβ4 組差異基因共1 個(gè)，上調(diào)基因Tnfrsf10b，為死亡域受體基因。與模型組相比，模型+rh-Tβ4 組有4 個(gè)上調(diào)差異基因Cd40lg，Nr2e1，Trp73和Lhx4，均屬于抗凋亡基因（表7，圖8）。

Fig.8 Volcano plot of effect of rh-Tβ4 on expressions of apoptosis-related genes in brain tissue of mice after irradiation.See Fig.1 for the mouse treatment.Mice were sacrificed day 11 after irradiation，and the left brain was taken for apoptosis PCR microarray.Significant difference was defined as P＜0.05，and FC＞1.5 was used as a criterion for differential gene determination.A：model group compared to normal control group；B：model+rh-Tβ4 group compared to model group；C：model+rh-Tβ4 group compared to normal control group.

Tab.7 Effects of rh-Tβ4 on apoptosis-related gene expressions in brain tissue of mice after irradiation

2.5 凋亡PCR芯片差異表達(dá)基因驗(yàn)證

由于凋亡芯片取材時(shí)間為照射后11 d，檢測(cè)出差異表達(dá)基因較少，故驗(yàn)證時(shí)增加了照射后3 和7 d 2 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，驗(yàn)證凋亡PCR 芯片篩選出的抗凋亡差異表達(dá)基因Tnfsf10和Cd40lg及促凋亡差異表達(dá)基因Fasl。

2.5.1 Tnfsf10

小腸組織：照射后3 d，模型組和模型+rh-Tβ4組Tnfsf10mRNA 表達(dá)較正常對(duì)照組顯著下調(diào)（P＜0.01），其他時(shí)間點(diǎn)各組無(wú)差異，與PCR 芯片結(jié)果不一致（圖9A）。

Fig.9 Effect of rh-Tβ4 on Tnfsf10 gene expression in small intestine（A），lung（B），and brain（C）tissues of mice after irradiation.See Fig.1 for the mouse treatment.Mice were sacrificed on day 3，7，and 11 after irradiation，and the right brain，right lung，and 1 cm of jejunum（10 cm below the pylorus）were removed for apoptosis PCR microarray differential gene validation.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group.

肺組織：照射后3 d，模型組Tnfsf10mRNA 較正常對(duì)照組顯著上調(diào)（P＜0.01），模型+rh-Tβ4 組與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異，較模型組顯著下調(diào)（P＜0.05）；其他時(shí)間點(diǎn)各組無(wú)差異；與PCR 芯片結(jié)果一致（圖9B）。

腦組織：照射后3 d，模型組和模型+rh-Tβ4 組Tnfsf10mRNA 表達(dá)較正常對(duì)照組顯著下調(diào)（P＜0.05），模型+rh-Tβ4 組與模型組無(wú)顯著差異，與PCR 芯片結(jié)果不一致。照射后11 d，模型組Tnfsf10mRNA 表達(dá)較正常對(duì)照組顯著上調(diào)（P＜0.05）；模型+rh-Tβ4 組與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異，較模型組顯著下調(diào)（P＜0.05）；與PCR 芯片結(jié)果一致（圖9C）。

2.5.2 Cd40lg

小腸組織：照射后3，7 和11 d，模型組及模型+rh-Tβ4 組Cd40lgmRNA 表達(dá)較正常對(duì)照組顯著下調(diào)（P＜0.01），與PCR芯片結(jié)果不一致（圖10A）。

Fig.10 Effect of rh-Tβ4 on Cd40lg gene expression in small intestine（A），lung（B），and brain（C）tissues of mice after irradiation.See Fig.1 for the mouse treatment.Mice were sacrificed on days 3，7，and 11 after irradiation，and the right brain，right lung，and 1 cm of jejunum（10 cm below the pylorus）were removed for apoptosis PCR microarray differential gene validation.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group.

肺組織：照射后3，7 和11d，模型組及模型+rh-Tβ4 組Cd40lgmRNA 表達(dá)較正常對(duì)照組顯著下調(diào)（P＜0.01），與PCR芯片結(jié)果一致（圖10B）。

腦組織：照射后11 d，模型組Cd40lgmRNA 表達(dá)較正常對(duì)照組顯著下調(diào)（P＜0.05）；模型+rh-Tβ4 組與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異，較模型組顯著上調(diào)（P＜0.05）；其他時(shí)間點(diǎn)各組無(wú)差異；與PCR 芯片結(jié)果一致（圖10C）。

2.5.3 Fasl

小腸組織：照射后3，7 和11 d，模型組和模型+rh-Tβ4 組FaslmRNA 較正常對(duì)照組顯著下調(diào)（P＜0.01），與PCR芯片結(jié)果不一致（圖11A）。

Fig.11 Effect of rh-Tβ4 on Fasl gene expression in small intestine（A），lung（B），and brain（C）tissues of mice after irradiated.See Fig.1 for the mouse treatment.Mice were sacrified on days 3，7，and 11 after irradiation，and the right brain，right lung，and 1 cm of jejunum（10 cm below the pylorus）were removed for apoptosis PCR microarray differential gene validation.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with the normal control group；#P＜0.05，compared with the model group.

肺組織：照射后3 d，模型組FaslmRNA較正常對(duì)照組顯著下調(diào)（P＜0.05）；模型+rh-Tβ4 組與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異，較模型組顯著上調(diào)（P＜0.05）；與PCR芯片結(jié)果一致（圖11B）。

腦組織：照射后3，7和11 d，各組小鼠FaslmRNA表達(dá)無(wú)顯著差異，與PCR 芯片結(jié)果不一致（圖11C）。

3 討論

電離輻射通過(guò)激活炎癥相關(guān)基因和過(guò)度表達(dá)炎癥因子誘導(dǎo)炎癥環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌異常［15］，如TNF-α，IL-1，TGF-β，IFN-γ，G-CSF和IL-6等［15-17］。照射誘導(dǎo)的細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)一步加重多組織放射損傷，因此炎癥細(xì)胞因子也可能成為急性放射性多組織損傷治療的靶點(diǎn)。TNF-α 和TGF-β 屬于Th1 型細(xì)胞因子。TNF-α 是由巨噬-單核細(xì)胞在急性炎癥過(guò)程中產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)過(guò)程［18］。TGF-β 可由機(jī)體多種細(xì)胞分泌［19］。TGF-β 對(duì)于炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)具有兩面性，可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)或起抗炎作用。IL-4和IL-13主要由活化的Th2細(xì)胞產(chǎn)生，能夠刺激活化B 細(xì)胞和T 細(xì)胞增殖，也在調(diào)節(jié)體液免疫和適應(yīng)性免疫中起關(guān)鍵作用［20］。IL-18 是促炎細(xì)胞因子，刺激Th1 細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，炎癥小體及其復(fù)合物激活后導(dǎo)致IL-18 上調(diào)。本研究結(jié)果表明，照射后小鼠小腸、肺和腦組織中TNF-α，IL-18和TGF-β 含量增加，rh-Tβ4 可顯著降低上述組織中TNF-α，IL-18及TGF-β含量；而照射后IL-4和IL-13的含量在小腸、肺和腦中無(wú)明顯變化，rh-Tβ4對(duì)IL-4和IL-13 的含量無(wú)影響。表明電離輻射可誘發(fā)炎癥，導(dǎo)致Th1細(xì)胞和Th2 細(xì)胞分泌失衡［21］；rh-Tβ4能夠調(diào)節(jié)Th1 和Th2 細(xì)胞因子平衡。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，rh-Tβ4可減輕放射導(dǎo)致的多組織炎癥反應(yīng)，其對(duì)促炎細(xì)胞因子的抑制為其減輕炎癥反應(yīng)機(jī)制之一［22-23］。

炎癥細(xì)胞因子水平與炎癥小體相關(guān)，炎癥小體是由多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，能夠調(diào)節(jié)胱天蛋白酶1 的活化，在天然免疫防御過(guò)程中促進(jìn)細(xì)胞因子前體pro-IL-1β 和pro-IL-18 的成熟和分泌，其還調(diào)節(jié)胱天蛋白酶1 依賴的細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞在炎癥和應(yīng)激條件下死亡［24］。有研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3 炎癥小體表達(dá)上調(diào)在輻射損傷中起關(guān)鍵作用［25-28］，且NLRP3 炎癥小體可激活胱天蛋白酶1，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子IL-18 和IL-1β 的釋放［29］。本研究應(yīng)用的炎癥小體PCR 芯片包含84 個(gè)與炎癥小體功能相關(guān)的關(guān)鍵基因，包括編碼炎癥小體成分的基因、參與下游信號(hào)傳導(dǎo)和炎癥小體功能抑制的基因、NOD-樣受體及其下游分子。此外，該芯片還包括其他NLR家族成員。本研究發(fā)現(xiàn)，Tnfsf11和Naip-nlrc4炎癥小體基因表達(dá)下調(diào)，炎癥細(xì)胞因子IL-1β和IL-18基因表達(dá)下調(diào)。提示rh-Tβ4 可能通過(guò)下調(diào)TNF 家族促凋亡因子的表達(dá)及作用于NOD 樣受體進(jìn)而降低炎癥細(xì)胞因子的釋放而抑制炎癥反應(yīng)。該結(jié)果為進(jìn)一步探討rh-Tβ4 作用機(jī)制提供了切入點(diǎn)。PCR芯片反應(yīng)樣本整體的基因表達(dá)變化趨勢(shì)，每一個(gè)基因的變化趨勢(shì)不一定都與RT-qPCR 保持一致。本研究中，部分基因RT-qPCR 驗(yàn)證與PCR 芯片篩選結(jié)果不一致，原因可能為批次和個(gè)體差異、驗(yàn)證的基因可能表達(dá)量低致差異不顯著及2種方法本身存在差異。我們將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)大樣本并對(duì)于篩選獲得的差異基因上下游分子進(jìn)行檢測(cè)，以進(jìn)一步揭示差異基因變化規(guī)律及其作用。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，rh-Tβ4 可抑制照射后小腸上皮細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞凋亡，但機(jī)制尚未闡明。炎癥小體通過(guò)調(diào)控胱天蛋白酶1和胱天蛋白酶5的活化，介導(dǎo)促炎細(xì)胞因子IL-1β，IL-18和TNF-α等上調(diào)［24］，且炎癥小體可調(diào)控胱天蛋白酶1 依賴的程序性細(xì)胞死亡［30］。本研究結(jié)果表明，rh-Tβ4 可顯著降低照射后小鼠多組織中IL-18 和TNF-α 表達(dá)；此外炎癥小體PCR芯片篩選發(fā)現(xiàn)，rh-Tβ4可下調(diào)參與凋亡調(diào)控的Tnfsf11和Bcl2l1的表達(dá)，rh-Tβ4 對(duì)多個(gè)炎癥小體相關(guān)基因具有調(diào)控作用。NLR 活化可激活一系列信號(hào)通路，其中包括NF-κB 和MAPK活化，提示rh-Tβ4 對(duì)凋亡的調(diào)控可能為其作用機(jī)制之一，且與炎癥小體相關(guān)分子可能具有關(guān)聯(lián)性。故本研究進(jìn)一步采用凋亡PCR 芯片從凋亡調(diào)控角度探討rh-Tβ4 的作用機(jī)制。選擇照射后11 d 與炎癥小體PCR芯片一致的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，此時(shí)凋亡并非由電離輻射直接導(dǎo)致，主要考慮從炎癥細(xì)胞因子、炎癥小體相關(guān)分子對(duì)凋亡調(diào)控的角度予以探討。通過(guò)芯片篩選及RT-qPCR 驗(yàn)證，照射后TNF 家族促凋亡因子激活，其中Fasl 和TNFSF10 與相應(yīng)受體結(jié)合后，激活Bcl-2 家族促凋亡因子，TNF 與相應(yīng)受體結(jié)合后繼續(xù)募集胱天蛋白酶8；活化的胱天蛋白酶8可激活Bcl-2家族，通過(guò)線粒體途徑釋放細(xì)胞色素c（cytochrme c，Cytc）；Cytc可活化胱天蛋白酶9，隨后激活胱天蛋白酶3，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。rh-Tβ4 下調(diào)Fasl，Tnfsf10和Tnf基因表達(dá)，上調(diào)Bcl2l1基因表達(dá)，可能為其抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一（圖12）。

Fig.12 An illustration of apoptosis and inflammation pathways regulated by rh-Tβ4 in radiation-induced injury mouse model.rh-Tβ4 downregulates Fas/Tnfsf10，Tnf，RANK（Tnfsf11），NLRC4 and IL-1β which are upregulated by irradiation，meanwhile Bcl-2 downregulated by irradiation is upregulated by rh-Tβ4.IκB：inhibitor of NF-κB；RANK：receptor-activating factor for NF-κB.

綜上所述，本研究在前期研究基礎(chǔ)上探討了rh-Tβ4 治療急性放射損傷的可能機(jī)制，通過(guò)炎癥小體及凋亡RT-qPCR 芯片篩選和炎癥細(xì)胞因子檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)rh-Tβ4 能夠抑制Th1 型反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)Th1 和Th2 免疫平衡；下調(diào)炎癥小體Naip 及NOD-樣受體基因，可能為其減輕電離輻射所致多組織炎癥反應(yīng)機(jī)制之一。此外，rh-Tβ4 通過(guò)上調(diào)抗凋亡基因并下調(diào)促凋亡基因，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。本研究為揭示rh-Tβ4 治療急性放射損傷的機(jī)制提供切入點(diǎn)，后續(xù)深入研究有助于將rh-Tβ4 開(kāi)發(fā)為急性放射損傷治療藥物，并揭示其作用機(jī)制。