王福旗，田京偉，張樹卓，蘇瑞斌

（1.煙臺大學藥學院，山東 煙臺 264005；2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，國家安全特需藥品全國重點實驗室，神經(jīng)精神藥理學北京市重點實驗室，北京 100850）

致幻劑是一類天然或人工合成的精神活性物質(zhì)，可影響人的情緒和感覺，使人在時間和空間上產(chǎn)生錯覺和幻覺，導致自我歪曲、妄想和思維分裂。經(jīng)典致幻劑的化學結(jié)構(gòu)主要有3 類，即以N，N-二甲基色胺（N，N-dimethyltryptamine）為代表的色胺類、以麥角酸二乙胺（lysergic acid diethylamide）為代表的麥角堿類和以2，5-二甲氧基-4-碘苯丙胺（2，5-dimethoxy-4-iodoamphetamine，DOI）為代表的苯乙胺類。DOI 作為5-羥色胺2A 受體（5-hydroxytryptamine 2A receptor，5-HT2AR）激動劑被廣泛用于構(gòu)建幻覺模型，其引起的藥物辨別反應、神經(jīng)化學和電生理效應均可被選擇性5-HT2AR拮抗劑氟利色林（volinanserin）所阻斷［1］。

5-HT2AR 對調(diào)節(jié)皮質(zhì)功能和認知起關(guān)鍵作用。目前普遍認為DOI 引起的生理效應和意識狀態(tài)的改變主要是其與5-HT2AR 相互作用產(chǎn)生的［2-3］，而且非臨床和臨床研究均表明，5-HT2AR 的激活是產(chǎn)生幻覺的必要條件［4］。5-HT2AR 在腦內(nèi)分布不均一且廣泛。受體放射自顯影實驗結(jié)果顯示，5-HT2AR 在海馬、丘腦核、新皮質(zhì)和中腦均有分布，其中在新皮質(zhì)區(qū)域分布最為密集［5］。5-HT2AR 在視覺皮質(zhì)中高度表達，可能參與介導神經(jīng)退行性疾病如精神分裂癥和帕金森病等的幻覺癥狀的產(chǎn)生［6］。唯一已知能減輕精神分裂癥患者幻覺癥狀的藥物是抗精神分裂藥，典型的抗精神分裂藥如奧氮平和氯氮平等均能對抗幻覺癥狀［7］，而且均對5-HT2AR 產(chǎn)生拮抗作用，提示幻覺癥狀的產(chǎn)生可能與5-HT2AR有關(guān)。

大腦包含不同的神經(jīng)網(wǎng)絡和區(qū)域，這些神經(jīng)網(wǎng)絡與大腦區(qū)域之間相互協(xié)調(diào)，產(chǎn)生更高的認知功能和執(zhí)行功能。知覺來自丘腦皮質(zhì)系統(tǒng)中的γ振蕩的內(nèi)在自組織，在喚醒機制、注意力機制和傳入感覺輸入的調(diào)節(jié)下形成連貫的集合，當產(chǎn)生幻覺時連貫的集合被打破，γ 振蕩受到影響［8］?；糜X的產(chǎn)生也是神經(jīng)網(wǎng)絡和大腦區(qū)域之間的協(xié)調(diào)活動出現(xiàn)紊亂的結(jié)果。這些同步活動反映在振蕩活動中，而大腦振蕩可以通過腦電圖（electroencephalography，EEG）記錄的大腦不同頻率的腦電波來評估。大腦中的腦電波主要有5種波形，分別是δ波（1～4 Hz）、θ波（4～7 Hz）、α 波（8～12 Hz）、β 波（12～30 Hz）和γ 波（30～80 Hz），這些腦電信號從低頻的δ 波到高頻的γ振蕩，均是神經(jīng)元放電產(chǎn)生的結(jié)果，反映大腦的活動情況。γ 振蕩參與多種認知過程，如感覺、注意力、學習和記憶等，其振幅由低頻θ 振蕩的相位調(diào)制。視覺系統(tǒng)是人類和其他動物中非常重要的感知系統(tǒng)之一。初級視覺皮質(zhì)是視覺系統(tǒng)中接收外部世界視覺信息的第一個皮質(zhì)區(qū)域，對視覺系統(tǒng)感受到的信息進行整合和處理，處理的信息傳遞到高階視覺區(qū)域進一步處理［9］。有研究表明，當健康受試者在外界的視覺刺激下產(chǎn)生視覺錯覺時，初級視覺皮質(zhì)γ 振蕩功率升高［10］。次級視覺皮質(zhì)與初級視覺皮質(zhì)相鄰，在視覺意識形成之前的加工階段具有重要地位，視覺信息只有經(jīng)過次級視覺皮質(zhì)處理后才能傳遞到更高的視覺區(qū)域從而形成意識［11］。研究表明，致幻劑5-甲氧基-N，N-二甲基色胺增加初級視覺皮質(zhì)V1 區(qū)的δ振蕩功率，導致視覺丘腦皮質(zhì)神經(jīng)網(wǎng)絡的異常活動［12］。另外，DOI 影響不同腦區(qū)的γ 振蕩，如在前額葉皮質(zhì)（medial prefrontal cortex，mPFC）可降低γ 振蕩的功率［13］，在伏隔核（nucleus accumbens，NAC）可降低高頻γ 振蕩（60～70 Hz）的功率［14］。DOI 主要引起視幻，其是否影響次級視覺皮質(zhì)V2區(qū)場電位的變化尚未見報道。

幻覺是指在無相應的客觀刺激時所出現(xiàn)的知覺體驗，一些神經(jīng)退行性疾病（如精神分裂癥和帕金森病等）均伴隨幻覺的產(chǎn)生，但幻覺產(chǎn)生的機制尚不清楚。以DOI 為藥物模型研究致幻劑對次級視覺皮質(zhì)V2區(qū)γ振蕩的影響，可能為改善退行性神經(jīng)疾病伴隨的幻覺癥狀提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品、試劑和儀器

雄性C57BL/6J 小鼠，SPF 級，體重22～25 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK（京）2019-0008。所有小鼠在25 ℃環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，12 h/12 h 明暗周期晝夜交替，自由進食飲水。實驗動物的使用遵守軍事科學院軍事醫(yī)學研究院實驗動物管理細則（動物倫理學審查編號：IACUC-DWZX-2023-P519）。

DOI（批號：B5321；HPLC 純度≥98%），美國APExBIO 公司。氟利色林（批號：T5389；HPLC 純度≥98%），美國TargetMol 公司；戊巴比妥鈉，國藥集團化學試劑有限公司；義齒基托樹脂（粉），賀利氏古莎齒科有限公司；義齒基托樹脂（液），上海新世紀齒科材料有限公司；牙科用粘接劑，北京永軒科技有限公司；異氟烷、體式顯微鏡（77001）、腦立體定位儀（68018）、單孔鹵素冷光源（76301）、氣體麻醉機（R50）和精細鑷子，深圳瑞沃德生命科技有限公司；螺絲刀、0.3 mm 顱骨鉆、螺絲和標準16 道小鼠孔型ECOG電極，蘇州桃花島生物科技有限公司；Plexon 生物信號記錄系統(tǒng)（DHP），美國Plexon公司。

1.2 小鼠電極安裝術(shù)

用戊巴比妥鈉（100 mg·kg-1，ip）麻醉小鼠并固定在腦立體定位儀上，充分暴露顱骨。以前鹵（bregma）（AP：0 mm；ML：0 mm）為坐標零點標記電極位置，分別安裝測量電極（次級視覺皮質(zhì)V2區(qū)）（AP：-2.5 mm；ML：-1.9 mm）（圖1A）、參考電極（AP：-6.8 mm；ML：-2.3 mm）和接地電極（AP：-6.8 mm；ML：2.3 mm），用牙科水泥進行封固。最后，傷口周圍涂抹碘伏，放回籠中單籠飼養(yǎng)。

Fig.1 Schematic of electrocorticography（ECOG）electrode recording.A：schematic representation of the locations of the anterior halo，area V2 of the secondary visual cortex，the reference（REF）electrode and the ground（GND）electrode.B：diagram of the ECOG recording.

1.3 局部場電位（local field potential，LFP）信號采集和數(shù)據(jù)分析

手術(shù)7 d 后，將小鼠轉(zhuǎn)移至實驗室環(huán)境飼養(yǎng)3 d，并每天在記錄箱內(nèi)適應30～40 min。正式開始記錄時，小鼠稱重并使用2%異氟烷進行麻醉，插上信號放大器后（圖1B）放入記錄箱中恢復自由活動并適應環(huán)境30～40 min。用Plexon DHP 系統(tǒng)記錄電生理信號，然后以1 kHz 的采樣頻率采集LFP 信號。采用連接地線和覆蓋銅網(wǎng)等方式排除信號采集系統(tǒng)噪音干擾。

待記錄信號平穩(wěn)后，ip 給予小鼠1% DMSO（溶劑），待信號穩(wěn)定后記錄30 min；待1%DMSO記錄完成后ip 給予小鼠DOI 2.0 mg·kg-1，注射完畢5 min后開始記錄30 min。待DOI 2.0 mg·kg-1記錄完成后ip給予小鼠5-HT2AR拮抗劑氟利色林0.3 mg·kg-1，注射完畢5 min后開始記錄30 min。

LFP 數(shù)據(jù)導入Neuro Explorer 軟件，在分析之前使用濾波功能對原始數(shù)據(jù)進行4～7 Hz和30～80 Hz的濾波，濾除4～7 Hz 和30～80 Hz 以外的波段頻率。使用Power Spectrafor Continuous功能分析功率譜，并繪制頻譜圖；將功率譜數(shù)據(jù)導入GraphPad Prism8.0.2 軟件，分析4～7 Hz 和30～80 Hz 的總功率并進行統(tǒng)計。使用Matlab軟件分析θ振蕩和γ振蕩的相位振幅耦合［15］。分別對θ振蕩和γ 振蕩的功率譜密度和相位振幅耦合調(diào)制指數(shù)（modulation index，MI）進行統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，使用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行統(tǒng)計學分析，采用配對t檢驗分析給藥前后LFP 功率變化。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DOl 增強小鼠次級視覺皮質(zhì)V2 區(qū)γ 振蕩功率且能被氟利色林逆轉(zhuǎn)

熱圖（圖2A）和頻譜分析（圖2B）顯示，給予DOI 2.0 mg·kg-1后小鼠次級視覺皮質(zhì)V2 區(qū)γ 振蕩的功率譜升高，給予5-HT2AR 拮抗劑氟利色林0.3 mg·kg-1后下降。統(tǒng)計LFP在30～80 Hz的總功率結(jié)果（圖2C）顯示，給予DOI 2.0 mg·kg-1后總功率較給予DOI前（溶劑組）顯著升高（P＜0.05），給予5-HT2AR 拮抗劑氟利色林0.3 mg·kg-1后總功率較給氟利色林前（DOI 組）顯著下降（P＜0.05），表明DOI 可增強小鼠次級視覺皮質(zhì)V2 區(qū)γ 振蕩功率且能被氟利色林逆轉(zhuǎn)。

Fig.2 2，5-Dimethoxy-4-iodoamphetamine（DOl）enhances power of γ oscillations in area V2 of mouse secondary visual cortex and can be reversed by volinanserin.Mice were ip given vehicle（1% DMSO），and recording was made for 30 min after the signals were stabilized；after 30 min，the mice continued to be injected with DOI（2.0 mg·kg-1，ip），and recording lasted for 30 min 5 min after injection.The 5-HT2AR antagonist volinanserin（0.3 mg·kg-1）was ip given after the DOI（2.0 mg·kg-1）recording was completed，and recording lasted for 30 min 5 min after injection.A：spectrograms of local field potential（LFP）recording in area V2 of mouse secondary visual cortex.B：schematic representation of the changes in the power spectral density（PSD）of γ oscillations in area V2 of the parafoveal cortex after being ip given the solvent，DOI（2.0 mg·kg-1）and volinanserin（0.3 mg·kg-1）.C：the quantitative result from B.±s，n=6.＊P＜0.05，compared with vehicle group；#P＜0.05，compared with DOI group.

2.2 DOl 增強小鼠次級視覺皮質(zhì)V2 區(qū)θ 振蕩功率且能被氟利色林逆轉(zhuǎn)

熱圖（圖3A）和頻譜分析（圖3B）顯示，給予DOI 2.0 mg·kg-1后小鼠次級視覺皮質(zhì)V2 區(qū)θ 振蕩的功率譜升高，給予氟利色林0.3 mg·kg-1后θ 振蕩的功率譜下降。統(tǒng)計LFP 在4～7 Hz 的總功率結(jié)果（圖3C）顯示，給予DOI 2.0 mg·kg-1后總功率較給DOI前顯著升高（P＜0.05），給予氟利色林0.3 mg·kg-1后總功率較給予DOI 時顯著下降（P＜0.05）。表明DOI 可以增強小鼠次級視覺皮質(zhì)V2 區(qū)θ 振蕩功率且能被氟利色林逆轉(zhuǎn)。

Fig.3 DOl enhances θ oscillatory power in area V2 of mouse secondary visual cortex and can be reversed by volinanserin.See Fig.2 for the treatment.A：spectrograms of LFP recording in area V2 of mouse secondary visual cortex.B：schematic representation of the changes in PSD of γ a oscillations in area V2 of the parafoveal cortex after being ip given the vehicle，DOI（2.0 mg·kg-1）and volinanserin（0.3 mg·kg-1）.C：the quantitative result from B.x ±s，n=6.＊P＜0.05，compared with vehicle group；#P＜0.05，compared with DOI group.

2.3 DOl對θ振蕩和γ振蕩相位振幅耦合的影響

θ 振蕩和γ 振蕩的相位振幅耦合MI 統(tǒng)計分析結(jié)果（圖4）顯示，與溶劑組相比，DOI 2.0 mg·kg-1組θ 振蕩和γ 振蕩相位振幅耦合MI 顯著降低（P＜0.01）。

Fig.4 DOl reduces phase-amplitude coupling of θ and γ oscillations.See Fig.2 for the treatment.A：the mean γ amplitude per θ phase averaged under control conditions（vehicle，A1），following DOI application（30 min，A2）.B：the quantitative result from A.±s，n=14.＊＊P＜0.01，compared with vehicle group.

3 討論

致幻劑作為一種精神活性物質(zhì)，由于其能改變?nèi)祟惖恼J知，長久以來備受關(guān)注。文獻報道，致幻劑產(chǎn)生幻覺效應的原因可能與5-HT2AR 激活有關(guān)［16］。5-HT2AR 在視覺皮質(zhì)高表達［6］。研究發(fā)現(xiàn)，通過對人類大腦枕頂顳葉皮質(zhì)進行電刺激可引起視覺幻覺［17］。枕頂顳葉皮質(zhì)上包含初級視覺皮質(zhì)和視覺聯(lián)合區(qū)，具有視覺記憶的功能，提示視覺皮質(zhì)可能參與幻覺的形成。幻覺是精神類疾病的主要癥狀之一。Huot等［18］研究表明，帕金森病患者產(chǎn)生幻覺時視覺皮質(zhì)中5-HT2AR 的密度發(fā)生了改變。異常的振蕩活動可能與精神類疾病的核心癥狀有關(guān)，如幻覺和思維障礙等。相較于沒有幻覺的患者，有幻覺的精神分裂癥患者在視覺感覺處理中高頻活動更多［19］。故本研究以次級視覺皮質(zhì)V2 區(qū)為目標腦區(qū)，通過觀察神經(jīng)振蕩以及相位耦合的變化對DOI的致幻作用進行研究。

本研究結(jié)果顯示，DOI可增加次級視覺皮質(zhì)V2區(qū)γ 振蕩的功率，氟利色林可以逆轉(zhuǎn)DOI 的作用。γ 振蕩是高頻神經(jīng)振蕩，γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能中間神經(jīng)元參與γ 振蕩的產(chǎn)生。當錐體神經(jīng)元興奮時，通過谷氨酸等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，使GABA 能中間神經(jīng)元興奮，后者通過縫隙連接和GABA突觸形成一個產(chǎn)生γ節(jié)律性的中間神經(jīng)元網(wǎng)絡，并使錐體神經(jīng)元也受到γ節(jié)律的調(diào)節(jié)，進而形成新一輪的γ 振蕩［20］。大腦皮質(zhì)上分布著大量的錐體神經(jīng)元，5-HT2AR 激動劑激活5-HT2AR，誘導錐體神經(jīng)元的興奮性突觸后電流增加［4，21-22］，通過給予5-HT2AR 拮抗劑可消除該效應［23］。因此，DOI 可能是通過激活次級視覺皮質(zhì)V2 區(qū)上的5-HT2AR，進而激活GABA 能中間神經(jīng)元，導致γ 振蕩功率增加。

θ 振蕩是一種低頻神經(jīng)振蕩，在大腦的多個部位都有發(fā)現(xiàn)。有文獻報道，θ 振蕩在空間上與視覺誘導的γ 振蕩共寬，γ 振蕩受θ 振蕩的相位調(diào)制［24］。θ 節(jié)律下，抑制性神經(jīng)元產(chǎn)生去極化和超極化的電流，激活或者抑制γ節(jié)律下的抑制性中間神經(jīng)元；同樣，作用于慢速GABAA受體的抑制性中間神經(jīng)元也可以抑制作用于快速GABAA受體的抑制性中間神經(jīng)元的活性，導致γ 節(jié)律的產(chǎn)生，因此θ 節(jié)律可以調(diào)節(jié)γ 節(jié)律［25］。而越來越多的研究表明，θ 振蕩在視覺皮質(zhì)中的存在與注意力機制有關(guān)［26］。在進行視覺刺激的選擇性注意力的任務過程中，初級視覺皮質(zhì)V1區(qū)的θ振蕩以及θ振蕩與γ振蕩之間的相位振幅耦合隨著注意力的變化而變化［24］。本研究結(jié)果表明，DOI 可以增強次級視覺皮質(zhì)V2 區(qū)θ 振蕩的功率以及降低θ 振蕩與γ 振蕩的相位振幅耦合，提示DOI可能是通過影響次級視覺皮質(zhì)的神經(jīng)網(wǎng)絡電活動而發(fā)揮其藥理作用。

幻覺是精神分裂癥的主要癥狀之一，目前針對這類癥狀的治療藥物伴有嚴重的不良反應，探究這類疾病幻覺產(chǎn)生的機制顯得尤為重要［27］。以往研究發(fā)現(xiàn)，這類疾病的患者在產(chǎn)生幻覺時均出現(xiàn)了γ 振蕩的異常［28-29］。研究發(fā)現(xiàn)，應用θ 波腦刺激有助于精神分裂癥患者的認知障礙的緩解［30］。目前電刺激使用的頻率有θ 頻率（4.5 和6 Hz）、α 頻率（10 Hz）和γ 頻率（40 Hz），電極放置的區(qū)域主要是背外側(cè)前額葉皮質(zhì)，如40 Hz 的交流電刺激可改善患者的陽性和陰性癥狀，也可改善患者的語言表達能力［31］。大多數(shù)5-HT2AR 激動劑（如DOI 等）都可以產(chǎn)生幻覺效應，以類似內(nèi)源性精神病的方式改變認知［16］。對于這類藥物研究的重要性在于能夠用于精神病研究的實驗建模［32］。因此，基于本研究中DOI 對次級視覺皮質(zhì)V2 區(qū)γ 振蕩的影響以及γ 振蕩與θ 振蕩之間相位振幅耦合的關(guān)系，可以更好地理解幻覺的形成機制。本研究結(jié)果可為精神疾病幻覺癥狀的治療提供一定的思路。