張夏茹，趙薪豐，鄭遠靜，劉元林，李雪，王洋，王麗峰，張毅

（1.南華大學衡陽醫(yī)學院軍事醫(yī)學研究院研究生協(xié)作培養(yǎng)單位，湖南 衡陽 421001；2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院輻射醫(yī)學研究所，北京 100850；河北大學 3.化學與材料科學院，4.生命科學學院，河北 保定 071000）

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一類具有多向分化潛能的成體干細胞，在再生醫(yī)學中具有廣闊的應用前景。MSC具有向脂肪細胞、骨細胞和軟骨細胞等多種細胞分化的功能［1］。研究表明，轉錄因子在調控MSC 向不同細胞分化過程中起重要作用，激活轉錄因子可調節(jié)特定細胞分化基因的表達［2］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）作為MSC 向脂肪細胞分化的主要調節(jié)因子，其在脂肪形成過程中發(fā)揮重要作用。PPARγ以PPARγ1和PPARγ2 2 種形式的異構體存在，后者主要在脂肪組織中表達［3］。當PPARγ 被敲除后，脂肪將無法形成，且所有的前體成脂細胞信號通路均與PPARγ相關［4］。目前MSC向成脂細胞分化的作用機制尚不清楚，MSC多向分化調控作用的研究成為目前研究的熱點。

本課題組前期通過單細胞測序發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）激活的人臍帶來源MSC（stimulated- human umbilical cord-derived MSCs，S-HuMSC）基因表達與正常HuMSC 存在顯著差異，其中白細胞介素32（interleukin-32，IL-32）在S-HuMSC 中的表達顯著升高［5］。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，IL-32可參與調節(jié)MSC 的多向分化。IL-32又稱自然殺傷細胞轉錄物4，是一種分泌性蛋白，由T 淋巴細胞、自然殺傷細胞、上皮細胞、單核細胞和成纖維樣滑膜細胞分泌［6］。IL-32 作為一種炎癥細胞因子，可通過激活NF-κB 和p38 絲裂原活化蛋白激酶誘導多種細胞因子的產(chǎn)生，如TNF-α，IL-1β，IL-6 和IL-8 等［7］。有研究報道，與高脂飲食的野生型小鼠相比，高脂飲食的IL-32β轉基因小鼠肝脂質蓄積減少，肝組織PPARγ 表達下調［8］。由此提示，IL-32 對脂肪細胞分化過程可能具有一定的調控作用。本研究利用過表達IL-32的慢病毒轉染HuMSC，檢測IL-32對HuMSC成脂分化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

HuMSC 為軍事醫(yī)學研究院輻射醫(yī)學研究所凍存細胞。胎牛血清、α-MEM 培養(yǎng)基和0.25%胰酶，美國Thermo Fisher 公司；APC-抗人CD14、APC-抗人CD34、APC-抗人CD45、PE-抗人CD73、PE-抗人CD90 和PE-抗人CD105，美國eBioscience公司；含過表達IL-32基因序列或陰性對照（negative control，NC）序列且?guī)в芯G色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）及嘌呤霉素抗藥基因的慢病毒載體（簡稱為穩(wěn)定表達IL-32 慢病毒載體和NC 空載體）由吉凱基因生物工程有限公司構建；成脂分化相關轉錄因子PPARγ、CCAAT 增強子結合蛋白α（CCAAT enhancer binding protein α，C/EBPα）和脂肪酶（adiponectin，ADI），成骨分化相關轉錄因子Runt 相關轉錄因子2（RUNX family transcription factor 2，RUNX2）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和無遠側同源盒5（distalless homeobox 5，DLX5），IL-32及GAPDH引物（表1），上海生工生物工程股份有限公司合成；TNF-α、IFN-γ、嘌呤霉素鹽酸鹽、吲哚美辛、地塞米松、油紅O 粉、胰島素、維生素C 磷酸鹽、β-磷酸甘油、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）和Trizol 試劑，美國Sigma 公司；ALP 染液，上海碧云天生物技術有限公司；M-MLV、RNA 酶抑制劑、5×M-MLV 緩沖液、Oligo dT 和隨機引物，日本Takara 公司；dNTP 和DTT，康為世紀有限公司；細胞恒溫培養(yǎng)箱（CLM-170B-8-NF），新加坡藝思高科技有限公司；核酸定量儀（ND life-5463）、實時熒光定量PCR儀（A40425）、PCR擴增儀（4382286）和低溫高速離心機（Heraeus Fresco 21），美國Thermo Fisher 公司；倒置顯微鏡（CKX53SF-R）和熒光顯微鏡（CKX53），日本Olympus 公司；流式細胞儀（Accuri C6 Plus），美國Becton Dickinson公司。

Tab.1 Primer sequences for real-time quantitative PCR（RT-qPCR）

1.2 HuMSC培養(yǎng)和激活

復蘇HuMSC 并接種于T75 細胞培養(yǎng)瓶，α-MEM 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)。待細胞融合度達約80%棄原培養(yǎng)基，PBS 潤洗2 次；用0.125%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，150×g離心5 min，HuMSC 沉淀用α-MEM 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）重懸。取部分HuMSC接種于新的T75培養(yǎng)瓶中，用TNF-α（20 μg·L-1）和IFN-γ（20 μg·L-1）孵育24 h，得到S-HuMSC。倒置顯微鏡下觀察HuMSC和S-HuMSC形態(tài)并拍照。

1.3 HuMSC和S-HuMSC表型鑒定

HuMSC和S-HuMSC分別用1.4 mL PBS重懸，細胞密度為1×109L 分別分裝于7 個EP 管（6 個流式抗體管，1個細胞對照管）中，每管200 μL。除細胞對照管外，其余6 管分別加入相應抗體（APC-抗人CD14、APC-抗人CD34、APC-抗人CD45、PE-抗人CD73、PE-抗人CD90和PE-抗人CD105），每管1 μL，混勻；避光孵育30 min，每管加入PBS 800 μL 混勻，離心（150×g，5 min）；每管加入PBS 200 μL 重懸，于流式細胞儀檢測HuMSC和S-HuMSC表型。

1.4 HuMSC和S-HuMSC成骨和成脂誘導分化

將HuMSC和S-HuMSC分別接種于六孔板中，每孔5×104細胞，進行成骨和成脂誘導分化，同時設自分化對照組（含10%胎牛血清的α-MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）。成骨分化誘導液含10%胎牛血清、地塞米松0.1 μmol·L-1、維生素C磷酸鹽50 μmol·L-1和β-磷酸甘油10 mmol·L-1；成脂分化誘導液含10%胎牛血清、地塞米松1 μmol·L-1、胰島素10 μg·L-1、IBMX 0.5 mmol·L-1和吲哚美辛0.5 mmol·L-1；每隔2 d換液1次。成骨分化誘導14 d，ALP 染色后用ImageJ軟件分析檢測ALP 染色面積，并收集各組細胞提取總RNA，實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測成骨相關轉錄因子RUNX2，ALP和DLX5mRNA表達，測定HuMSC 和S-HuMSC成骨誘導分化能力。成脂分化誘導10 d，進行油紅O染色后用ImageJ軟件分析檢測脂滴形成面積，并收集各組細胞提取總RNA，RT-qPCR 檢測成脂相關轉錄因子PPARγ，C/EBPα和ADI mRNA表達，測定HuMSC 和S-HuMSC 成脂誘導分化能力。

1.5 利用慢病毒載體構建穩(wěn)定過表達lL-32 的HuMSC（lL-32highHuMSC）

將生長狀態(tài)良好的P3代HuMSC按每孔1×105接種于六孔板內，分為HuMSC，NC-HuMSC 和IL-32highHuMSC 組。NC-HuMSC 和IL-32highHuMSC組分別感染NC 空載體和穩(wěn)定表達IL-32 慢病毒載體，感染病毒載量均為1×1010L-1，復感染指數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=10；HuMSC 組未加慢病毒懸液。轉染24 h 后，各組棄原培養(yǎng)基，更換為新的α-MEM 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）。轉染48 h 后進行嘌呤霉素抗藥基因篩選，嘌呤霉素終濃度為2 mmol·L-1。篩選72 h，待HuMSC 組無存活細胞，NC-HuMSC 和IL-32highHuMSC組更換為不含嘌呤霉素的α-MEM 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)并擴增，同時另取同批次的HuMSC 繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞融合度達約80%時，熒光顯微鏡下觀察各組細胞GFP 表達，并收取各組細胞用流式細胞儀測定GFP熒光強度計算轉染效率。同時收集各組細胞分別提取總RNA，RT-qPCR 檢測細胞IL-32mRNA 表達，鑒定IL-32highHuMSC是否穩(wěn)定過表達IL-32。

1.6 lL-32highHuMSC 和NC-HuMSC 培養(yǎng)擴增及形態(tài)和表型鑒定

同1.2 和1.3 對NC-HuMSC 和IL-32highHuMSC進行培養(yǎng)擴增，并對其形態(tài)和細胞表型進行鑒定。

1.7 lL-32highHuMSC 和NC-HuMSC 成脂分化能力測定

分別將HuMSC，NC-HuMSC 和IL-32highHuMSC同1.4 進行成脂誘導分化，分別于誘導后第0，3，5，7，10 和14 天進行油紅O 染色，并用ImageJ 軟件分析脂滴形成面積；同時收集各組細胞并提取總RNA，RT-qPCR 檢測成脂相關轉錄因子PPARγ，C/EBPα和ADImRNA 表達，測定NC-HuMSC 和IL-32highHuMSC成脂分化能力。

1.8 RT-qPCR檢測成骨和成脂相關轉錄因子及IL-32 mRNA表達

取1.4 和1.7 提取的細胞總RNA，測定RNA 濃度，逆轉錄合成cDNA，程序為：70 ℃，10 min；42 ℃，1 h；70 ℃，15 min。隨后以cDNA 為模板進行PCR，檢測成骨相關轉錄因子RUNX2，ALP和DLX5及成脂相關轉錄因子PPARγ，C/EBPα和ADI或IL-32mRNA 表達水平。RT-qPCR 反應體系（20 μL）：上下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，ddH2O 8.0 μL，cDNA 1.0 μL，2×MltraSYRP 混合物10.0 μL。反應條件：95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，共40 個循環(huán)；95 ℃15 s。以GAPDH為內參基因，采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達水平。

1.9 統(tǒng)計學分析

實驗結果數(shù)據(jù)以±s表示，使用GraphPad Prism 9 軟件進行統(tǒng)計學分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05 認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HuMSC和S-HuMSC形態(tài)和表型鑒定

倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的HuMSC 和S-HuMSC 均呈長梭形、漩渦狀、貼壁生長（圖1）。流式細胞術檢測結果表明，HuMSC 和S-HuMSC 均高表達CD73，CD90 和CD105，不表達或低表達CD14，CD34 和CD45（圖2），提示HuMSC 和S-HuMSC符合MSC的生物學特征。

Fig.1 Morphology of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells（HuMSCs）and stimulated HuMSCs（S-HuMSCs）.S-HuMSCs were the HuMSCs activated by tumor necrosis factor-α 20 μg·L-1 and interferon-γ 20 μg·L-1 for 24 h.Both HuMSCs and S-HuMSCs showed spindleshaped growth under an inverted microscope.

Fig.2 Cellular phenotypes of HuMSCs（A）and S-HuMSCs（B）detected by flow cytometry.See Fig.1 for the cell treatment.Both HuMSCs and S-HuMSCs positively expressed CD73，CD90 and CD105，and negatively expressed CD14，CD34 and CD45.

2.2 HuMSC 和S-HuMSC 成骨和成脂誘導分化能力鑒定

HuMSC 和S-HuMSC 成骨誘導分化14 d，ALP染色結果顯示，誘導組細胞ALP 染色面積明顯大于各自自分化對照組（P＜0.01，圖3A）。RT-qPCR 結果顯示，HuMSC 和S-HuMSC 誘導組成骨分化相關轉錄因子Runx2，ALP和DLX5mRNA 表達亦顯著高于各自自分化對照組（P＜0.01，圖3B）。由此表明，HuMSC和S-HuMSC均具有成骨分化能力。

Fig.3 Osteogenic differentiation abilities of HuMSCs and S-HuMSCs.A：alkaline phosphatase（ALP）staining area of HuMSCs and S-HuMSCs after 14 d of osteogenic induction，A2 was the semi-quantitative result of A1.B：the mRNA expressions of osteogenesis-related transcription factors.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with the corresponding self-differentiated control group.

HuMSC和S-HuMSC成脂誘導分化10 d，油紅O 染色可見，誘導組脂滴形成面積明顯多于各自自分化對照組（P＜0.01，圖4A）。RT-qPCR 結果顯示，HuMSC 和S-HuMSC 誘導組成脂分化相關轉錄因子PPARγ，C/EBPα和ADImRNA 表達亦顯著高于各自自分化對照組（P＜0.01，圖4B）。由此表明，HuMSC和S-HuMSC均具有成脂分化能力。

Fig.4 Adipogenic differentiation abilities of HuMSCs and S-HuMSCs.A：oil red O staining area of HuMSCs and S-HuMSCs after 10 d of adipogenic induction，A2 was the semi-quantitative result of A1.B：the mRNA expressions of adipogenic transcription factors.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with the corresponding self-differentiated control group.

2.3 S-HuMSC與HuMSC成脂誘導分化能力和lL-32表達水平的比較

HuMSC 和S-HuMSC 成脂誘導分化10 d 后，油紅O 染色結果表明，S-HuMSC 誘導組細胞脂滴形成面積明顯小于HuMSC 誘導組（P＜0.01，圖5A）；RT-qPCR 結果表明，S-HuMSC 誘導組成脂分化相關轉錄因子PPARγ，C/EBPα和ADImRNA 表達亦低于HuMSC 誘導組（P＜0.05，圖5B），提示S-HuMSC 成脂分化能力較HuMSC 顯著降低。RT-qPCR測定IL-32mRNA表達結果表明，S-HuMSC中IL-32mRNA 表達顯著高于HuMSC（P＜0.01，圖5C）。

Fig.5 Comparison of adipogenic differentiation ability and IL-32 mRNA expression levels between HuMSCs and S-HuMSCs after 10 d of adipogenic induction.A：oil red O staining area，A2 was the semi-quantitative result of A1.B：the mRNA expressions of adipogenic transcription factors by RT-qPCR.C：IL-32 mRNA expression by RT-qPCR.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with HuMSC group.

2.4 慢病毒感染HuMSC 的效率和lL-32highHuMSC中IL-32 mRNA表達水平

熒光顯微鏡下可見，與HuMSC相比，NC-HuMSC和IL-32highHuMSC均出現(xiàn)大量綠色熒光（圖6A）。流式細胞術檢測轉染效率結果顯示，NC-HuMSC和IL-32highHuMSC 轉染效率均＞90%（圖6B）。RT-qPCR檢測結果表明，NC-HuMSC中IL-32mRNA表達與HuMSC 比較無明顯變化，IL-32highHuMSC中IL-32mRNA表達顯著高于HuMSC和NC-HuMSC（P＜0.01）（圖6C）。以上結果提示，過表達IL-32 的慢病毒可高效感染HuMSC，且IL-32highHuMSC 可穩(wěn)定高表達IL-32。

Fig.6 Efficiency of lentivirus infection of HuMSCs and expression of IL-32 mRNA in lL-32highHuMSCs.The lentiviral vector containing the over-expression of IL-32 gene sequence with green fluorescent protein（GFP）and puromycin resistance genes（lentiviral vector with IL-32 over-expression）and the negative control（NC）lentiviral vector were constructed before the lentiviruses were harvested.HuMSCs were infected with the lentiviral vector with IL-32 over-expression and NC lentiviral vector，respectively，to obtain IL-32highHuMSCs and NC-HuMSCs.HuMSCs untransfected control group was set up at the same time.A：morphology of the cells under an inverted microscope and GFP expression under a fluorescence microscope；B：transfection efficiency calculated by capturing GFP fluorescence intensity by flow cytometry；C：IL-32 mRNA expression detected by RT-qPCR.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with HuMSC group；##P＜0.01，compared with NC-HuMSC group.

2.5 lL-32highHuMSC細胞表型鑒定

流式細胞術檢測結果顯示，HuMSC，NC-HuMSC和IL-32highHuMSC均高表達CD73，CD90和CD105，不表達或低表達CD14，CD34 和CD45（圖7），提示IL-32highHuMSC表型未發(fā)生改變，符合MSC表型特征。

Fig.7 ldentification of phenotypes of lL-32high HuMSCs by flow cytometry.See Fig.6 for the cell treatment.HuMSCs（A），NC-HuMSCs（B）and IL-32highHuMSCs（C）highly expressed CD73，CD90 and CD105，while CD14，CD34 and CD45 were negatively or lowly expressed.

2.6 過表達lL-32抑制HuMSC成脂分化

將HuMSC，NC-HuMSC 和IL-32highHuMSC 進行成脂誘導分化，誘導后第0，3，5，7，10和14天，三者脂滴形成面積隨時間均呈增加趨勢。但從誘導后第3 天開始，IL-32highHuMSC 與HuMSC 和NC-HuMSC 相比，其脂滴形成面積均明顯減少（P＜0.01，圖8A）。RT-qPCR 檢測結果表明，從成脂誘導后第3 天開始，與HuMSC 和NC-HuMSC 相比，IL-32highHuMSC 成脂相關轉錄因子PPARγ，C/EBPα和ADImRNA 表達均顯著降低（P＜0.05，圖8B）。以上結果提示，過表達IL-32 對HuMSC 成脂分化具有抑制作用。

Fig.8 Over-expression of lL-32 on adipogenic differentiation ability of HuMSCs.HuMSCs，NC-HuMSCs and IL-32highHuMSCs were adipogenic induction and their adipogenic differentiation abilities were determined on the 0，3，5，7，10，and 14 days after induction.A：oil red O staining area，A2 was the semi-quantitative result of A1.B：mRNA expressions of adipogenic transcription factors by RT-qPCR.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with HuMSC group；##P＜0.01，compared with NC-HuMSC group.

3 討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，全球成年人肥胖（身體質量指數(shù)＞30 kg·m-2）率近年來呈持續(xù)上升態(tài)勢。異位脂質的沉積與胰島素抵抗［9］、2 型糖尿?。?0］和非酒精性脂肪性肝?。?1］的發(fā)生密切相關。因此，調節(jié)脂肪生成對治療脂肪代謝失衡相關疾病尤為重要。MSC 是成骨細胞和脂肪細胞的共同祖細胞，需嚴格調控其分化，以維持成骨和成脂的分化平衡。與年齡、絕經(jīng)后和慢性疾病相關的多種骨質疏松性骨丟失疾病的特征是骨髓脂肪生成增加和骨形成減少［12］。MSC 向成骨細胞和脂肪細胞分化需要重要的信號通路，包括轉化生長因子β/骨形態(tài)發(fā)生蛋白、Wnt 和Hedgehog 信號以及特異性轉錄因子如RUNX2 和PPARγ 等［13］，其中PPARγ 在脂肪形成過程中發(fā)揮重要作用。在脂肪形成過程中，MSC表達轉錄因子鋅指蛋白423，參與前脂肪細胞形成，并產(chǎn)生調節(jié)因子PPARγ和轉錄共激活因子C/EBPα/β 從而進一步促進其分化和成熟［14］。研究報道，IL-32共含有8 個外顯子，組合構成不同的IL-32剪接異構體；IL-32 亞型有9 種，其中最常見的為IL-32α，IL-32β和IL-32γ［15］，其中IL-32β可通過抑制PPARγ表達和AMP依賴的蛋白激酶活化而減少脂質累積［8］。但它們之間的聯(lián)系錯綜復雜，影響因素也很多，MSC成脂機制尚需進一步研究。

本研究首先對S-HuMSC 和HuMSC 進行成脂誘導分化。結果表明，S-HuMSC 脂滴形成面積明顯小于HuMSC，且成脂相關轉錄因子PPARγ，C/EBPα和ADImRNA表達亦明顯低于HuMSC，提示S-HuMSC 成脂能力降低；但S-HuMSC 中IL-32mRNA表達顯著升高。由此推測，IL-32對脂肪細胞形成具有一定的調控作用。

隨后，用本研究構建的穩(wěn)定過表達IL-32 的慢病毒載體轉染HuMSC，獲得IL-32highHuMSC，進一步驗證IL-32 是否參與MSC 成脂分化過程。首先檢測IL-32highHuMSC 是否保持MSC 的生物學特性。結果表明，IL-32highHuMSC細胞形態(tài)仍為成纖維樣貼壁生長，高表達CD73，CD90 和CD105，低表達或不表達CD14，CD34 和CD45，且仍具有成脂分化能力，表明IL-32highHuMSC 具有MSC 的生物學特性。進一步研究結果表明，隨成脂誘導時間延長，IL-32highHuMSC 脂滴形成面積與HuMSC 和NC-HuMSC相比明顯減少；而且從成脂誘導分化后第3 天開始，IL-32highHuMSC 成脂相關轉錄因子PPARγ，C/EBPα和ADImRNA 表達與HuMSC 和NC-HuMSC 相比亦顯著降低。由此提示，IL-32 參與調控HuMSC 的成脂分化，且過表達IL-32 對HuMSC的成脂分化具有抑制作用。

綜上所述，IL-32 在MSC 成脂分化中發(fā)揮重要作用。隨對其具體調控機制的深入研究，其有可能作為調控MSC 成脂分化的有效靶點，為脂肪代謝失衡相關疾病的精準治療提供新思路。