鐘曉瑜，楊志偉

（廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530004）

二氫楊梅素（dihydromyricetin,DMY）又稱顯齒葡萄素,是一種從顯齒蛇葡萄葉植物中發(fā)現(xiàn)的多酚類化合物。目前顯齒蛇葡萄葉植物中藤茶所含DMY 單體含量最高[1]。研究發(fā)現(xiàn)藤茶中DMY 的含量高達35%,得率約為12.9%[2-3]。2013 年國家衛(wèi)生計生委宣布顯齒蛇葡萄葉可以作為新資源食品來開發(fā)利用[4]。DMY被驗證具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗炎抑菌等多種功能活性[5-8]。

多酚與蛋白質(zhì)、多糖、淀粉的相互作用機制以及功能特性是當前研究熱點。研究表明多酚通過與淀粉發(fā)生氫鍵相互作用可達到抑制淀粉老化和消化的效果[9-10]。黎明明等[11]研究發(fā)現(xiàn)添加表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate,EGCG）的辛?；晁幔╫ctenyl succinic anhydride,OSA）淀粉,提高了OSA 淀粉的抗氧化性。歐陽祝等[12]研究發(fā)現(xiàn)較柚皮苷單體而言,柚皮苷-寡糖復合物的抗氧化性和抑菌性顯著提高。趙倩[13]研究發(fā)現(xiàn)較酪蛋白而言,基于氫鍵非共價作用結(jié)合的單寧酸-酪蛋白復合物、沒食子酸-酪蛋白復合物的抗氧化性顯著提高。

目前已有的研究報道主要關(guān)于DMY 在食品和生物等領(lǐng)域的加工應用,DMY 在淀粉基食品加工的研究鮮見。本文以DMY、馬鈴薯淀粉為主要原料,采用共糊化法制備DMY-馬鈴薯淀粉復合物,利用傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR）、X 射線衍射（X-ray diffraction,XRD）、核磁共振氫譜儀（H nuclear magnetic resonance,1HNMR）與電鏡掃描（scanning electron microscope,SEM）探究二者相互作用機理,通過DPPH 自由基、ABTS+自由基、羥基自由基清除率等抗氧化性指標研究二氫楊梅素-淀粉復合物的抗氧化性,探究多酚與淀粉發(fā)生相互作用后復合物的抗氧化性的變化,同時為具有保健功能的二氫楊梅素在功能性淀粉基食品中的擴展應用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯淀粉:固原雪冠淀粉有限責任公司；二氫楊梅素:貴州苗藥生物技術(shù)有限公司；以2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH）、2,2′-氨基二（2-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）銨鹽[2,2′-amino-di（2-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6）ammonium salt,ABTS）]、水楊酸、無水乙醇、硫酸亞鐵、溴化鉀（均為分析純）:廣東光華科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌恒溫水浴鍋（EMS-30）:常州愛華儀器制造有限公司；傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀（Nicolet iS50）:美國賽默飛世爾科技公司；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（QuattroPHS-3C）:日本理學公司；X-射線衍射儀（D/MAX）:上海儀電科學儀器股份有限公司；核磁共振儀氫譜儀（AVANCE III HD500）:德國布魯克公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉復合物的制備

參考韓雪琴[14]的方法制備二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉復合物。取淀粉7.2 g 于各錐形瓶中,分別加入占淀粉干基重0%、5%、10%、15% 的DMY,加入60 mL 蒸餾水,用保鮮膜做密封處理。置于磁力攪拌恒溫水浴鍋中溫度95 ℃加熱20 min 的條件下快速攪拌。加熱后的樣品冷卻至室溫,分裝一部分樣品放入-80 ℃冰箱速凍4 h 后凍干,剩余部分樣品放入4 ℃冰箱貯存7 d 后凍干,所有樣品過100 目篩,備用。

1.3.2 X 射線衍射儀測定

采用X-射線衍射儀對二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉復合物、天然馬鈴薯淀粉、二氫楊梅素進行晶型掃描。試驗條件:電壓40 kV,電流40 mA,衍射角的旋轉(zhuǎn)范圍4°～40°,掃描速率4.0°/min,步長0.02°[14]。

1.3.3 紅外光譜儀測定

采用傅里葉變換紅外光譜儀對二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉復合物、二氫楊梅素進行測定。待測樣品與KBr 按質(zhì)量比1∶150 混合充分后研磨壓片制樣,進行紅外光譜掃描定性分析。測量范圍4 000～400 cm-1,掃描次數(shù)32,掃描分辨率4 cm-1[15]。

1.3.4 核磁共振氫譜儀（1HNMR）測定

取一定質(zhì)量的二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉復合物、二氫楊梅素（<10 mg）,充分溶解于0.6 mL 的氘代二甲基亞砜中,然后將混合液轉(zhuǎn)移至5 mm 核磁共振管中,進行核磁共振氫譜測定。掃描次數(shù)128、豫弛時間3 s[15]。

1.3.5 掃描電鏡觀察

將少量的樣品粉末均勻分散在載物臺的雙面導電膠上,用洗耳球吹去多余樣品,在真空條件下噴金處理后對樣品的微觀結(jié)構(gòu)進行觀察。試驗條件:掃描電壓5 kV,電流14.0μA,放大倍數(shù)為1 200、5 000 倍[14]。

1.3.6 DPPH 自由基清除率的測定

參考Rafiee 等[16]的方法測定復合物的DPPH 自由基清除率。取10 mg DPPH 固體粉末,用無水乙醇配成濃度為0.2 mmol/L 的DPPH 溶液,備用。分別取30 mg 不同添加量的二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉復合物以及復合物中對應的二氫楊梅素單體分別與5 mL 無水乙醇混合,配成適合濃度的樣品溶液,充分振蕩混勻后備用。將樣品溶液與DPPH 溶液等體積混合并搖勻,然后放置避光處常溫水浴30 min,隨后在517 nm 處測定吸光值。按公式（1）計算DPPH 自由基清除率。

式中:X為DPPH 自由基清除率,%；A0為DPPH 乙醇溶液在517 nm 處的吸光值；Ai為二氫楊梅素乙醇溶液、二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉復合物乙醇溶液與DPPH自由基作用后吸光值；Aj為二氫楊梅素乙醇溶液、二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉復合物乙醇溶液的吸光值。

1.3.7 ABTS+·清除率的測定

參考張靜等[17]的方法測定二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉復合物的ABTS+·清除率。將7 mmol/L ABTS 和2.4 mmol/L 過硫酸鉀溶液按2∶1 比例混合,混合液在黑暗條件下反應12～16 h 產(chǎn)生ABTS+·,使用前用無水乙醇稀釋至在734 nm 處的吸光值為0.70±0.02 即可,得到ABTS 工作液備用。分別取30 mg 不同添加量的二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉復合物以及復合物中對應的二氫楊梅素單體質(zhì)量分別與5 mL 無水乙醇混合,配制成適合濃度的樣品溶液,備用。吸取合適濃度的待測樣品1 mL 于試管中,每個試管加入4 mL ABTS 工作液,在30 ℃條件下避光反應6 min 后于734 nm 處測定其吸光值為A1,用無水乙醇代替樣品為空白對照為A2。按公式（2）計算清除率。

式中:X為ABTS+·清除率,%；A1為1 mL 樣品+4 mL ABTS 工作液在734 nm 處的吸光值；A2為1 mL無水乙醇+4 mL ABTS 工作液在734 nm 處的吸光值。

1.3.8 ·OH 清除率的測定

參考張靜等[17]的方法測定復合物的·OH 清除率。配制6 mmol/L 硫酸亞鐵溶液、6 mmol/L 雙氧水溶液、6 mmol/L 水楊酸溶液,備用。分別取30 mg 不同添加量的二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉復合物以及復合物中對應質(zhì)量的二氫楊梅素單體分別與5 mL 無水乙醇混合,配制成適合濃度的樣品溶液,備用。在反應體系中一次性加入1 mL 硫酸亞鐵溶液、1 mL 的水楊酸溶液和1 mL 樣品液和適量蒸餾水,混合均勻后加入1 mL 雙氧水溶液開始反應,然后37 ℃水浴30 min,在510 nm波長處測定吸光值。按公式（3）計算清除率。

式中:X為·OH 清除率,%；A0為1 mL FeSO4+1 mL水楊酸+1 mL 蒸餾水+1 mL H2O2在510 nm 處的吸光值；Ai為1 mL FeSO4+1 mL 水楊酸+1 mL 樣品溶液+1 mL H2O2在510 nm 處的吸光值；Aj為1 mL FeSO4+1 mL 水楊酸+1 mL 樣品溶液+1 mL 蒸餾水在510 nm處的吸光值。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)均由3 次重復平行試驗所得,用Origin繪圖,用Spss19.0 軟件Duncan 檢驗法進行顯著性差異分析（P<0.05）,并以平均值±標準差的形式表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 X 射線衍射分析

多酚與淀粉相互作用的方式主要有以下兩種:1）多酚與淀粉通過氫鍵、范德華力發(fā)生非共價作用；2）多酚可進入淀粉的螺旋疏水性空腔,與淀粉形成V 型復合物[18],在X 射線衍射圖譜2θ為7.5°、12.7°、20.1°會有明顯的衍射峰[19]。

圖1 為二氫楊梅素的X-射線衍射圖譜。

圖1 二氫楊梅素的X-射線衍射圖Fig.1 X-ray diffraction pattern of dihydromyricetin

由圖1 可知,二氫楊梅素在10.32°、16.65°、17.80°、23.60°、25.39°、26.02°、27.13°、30.50°處具有顯著的晶體衍射峰,這說明二氫楊梅素以晶體結(jié)構(gòu)的形式存在,與文獻中的結(jié)果一致[20]。

圖2 為馬鈴薯淀粉-二氫楊梅素復合物的X-射線衍射圖。

圖2 馬鈴薯淀粉-二氫楊梅素復合物的X-射線衍射圖Fig.2 X-ray diffraction pattern of potato starchdihydromyricetin complex

如圖2 所示,天然馬鈴薯淀粉（potato starch,PS）顯示一個典型的B 型XRD 衍射圖譜,它在2θ約為17°、22°、24°有一個明顯的峰強度[21]。未添加DMY 的馬鈴薯淀粉（PS+0%DMY）在2θ角約17°出現(xiàn)明顯的信號峰,為B 型結(jié)晶體。當DMY 的添加量為5% 時,二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉復合物的晶型為B 晶型。繼續(xù)增大二氫楊梅素的添加量,2θ約17°的衍射峰強度減弱,2θ在16.6°、17.76°、25.50°、30.46°處出現(xiàn)較為明顯的信號峰,這可能是二氫楊梅素的特征峰。綜上所述,在共糊化過程中,二氫楊梅素沒有進入淀粉螺旋空腔與之形成V 型復合物,由此推測二氫楊梅素通過氫鍵等非共價作用與淀粉結(jié)合。

2.2 紅外光譜分析

紅外光譜可依據(jù)在特定波長下出現(xiàn)的官能團的伸縮振動峰,對目標物質(zhì)進行結(jié)構(gòu)表征。

圖3 為二氫楊梅素傅里葉紅外光譜圖。

圖3 二氫楊梅素傅里葉紅外光譜圖Fig.3 Fourier infrared spectra of dihydromyricetin

由圖3 可知,DMY 在3 350 cm-1出現(xiàn)寬而鈍的強峰對應為羥基伸縮振動峰；在1 640 cm-1出現(xiàn)的強峰對應為碳基伸縮振動峰,在1 471 cm-1處的強峰是由于C C 的振動引起的；在1 155 cm-1處的強峰歸因于—C—O—C—伸縮振動峰,這與文獻報道的一致[22]。

為探究二氫楊梅素與馬鈴薯淀粉之間的相互作用,采用紅外光譜儀探討二氫楊梅素與馬鈴薯淀粉結(jié)合后馬鈴薯淀粉的結(jié)構(gòu)變化。圖4 為馬鈴薯淀粉-二氫楊梅素復合物傅里葉紅外光譜圖。

圖4 馬鈴薯淀粉-二氫楊梅素復合物傅里葉紅外光譜圖Fig.4 Fourier infrared spectra of potato starch-dihydromyricetin complex

由圖4 所示,所有樣品在3 500～3 300 cm-1之間存在寬而鈍的吸收峰,這是由于羥基拉伸振動和吸收造成的,2 929 cm-1是—CH 伸縮振動峰,1 650 cm-1是羰基C O 的特征吸收峰；1 370 cm-1是C—H 振動峰；1 160 cm-1為C—O—C 伸縮振動峰；1 020 cm-1為C—O彎曲振動峰。由圖4 可知,DMY 與馬鈴薯淀粉共糊化后沒有產(chǎn)生新的吸收峰,表明DMY 與馬鈴薯淀粉共糊化后沒有新的引入或取代基團。與未添加DMY 的馬鈴薯淀粉（PS+0%DMY）相比,馬鈴薯淀粉-二氫楊梅素復合物羥基伸縮峰波數(shù)從3 324 cm-1向3 285 cm-1發(fā)生位移,推斷二氫楊梅素通過氫鍵相互作用與馬鈴薯淀粉結(jié)合[23]。

2.3 核磁共振氫譜儀分析

為了解試驗中所用二氫楊梅素的詳細結(jié)構(gòu),對二氫楊梅素進行了核磁共振氫譜分析。圖5 為二氫楊梅素的核磁共振氫譜圖。

圖5 二氫楊梅素的核磁共振氫譜圖Fig.51H NMR spectra of dihydromyricetin

如圖5 所示,DMY 的結(jié)果如下:1H NMR（500 MHz,DMSO-d6）δ 11.89（s,1H）,10.81（s,1H）,8.90（s,2H）,8.20（s,1H）,6.39（s,2H）,5.90（d,J=2.1 Hz,1H）,5.86（d,J=2.0 Hz,1H）,5.75（d,J=6.2 Hz,1H）,4.90（d,J=10.8 Hz,1H）,4.41（dd,J=10.9,5.6 Hz,1H）,該結(jié)果與文獻中的一致[24]。DMSO-d6 和水分子的信號峰分別在2.5 Hz和3.3 Hz 處[25]。

為驗證二氫楊梅素與馬鈴薯淀粉是否發(fā)生氫鍵相互作用,故采用核磁共振氫譜儀對復合物進行進一步結(jié)構(gòu)分析。圖6 為馬鈴薯淀粉和馬鈴薯淀粉-二氫楊梅素復合物核磁共振氫譜圖。

圖6 馬鈴薯淀粉和馬鈴薯淀粉-二氫楊梅素復合物核磁共振氫譜圖Fig.61H NMR spectra of potato starch and potato starch-dihydromyricetin complex

由圖6 可知,在ppm 4.4～5.6 范圍內(nèi)出現(xiàn)明顯的信號峰為淀粉分子所含的—OH 基團的化學位移。未添加DMY 的馬鈴薯淀粉的葡萄糖重復單元中C3、C2、C6 處的—OH 在ppm 5.49、5.39、4.57 處出現(xiàn)信號峰。加入DMY 后,葡萄糖重復單元中C3、C6 處所連—OH共振吸收頻率發(fā)生變化,出現(xiàn)吸收峰向高場移動的現(xiàn)象。其中C3、C2、C6 處的—OH 化學位移分別移動范圍為0.01、0.01、0.01。徐敏[15]研究發(fā)現(xiàn)茶多酚與淀粉發(fā)生氫鍵相互作用,1H NMR 圖表示淀粉的葡萄糖重復單元中C2、C3、C6 處化學位移向高場移動。復合物在ppm 11.89、10.81、8.90、6.39、5.90、5.86 處出現(xiàn)的信號峰,可能是未與淀粉發(fā)生相互作用而游離的DMY。

2.4 掃描電鏡分析

為探究二氫楊梅素與馬鈴薯淀粉之間相互作用對馬鈴薯淀粉微觀結(jié)構(gòu)的影響,故采用掃描電鏡對其直觀分析。

圖7 為二氫楊梅素、天然馬鈴薯淀粉及馬鈴薯-二氫楊梅素復合物顆粒的掃描電鏡圖。

圖7 二氫楊梅素、天然馬鈴薯淀粉及馬鈴薯-二氫楊梅素復合物顆粒的掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron microscopy of dihydromyricetin，potato starch and potato-dihydromyricetin complex particles

由圖7 所示,天然的DMY 以針狀晶體的形式存在,天然的馬鈴薯淀粉呈現(xiàn)橢圓形結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)完整,顆粒直徑較大[26]。未添加DMY 的馬鈴薯淀粉由原來的橢圓狀結(jié)構(gòu)變?yōu)椴灰?guī)則的片狀結(jié)構(gòu),表面粗糙。DMY使馬鈴薯淀粉顆粒表面呈現(xiàn)無序紊亂結(jié)構(gòu),出現(xiàn)明顯的孔隙。DMY 與淀粉相互作用致使淀粉顆粒發(fā)生改變,出現(xiàn)了無序疏松的孔狀結(jié)構(gòu)。這與韓雪琴[14]在研究阿魏酸對淀粉微觀結(jié)構(gòu)的結(jié)果一致。多酚與淀粉發(fā)生了相互作用,阻礙了淀粉間的重排,影響淀粉的有序性,淀粉顆粒表面結(jié)構(gòu)越疏松。

2.5 二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉復合物的抗氧化性研究

二氫楊梅素作為一種天然的多酚類物質(zhì),具有一定的抗氧化生物活性[4]。為探討二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉發(fā)生氫鍵相互作用后的抗氧化性,因此設(shè)計該復合物對DPPH、ABTS+、羥基自由基的清除試驗。

2.5.1 DPPH 自由基清除率的測定

圖8 為二氫楊梅素和二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉復合物對DPPH 自由基的清除率對比圖。

圖8 二氫楊梅素和二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉復合物對DPPH 自由基的清除率對比Fig.8 Comparison of scavenging rates of DPPH free radical by dihydromyricetin and complex

由圖8 可知,二氫楊梅素添加量為5% 的復合物所對應的二氫楊梅素單體的質(zhì)量對DPPH 的清除率高達95.78%,這與Wu 等[27]的研究結(jié)果相似。繼續(xù)增加二氫楊梅素單體的質(zhì)量,DPPH 自由基清除率無明顯變化。有研究表明二氫楊梅素分子結(jié)構(gòu)的B 環(huán)中的3′、4′、5′相鄰羥基提供抗氧化作用[26]。在相同反應條件下,與二氫楊梅素添加量為0%的馬鈴薯淀粉相比,二氫楊梅素添加量為5%的復合物的DPPH 自由基清除率明顯增強,當繼續(xù)增加二氫楊梅素的添加量,復合物對DPPH 自由基清除率沒有明顯增加,表明二氫楊梅素添加量與復合物的抗氧化性不成濃度依賴關(guān)系。此外,二氫楊梅素單體對DPPH 自由基清除的效果與復合物對DPPH 自由基清除效果無明顯差異。綜上所述,淀粉復合物對DPPH 自由基清除能力主要歸因于二氫楊梅素本身具有較高的DPPH 自由基清除能力。

2.5.2 ABTS+·清除率的測定

圖9 為二氫楊梅素和復合物對ABTS+·的清除率對比圖。

圖9 二氫楊梅素和二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉復合物對ABTS+·的清除率對比Fig.9 Comparison of scavenging rates of ABTS+·by dihydromyricetin and complex

由圖9 可知,未添加二氫楊梅素的馬鈴薯淀粉清除率接近于零,可忽略不計。當加入5%的二氫楊梅素淀粉后,馬鈴薯淀粉復合物ABTS+·清除率高達91.55%,這可能是二氫楊梅素的加入影響馬鈴薯淀粉對ABTS+·的清除能力。Geng 等[28]研究發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素對ABTS+·清除率在90%以上。其次,二氫楊梅素的添加量和復合物對ABTS+·的清除率沒有呈現(xiàn)劑量依賴性。綜上所述,淀粉復合物對ABTS+·具有較好的清除效果,這可能是當二氫楊梅素與馬鈴薯淀粉相互作用后,二氫楊梅素對ABTS+·清除能力沒有明顯被削弱。

2.5.3 ·OH 清除率的測定

圖10 為二氫楊梅素和復合物對·OH 的清除率對比。

圖10 二氫楊梅素和二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉復合物對·OH 的清除率對比Fig.10 Comparison of scavenging rates of·OH scavenging rate by dihydromyricetin and complex

由圖10 可知,未添加DMY 的馬鈴薯淀粉對·OH清除率接近于0；未添加DMY 的馬鈴薯淀粉的羥基清除率為27.69%。有研究表明磷含量與·OH 的清除率成正相關(guān)。馬鈴薯淀粉的磷含量高于其他谷物淀粉[29]。因此馬鈴薯淀粉本身具備一定的清除·OH 能力。二氫楊梅素單體與·OH 清除率呈現(xiàn)一定的劑量效應關(guān)系。張姝萍[30]研究表明DMY 的樣品濃度在25～800μg/mL 的濃度范圍內(nèi),對·OH 的清除能力呈上升趨勢。DMY 可提高復合物的·OH 清除率并且隨著DMY 添加量的增加,復合物的·OH 清除率逐漸提高。綜上所述,二氫楊梅素的加入增強了馬鈴薯淀粉對·OH 的清除能力。

3 結(jié)論

通過共糊化法制備二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉復合物。XRD、FI-IR、NMR、SEM 結(jié)果表明二氫楊梅素與馬鈴薯淀粉在共糊化過程中二者發(fā)生氫鍵相互作用,淀粉顆粒結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。通過分析DPPH·、ABTS+·、·OH 抗氧化性指標發(fā)現(xiàn),DMY 的加入提高了馬鈴薯淀粉的抗氧化性。與二氫楊梅素單體相比,二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉復合物對DPPH·、ABTS+·的清除能力無明顯差異。DMY 添加量與二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉復合物的·OH 清除率呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。本研究為DMY在淀粉基食品的應用提供理論基礎(chǔ)。后續(xù)可開展二氫楊梅素-馬鈴薯淀粉復合物抗炎抑菌、降血糖等功能特性的研究。