劉小改，馬美榮，李洪媛，馬東碩，王小偉，張 坤

（北京紅星股份有限公司，北京 101400）

中國白酒大曲制曲歷史悠久，自古就有“曲乃酒之骨”之說?！稌?jīng)·說命篇》記載：“若作酒醴，爾惟曲蘗”，曲蘗就是酒曲的起源。大曲綜合物系、酶系、菌系于一體，是重要的微生物群落載體[1-2]。清香型大曲包含霉菌、酵母菌、細菌等各類微生物，在白酒釀造過程中起糖化、發(fā)酵、生香作用[3]。

乙酸乙酯是清香型白酒中主要呈味物質(zhì)，對改變酒體的風味組成、賦予酒體濃郁香氣及促進酒體豐滿協(xié)調(diào)具有重要作用，其含量高低決定著清香型白酒的風格質(zhì)量[4-5]。研究資料表明，清香型酒中乙酸乙酯合成主要通過3 種途徑：乙醇與乙酸通過化學反應合成；乙醇與乙酸在胞外酯化酶催化作用下合成；在酵母細胞中，乙醇與乙酰輔酶A 在醇?；D(zhuǎn)移酶（AATase）催化作用下合成。其中后兩者為生物學反應[6-7]。

酯化酶在酶學分類上屬于酯酶（Esterase E.C.3.1.1.2）范疇，是由具有酸、醇酯化功能的特定種類微生物發(fā)酵產(chǎn)生[8]。研究表明[9]，酯酶大量存在于霉菌、酵母菌、細菌的發(fā)酵產(chǎn)物中，既可以水解酯類，也可以催化合成低級脂肪酸酯。

白酒釀造過程中霉菌、酵母菌、細菌多個種屬微生物均能產(chǎn)生酯化酶，催化乙酸與乙醇合成乙酸乙酯[10]。喬曉梅[11]進行了酯化酶作用實驗，發(fā)現(xiàn)在乙酸、乙醇化學體系中，添加酯化酶可增加總酯含量，推測乙酸乙酯可由胞外酶催化合成。王旭亮等[12]為了提高清香型白酒品質(zhì)，以清香型汾酒發(fā)酵酒醅為篩選對象，篩選出了優(yōu)質(zhì)產(chǎn)酯化酶的菌株。研究表明，產(chǎn)酯酵母在合成乙酸乙酯過程中需要環(huán)境體系存在一定量氧氣，白酒釀造體系為厭氧環(huán)境，釀酒酵母只有在無氧狀態(tài)下才可發(fā)酵生成乙醇[13-14]。在麩曲白酒釀造大生產(chǎn)過程中投糧量大、料醅緊實、間隙溶氧量小，因此，通過產(chǎn)酯酵母代謝合成乙酸乙酯存在一定局限性。

大曲中微生物菌系豐富，微生物種類繁多，本研究的目標是從清香型白酒大曲中分離篩選獲得可分泌酯化酶的微生物菌株[15-16]，應用于白酒釀造，以期提升白酒中乙酸乙酯含量，改善白酒品質(zhì)及口感。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

清香型大曲：北京紅星股份有限公司提供。

1.1.2 試劑及耗材

乙酸乙酯標準樣，北京迪科馬科技有限公司；乙酸，北京化工廠；乙醇，北京紅星股份有限公司提供；蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；氯化鈉，北京化工廠；麥芽汁培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；麩皮、豆粕粉、酒糟、酒尾，北京紅星股份有限公司提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

平板篩選培養(yǎng)基[17]：將下述培養(yǎng)基成分1 與成分2按照4∶1（V/V）混合均勻，121 ℃滅菌20 min。

成分1：蛋白胨0.7 %，牛肉膏0.3 %，氯化鈉0.3%，瓊脂粉2%。

成分2：將濃度為3 %的聚乙烯醇溶液與三丁酸甘油酯按照9∶1（V/V）充分混合均勻呈乳化液狀態(tài)。

分離純化及斜面保藏培養(yǎng)基：

細菌[18]：蛋白胨1%，牛肉膏0.3 %，氯化鈉0.5%，瓊脂粉2%。

霉菌[19]：麥芽汁培養(yǎng)基。

細菌液體種子培養(yǎng)基[20]：蛋白胨1 %，牛肉膏0.3%，氯化鈉0.5%，121 ℃滅菌20 min。

霉菌種曲培養(yǎng)基[21]：麩皮19 g，豆粕粉1 g，蒸餾水20 mL，混合均勻，121 ℃滅菌40 min。

酯化發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮∶酒糟∶水按1∶1∶10 比例混合煮沸20 min 后過濾，收集濾液，121 ℃滅菌20 min，接種前加入濾液量10%的酒尾。

麩曲培養(yǎng)基：同霉菌種曲培養(yǎng)基。

1.1.4 儀器設備

GC-2010Pro 氣相色譜儀，日本島津公司；BX51 顯微鏡，奧林巴斯公司；LA230S 電子天平，賽多利斯公司；CJ-2DFS 凈化工作臺，天津市泰斯特儀器有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；HY60S生物搖床，武漢匯誠生物科技有限公司；JJ6000 型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 大曲中產(chǎn)酯化酶菌株的分離純化

大曲塊粉碎后，稱取大曲粉1 g，加入到裝有99 mL 生理鹽水和少量玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩混勻，制成菌懸液。按照10 倍稀釋梯度，以無菌水逐級稀釋。取10-3、10-4、10-5三個梯度稀釋液，各吸取0.2 mL涂布篩選平板培養(yǎng)基，每梯度做3個平行樣[20]。培養(yǎng)皿倒置于35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d，觀察其生長情況。

將周邊出現(xiàn)透明圈的菌落挑出，并重新劃線接種至分離純化平板培養(yǎng)基上，于35 ℃培養(yǎng)1～2 d，采用以上平板劃線法多次重復純化，直至分離純化得到不同形態(tài)微生物單純菌落[22]，轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基，于4 ℃冰箱保藏。

1.2.2 細菌種子液培養(yǎng)

將分離純化得到的細菌菌株接種至液體種子培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)40 h[23]。

1.2.3 霉菌種曲培養(yǎng)將分離純化得到的霉菌菌株接種至種曲培養(yǎng)基中，32 ℃，靜置培養(yǎng)4 d，每日搖瓶2次。

1.2.4 菌株初篩

將培養(yǎng)完成后的細菌種子液以10 %接種量、霉菌種曲以3 %接種量分別接入酯化發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃靜置培養(yǎng)3 d，每日搖瓶2 次[24]。培養(yǎng)完成后，取100 mL 發(fā)酵液，加入100 mL 濃度70%vol乙醇，蒸餾提取100 mL 蒸餾液，使用氣相色譜儀測定蒸餾液中乙酸乙酯含量。

1.2.5 微生物麩曲培養(yǎng)

會議要求，要進一步細化落實國務院辦公廳關(guān)于做好非洲豬瘟等動物疫病防控工作通知的任務分工，完善聯(lián)防聯(lián)控工作機制。近期，要組成督查組，赴各地特別是重點省份開展非洲豬瘟防控工作督查，聚焦責任落實、應急處置、生豬調(diào)運和餐廚剩余物監(jiān)管等重點工作。要壓實地方的屬地管理責任，督促地方各級人民政府對本地區(qū)防控工作負總責，切實落實有關(guān)防控措施，統(tǒng)籌做好養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)安全和肉品供給保障。

將培養(yǎng)完成后的初篩菌株細菌種子液以10%接種量、霉菌種曲以1 %接種量接入麩曲培養(yǎng)基中，分別于37 ℃、32 ℃靜置培養(yǎng)3～5 d，每日翻拌或搖瓶2次。

1.2.6 麩曲酯化力測定

稱取5 g 左右麩曲樣品，吸取1 mL 乙酸，加入到100 mL 濃度15 %vol 的酒精中，于30 ℃進行酯化反應6 d。酯化反應液經(jīng)蒸餾提取得到50 mL 蒸餾液，使用氣相色譜儀測定蒸餾液中乙酸乙酯含量，計算微生物麩曲酯化力[25]。

色譜條件[26]：DM-WX 毛細管柱；分流比：10∶1；汽化室溫度230 ℃；程序升溫：初始70 ℃，以10 ℃/min 升溫至230 ℃，保持10 min；檢測器為FID 檢測器，檢測器溫度240 ℃；載氣流速：氮氣35 mL/min，氫氣40 mL/min，空氣400 mL/min。

其中：c——酯化蒸餾液中乙酸乙酯含量，mg/L；

m——細菌麩曲用量，g。

1.2.7 清香型白酒大曲高通量檢測及宏基因組測序

清香型大曲高通量檢測及宏基因組測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。根據(jù)檢測結(jié)果對大曲中微生物組成及功能貢獻進行分析[27]，為菌株篩選方向提供理論參考依據(jù)。

微生物菌株基因測序由華大基因科技有限公司完成。采用16S rDNA 測序方法對目標菌株進行分子生物學鑒定[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 清香型白酒大曲高通量及宏基因組檢測分析

分別對5 種不同來源清香型白酒大曲進行高通量檢測。由結(jié)果分析可知，清香型白酒大曲中真菌（如圖1 所示）主要以黃曲霉、酵母菌、復膜孢酵母菌、念珠菌、伊薩酵母菌等微生物為主；細菌（如圖2 所示）主要以乳酸菌、糖多孢菌、芽孢桿菌、鏈霉菌等微生物為主。

圖1 清香型白酒大曲真菌群落結(jié)構(gòu)分布圖

圖2 清香型白酒大曲細菌群落結(jié)構(gòu)分布圖

應用宏基因組測序?qū)η逑阈桶拙拼笄⑸锱c功能貢獻度進行關(guān)聯(lián)預測分析，結(jié)果見圖3。

圖3 清香型白酒大曲微生物物種與功能貢獻

由圖3 可知，糖多孢菌屬對組氨酸、絲氨酸等多種氨基酸代謝和長碳鏈脂肪酸酯代謝存在貢獻；芽孢桿菌屬、橫梗霉屬、鏈霉菌屬對氨基酸代謝影響較為顯著；魏斯氏菌屬有助于長碳鏈脂肪酸-輔酶A 連接酶、乙酰輔酶轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸合成酶的產(chǎn)生；畢赤酵母屬有助于羧肽酶、谷氨酸合成酶、β-半乳糖苷酶的生成；橫梗霉屬與根霉屬對羧肽酶、β-半乳糖苷酶的產(chǎn)生有促進作用。

2.2 清香型白酒大曲產(chǎn)酯化酶微生物初步篩選

采用稀釋平板涂布法結(jié)合顯微鏡觀察，最終從大曲粉菌懸液中分離、純化獲得12 株不同種類、形態(tài)菌株，包括細菌7 株、霉菌5 株，分別編號為HXX1—HXX7、HXM1—HXM5。

將培養(yǎng)好的菌株接種至酯化發(fā)酵培養(yǎng)基中，以空白培養(yǎng)基為對照，培養(yǎng)完成后利用氣相色譜法對酯化發(fā)酵液提取樣品中乙酸乙酯含量進行測定，標準品色譜圖及樣品分析色譜圖分別見圖4、圖5。

圖4 乙酸乙酯標準品色譜圖

圖5 酯化發(fā)酵液分析色譜圖

由圖5 可以看出，在選定的色譜條件下，乙酸乙酯與其他物質(zhì)分離效果良好，該色譜方法可以對乙酸乙酯含量進行準確測定。

測定不同菌株發(fā)酵提取液中乙酸乙酯含量，結(jié)果見表1。

表1 分離菌株酯化發(fā)酵液檢測結(jié)果

由檢測結(jié)果可知，細菌菌株HXX2、HXX3、HXX7，霉菌菌株HXM3 發(fā)酵液中乙酸乙酯含量相對較高，均超過100 mg/L，說明這些菌株可能具備分泌酯化酶的能力，具有酯化作用。對細菌菌株HXX2、HXX3、HXX7，霉菌菌株HXM3、HXM4 進一步開展篩選實驗。

2.3 清香型白酒大曲產(chǎn)酯化酶微生物復篩結(jié)果

將初篩所得HXX2、HXX3、HXX7、HXM3、HXM4 菌株分別培養(yǎng)成麩曲。以空白反應液為對照，測定各菌株麩曲酯化力，結(jié)果見圖6。

圖6 不同麩曲酯化力檢測結(jié)果

從圖6 可看出，初篩所得的5 株微生物麩曲酯化力差異明顯，表明不同微生物產(chǎn)酯化酶能力不同，其中細菌HXX7 麩曲酯化力較高，可達20.6 mg/g，催化合成乙酸乙酯能力較強。

2.4 高產(chǎn)酯化酶細菌菌株形態(tài)觀察

對篩選所得高產(chǎn)酯化酶微生物菌株HXX7 菌落形態(tài)及細胞形態(tài)特征進行觀察，HXX7 菌落（如圖7 所示）呈乳白色，圓形，表面光滑，光澤度差，邊緣整齊；通過顯微鏡觀察該菌微觀形態(tài)，菌體細胞形態(tài)為短桿狀，經(jīng)革蘭氏染色后菌體呈紫色，為革蘭氏陽性細菌。

圖7 菌株HXX7的菌落（a）及細胞形態(tài)（b）

2.5 高產(chǎn)酯化酶細菌菌株分子生物學鑒定

對細菌菌株HXX7 進行16S rDNA 序列測定，將所測得核酸序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行Blast搜索比對，發(fā)現(xiàn)菌株HXX7 與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilissubsp.inaquosorum strain BGSC 3A28 的16S rDNA 序列相似度為100%，因此確定HXX7 為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

利用MEGA7.0.26 軟件中的NJ 法構(gòu)建菌株HXX7的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖8。

圖8 菌株HXX7的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

本研究從清香型白酒大曲中分離篩選得到1株具有產(chǎn)酯化酶能力的細菌菌株HXX7，其麩曲酯化力達20.6 mg/g，可催化乙酸、乙醇合成乙酸乙酯，該菌株應用于白酒釀造生產(chǎn)中，在增加清香型白酒乙酸乙酯含量方面具有良好的應用前景，對清香型白酒生產(chǎn)及酒質(zhì)提升具有重要意義。

本研究僅初步篩選出了高酯化力微生物菌株，對其在白酒釀造過程中的應用情況評估、確定應用條件及方案以及探究乙酸乙酯含量提高對紅星二鍋頭白酒品質(zhì)改善的促進作用還需要進一步進行深入研究，最終為生產(chǎn)提供理論依據(jù)。