果磊 關(guān)曉輝

第一作者簡介：果磊（1985-），女，高級獸醫(yī)師。研究方向為畜牧獸醫(yī)。

*通信作者：關(guān)曉輝（1976-），男，畜牧師。研究方向為畜牧獸醫(yī)。

DOI：10.19981/j.CN23-1581/G3.2024.13.016

摘? 要：該文主要探究ELISA檢測試劑盒在雞毒支原體檢測中的應(yīng)用。使用血清樣品、雞毒支原體菌株和SPF雞等作為實驗材料，分別進(jìn)行靈敏性實驗、重復(fù)性實驗、抗體持續(xù)期檢測、臨床樣品檢測準(zhǔn)確性檢測和保存期實驗。結(jié)果表明，ELISA試劑盒的靈敏性較好；重復(fù)性實驗的穩(wěn)定性達(dá)到預(yù)期；雞在接種弱毒性疫苗后的35 d內(nèi)，血清中抗體水平有明顯上升；臨床樣品檢測準(zhǔn)確性較高；在保存期320 d內(nèi)，ELISA試劑盒內(nèi)試劑的敏感性和特異性良好。分析可得，使用ELISA試劑盒測試血清中的雞毒支原體是可行的，并且具有操作簡便、成本較低、效率較快的優(yōu)勢。

關(guān)鍵詞：雞毒支原體；ELISA檢測；靈敏性試驗；重復(fù)性實驗；抗體持續(xù)期監(jiān)測

中圖分類號：S858.31? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? 文章編號：2095-2945（2024）13-0064-04

Abstract： This paper mainly explores the application of ELISA detection kit in the detection of Mycoplasma gallisepticum. Using serum samples， Mycoplasma gallisepticum strain and SPF chicken as experimental materials， sensitivity test， repeatability test， antibody duration test， clinical sample detection accuracy test and preservation period test were carried out respectively. The results showed that the sensitivity of ELISA kit was good， the stability of repetitive test was as expected， the antibody level in serum of chickens increased significantly within 35 days after inoculation with weak toxicity vaccine， the detection accuracy of clinical samples was high， and the sensitivity and specificity of ELISA kit were good within 320 days. According to the analysis， it is feasible to use ELISA kit to detect Mycoplasma gallisepticum in serum， and it has the advantages of simple operation， low cost and high efficiency.

Keywords： Mycoplasma gallisepticum; ELISA detection; sensitivity test; repetitive test; antibody duration monitoring Mycoplasma gallisepticum

雞毒支原體（MG）主要攻擊雞的呼吸道系統(tǒng)，感染后的雞表現(xiàn)出咳嗽、鼻炎、氣管啰音等癥狀，嚴(yán)重時還會出現(xiàn)肺水腫，隨著病情發(fā)展可能會窒息死亡。由于雞毒支原體具有很強(qiáng)的傳感性，如果發(fā)現(xiàn)不及時、治療不到位，會給養(yǎng)殖戶造成巨大損失?，F(xiàn)階段，酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）是檢測雞毒支原體的一種常用方法，但是操作較為繁瑣、技術(shù)成本較高。在此基礎(chǔ)上設(shè)計的ELISA試劑盒，則具有使用方便、成本較低的特點，適合廣大養(yǎng)殖戶進(jìn)行雞毒支原體的檢測。

1? 材料

1.1? 試劑盒

選用美國IDEXX公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒。

1.2? 血清樣品

選用中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供的雞毒支原體抗體標(biāo)準(zhǔn)陽性血清（50份）和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清（100份）。另外從本地養(yǎng)殖場采集200份臨場雞血清樣品，其中60份為自然感染雞的血清，140份為疫苗免疫雞的血清。

1.3? 雞毒支原體培養(yǎng)基

按照以下方法準(zhǔn)備A、B 2種溶液：精準(zhǔn)量取20 ml的氯化鈉，15 ml的氯化鉀，0.8 ml的硫酸鎂，0.5 ml的氯化鎂，以及0.5 ml的氯化鈣，將上述5種化學(xué)藥劑混合后，倒入容量瓶中，加入去離子水定容至500 ml，充分搖勻，得到A液。精準(zhǔn)量取0.5 ml磷酸氫鈉，0.35 ml磷酸氫鉀，以及5 ml葡萄糖，倒入容量瓶中，加入去離子水定容至500 ml，充分搖勻，得到B液。

量取30 ml水解乳蛋白，6 ml葡萄糖，20 g丙酮酸鈉和38 g牛心浸汁，將上述4種材料混合后，各加入100 ml的A液與B液。使用玻璃棒攪拌使其均勻混合后，轉(zhuǎn)移到容量瓶中。加入去離子水定容至2 000 ml。觀察到各類物質(zhì)充分溶解后，再滴加0.5%酚紅。測量此時混合液的pH，然后使用鹽酸或氫氧化鈉進(jìn)行中和，使混合液的pH維持在7.0～7.5之間，過濾后放置在0～5 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4? 菌株

使用中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供的雞毒支原體R株作為菌株。

1.5? 實驗動物

從某獸醫(yī)研究所挑選30只健康的30日齡SPF（無特定病原）雞，采集雞血清進(jìn)行實驗室檢驗，確定為陰性。另外，挑選8只疑似雞毒支原體感染的病雞送檢。

2? 方法

2.1? 靈敏性實驗

用PBS（磷酸緩沖鹽）溶液將雞毒支原體的陽性血清按照1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200和1∶6 400的比例進(jìn)行稀釋，然后使用ELISA試劑盒對每個稀釋度進(jìn)行測定。為了消除誤差，每個稀釋度測定次數(shù)為3次，取平均值。設(shè)置雞毒支原體的陽性和陰性對照，計算待檢測血清的S/P值，計算公式如下

S/P=（OD樣品-OD陰性對照）/（OD陽性對照-OD陰性對照），

式中：OD表示吸光度。

2.2? 重復(fù)性實驗

進(jìn)行批內(nèi)和批間2個重復(fù)性實驗。批內(nèi)重復(fù)性實驗方法為：采用血清學(xué)檢測，挑選3份為雞毒支原體陽性的血清和3份雞毒支原體陰性的血清，使用ELISA試劑盒檢測同一批次的ELISA板，每份血清樣品需要重復(fù)檢測3次以消除誤差，統(tǒng)計結(jié)果[1]。批間重復(fù)性實驗與上述方法類似，區(qū)別在于使用不同批次的ELISA板測定血清樣品。

2.3? 抗體持續(xù)期檢測

采用活體疫苗注射的方式，選擇經(jīng)過毒性弱化處理的雞毒支原體疫苗給5只30日齡的SPF雞接種，另外1只不做免疫處理，用于對照。然后使用ELISA試劑盒分別測試免疫前（0 d）、免疫7天后（7 d）、免疫14天后（14 d）、免疫21天后（21 d）、免疫28后（28 d）和免疫35天后（35 d），血清中抗體的水平，并計算S/P值，觀察抗體隨時間推移的產(chǎn)生規(guī)律。

2.4? 臨床樣品檢測準(zhǔn)確性

為了進(jìn)一步確定ELISA試劑盒在測定雞毒支原體方面的準(zhǔn)確性，對8只疑似感染雞毒支原體的病雞進(jìn)行剖檢，并觀察其臨床癥狀和病理表現(xiàn)。同時，分別從雞的肺部、氣囊處采集樣品，進(jìn)行分離培養(yǎng)和PCR檢測，與ELISA試劑盒的測定結(jié)果進(jìn)行對照，判斷測定結(jié)果的一致性[2]。

2.5? 保存期實驗

將ELISA試劑盒放置于冰箱中，溫度在0～5 ℃，并做如下實驗：①保存期試劑的性狀檢測，分別在試劑放入冰箱前（0 d）和保存60、120、180和240 d，觀察ELISA試劑盒中試劑的性狀。②保存期靈敏性檢測，選用雞毒支原體陽性對照血清，使用PBS緩沖液按照1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200和1∶6 400的比例進(jìn)行稀釋，分別在試劑放入冰箱前（0d）和保存60、120、180和240 d后，使用ELISA試劑盒對稀釋后的血清進(jìn)行檢測。③保存期特異性檢測。選擇雞源性其他常見的7種陽性血清樣品（MS、ILTV、IBV、NDV、H5、H7和H9），分別使用保存了0、60、120、180和240 d的ELISA試劑盒進(jìn)行測試[3]。

3? 結(jié)果

3.1? 靈敏性實驗結(jié)果

使用ELISA試劑盒對50份已經(jīng)確定的雞毒支原體陽性血清進(jìn)行檢測，檢測出陽性血清49份，陰性血清1份，ELISA檢測技術(shù)的敏感性為49/50×100%=98%，敏感性較好。使用該檢測技術(shù)對8個稀釋度的血清進(jìn)行檢測，得出OD650nm（被測溶液在650 nm波長處的吸光度），并根據(jù)S/P計算公式將其轉(zhuǎn)化為相應(yīng)S/P值，統(tǒng)計結(jié)果見表1。

由表1數(shù)據(jù)可知，隨著血清稀釋度的增加，吸光度和S/P值逐漸降低。當(dāng)血清稀釋度達(dá)到1∶1 600時，S/P值仍然大于0.4，表明ELISA檢測技術(shù)測定雞毒支原體的靈敏性較好。

3.2? 重復(fù)性實驗結(jié)果

在批內(nèi)重復(fù)性實驗中，使用同一批次的ELISA板分別測定6種血清，測定結(jié)果的變異系數(shù)在1.5%～5.0%之間，說明ELISA檢測試劑盒的穩(wěn)定性較好。在批間重復(fù)性實驗中，使用6個批次的ELISA板檢測分別檢測6種血清，測定結(jié)果見表2。

表1? 靈敏性實驗結(jié)果

表2? 批間重復(fù)性實驗結(jié)果

由表2數(shù)據(jù)可知，在批間重復(fù)性實驗中，變異系數(shù)在2.7%～5.7%之間，雖然相比于批內(nèi)重復(fù)性實驗的穩(wěn)定性較差，但是總體上仍然遠(yuǎn)低于10%，表明ELISA檢測試劑盒的穩(wěn)定性達(dá)到預(yù)期。

3.3? 抗體持續(xù)期檢測結(jié)果

在免疫前（0 d）、免疫后7、14、21、28和35 d這6個時間點，分別采集雞的血清，并使用ELISA試劑盒測試抗體的OD650 nm值，按照上文處理方式在OD650 nm值和S/P值之間進(jìn)行換算。雞毒支原體抗體活疫苗免疫前后試劑盒檢測的抗體水平如圖1所示。

圖1? 雞毒支原體抗體活疫苗免疫前后試劑盒檢測的抗體水平

觀察圖中雞毒支原體抗體水平在0～35 d內(nèi)的變化趨勢可以發(fā)現(xiàn)，注射過毒性弱化處理的雞毒支原體疫苗的5只30日齡SPF雞，在疫苗接種后的35 d內(nèi)，血清中抗體水平有了明顯上升，其中2號樣品的抗體水平（S/P值）最高，在35 d時達(dá)到了5.80。相比之下，沒有注射疫苗的雞，在整個實驗期間血清中抗體水平基本沒有變化[4]。通過對照可以得出，SPF雞通過接種弱毒性的雞毒支原體抗體疫苗，能夠在一定時間內(nèi)使血清中的抗體水平得到升高，從而提高了對該病的抵抗力。橫向?qū)Ρ瓤梢园l(fā)現(xiàn)，5只注射了弱毒性雞毒支原體疫苗的SPF雞，最早在免疫接種的7 d后可以在血清中檢測到相應(yīng)的抗體，并且隨著時間的推移，血清中抗體的水平也呈現(xiàn)出不同程度的增長。

3.4? 臨床樣品檢測準(zhǔn)確性結(jié)果

對8只疑似感染雞毒支原體的患病雞進(jìn)行一段時間的觀察，記錄其臨床癥狀；然后對病死雞進(jìn)行剖檢，進(jìn)一步觀察機(jī)體的病理變化，統(tǒng)計結(jié)果見表3。

表3? 臨床樣品檢測準(zhǔn)確性結(jié)果

由表3信息可知，8只患病雞均表現(xiàn)出呼吸道異常，其中6例均出現(xiàn)了氣囊渾濁的情況，2例出現(xiàn)了肺內(nèi)有黃色異物的情況，2例出現(xiàn)了肺內(nèi)有滲出液的情況；另外，患病雞還表現(xiàn)出精神不振、形體消瘦、眼瞼紅腫甚至是失明的臨床癥狀。從病死雞的肺部、氣囊取樣，進(jìn)行分離培養(yǎng)和PCR檢測、ELISA檢測，橫向?qū)Ρ冉Y(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，8只病死雞中PCR檢測結(jié)果全部為“陽性”，分離培養(yǎng)結(jié)果有7例為“陽性”，ELISA試劑盒檢測有5例為“陽性”。ELISA試劑盒與分離培養(yǎng)結(jié)果一致的有4例。這一數(shù)據(jù)表明，選擇ELISA試劑盒進(jìn)行樣品的血清檢測，準(zhǔn)確性略低于PCR檢測和分離培養(yǎng)。但是分離培養(yǎng)所需周期較長，培養(yǎng)周期通常在3天甚至更長，檢測效率不高；而PCR檢測的難度較高、操作不便，對技術(shù)有嚴(yán)格要求。相比之下，ELISA試劑盒測定則具有操作簡便、效率更快等優(yōu)勢，因此仍然可以作為雞毒支原體檢測的優(yōu)選方法[5]。

3.5? 保存期實驗結(jié)果

在保存期試劑的性狀檢測方面，分別觀察并對照了ELISA試劑盒內(nèi)各試劑在0、60、120、180和240 d的性狀。結(jié)果表明，試劑均為澄清、透明狀，內(nèi)部沒有肉眼可見的異物，說明在長達(dá)240 d的保存期內(nèi)，ELISA試劑盒的試劑保存情況良好。在保存期的敏感性檢測方面，把陽性血清進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋后，分別在0、60、120、180和240 d，使用ELISA試劑盒進(jìn)行血清檢測，統(tǒng)計結(jié)果見表4。

由表4數(shù)據(jù)可知，對于相同稀釋倍數(shù)下的血清，在不同保存時間后使用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測，測定結(jié)果雖然存在一定差異，但是整體上比較穩(wěn)定。以稀釋倍數(shù)為1∶1 600為例，變異系數(shù)（CV）為7.01%，說明在0～240 d內(nèi)，ELISA試劑盒的檢測結(jié)果一致性較好?？傮w來看，使用保存240 d的ELISA試劑盒測試不同稀釋倍數(shù)下的血清，檢測結(jié)果的變異系數(shù)在2.57%～8.54%之間，未超過10%，說明ELISA試劑盒在保存期內(nèi)的敏感性較好。

使用保存時間分別為0、60、120、180和240 d的ELISA試劑盒，對雞源性其他呼吸道疾病的陽性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果見表5。

根據(jù)表5數(shù)據(jù)可知，對于不同保存期內(nèi)的同一種疾病的陽性血清，檢測結(jié)果的變異系數(shù)在2.47%～8.40%之間，同樣未超過10%。說明在320 d內(nèi)ELISA試劑盒的特異性未發(fā)生明顯變化。

4? 結(jié)束語

隨著規(guī)?；B(yǎng)殖場的普及，養(yǎng)殖戶需要做好雞常見疾病的檢測和防治，才能避免疫病的大規(guī)模擴(kuò)散，進(jìn)而提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)收益。使用ELISA試劑盒檢測雞毒支原體，具有檢出限低、操作方便的優(yōu)勢，并且ELISA試劑盒可長時間保存，養(yǎng)殖戶可使用ELISA試劑盒自行測試雞是否感染雞毒支原體，為疫病的防控提供了技術(shù)支持。

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