張翊華 孫龍根 白春娜 賀婷婷 韓厚玉 高利華 莫堅武

一、前言

衰老（aging）是機體從構(gòu)成物質(zhì)、組織結(jié)構(gòu)到生理功能隨年齡增大出現(xiàn)衰退的過程。犬的生命周期只有13 ～15年，搜救犬、導盲犬、搜毒犬、搜爆犬、警犬、軍犬等工作犬的訓練科目眾多、費時費力，因此訓成犬的服役時間很短。延緩工作犬的衰老速度、適當延長其服役年限，已成為每個訓犬人和用犬人的一致心愿，而且，寵物犬的衰老和延緩衰老問題也越來越受到重視。不僅如此，犬的衰老過程要比人類快7 倍左右，是研究人類衰老的良好模型。

遺憾的是到目前為止，仍然沒有鑒定犬衰老程度的客觀評價指標。機體衰老以應激能力下降為特征，熱休克蛋白70（HSP70）是機體為應答高溫或應激而產(chǎn)生的一種蛋白分子，其表達量隨衰老而下降。衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（β-gal）在體內(nèi)隨年齡增長而積累；抑癌蛋白（P53）作為轉(zhuǎn)錄因子參與細胞周期控制、DNA 修復、細胞凋亡和細胞應激反應，調(diào)節(jié)細胞衰老和機體衰老，其含量隨著衰老而逐漸增多。因次，本研究擬以血清中HSP70、β-gal 和P53濃度變化作為客觀評價犬衰老程度的初選指標。

犬間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）是一種可以來源于骨髓、脂肪、臍帶和胎盤等多種組織的成體干細胞，具有低免疫原性、高度增殖能力、多向分化潛能和廣闊的臨床應用前景。理論上講，MSCs 回輸機體后，可修復損傷組織、替換衰老細胞，起到治療疾病和延緩衰老的作用，但目前仍缺乏實踐依據(jù)。本項目擬進行警犬MSCs 抗衰老效果研究；以輸細胞前后血清HSP70、β-gal 和P53 濃度變化水平為指標，客觀評價警犬MSCs 抗衰老效果；觀察試驗犬的工作狀態(tài)、身體和精神狀態(tài)變化，建立警犬衰老和MSCs 抗衰老評價體系；為MSCs 在工作犬抗衰老、延長服役期限中的廣泛應用奠定基礎。

二、材料與方法

（一）材料

犬骨髓MSCs（BMSCs）和脂肪MSCs（AMSCs）均來自健康警犬，由天津某公司提供。試驗犬由上海某公司提供，包括2 頭服役警犬和26 頭退役警犬，年齡8 ～12 歲。

（二）方法

1.篩選犬衰老客觀評價指標

挑選4 歲、6 歲、8 歲、10 歲和12 歲警犬各4 頭，各年齡組4 頭警犬均包括2 頭比格犬和2 頭馬里努阿犬；采集并分離每頭犬的血清樣品，送北京清析技術(shù)研究院檢測HSP70、β-gal 和P53 濃度；統(tǒng)計分析犬血清HSP70、β-gal 和P53 濃度隨年齡變化的趨勢。

2.MSCs 抗衰老試驗

采用健康警犬8 頭，品種包括比格犬2 頭、馬里努阿犬2 頭、拉布拉多犬2 頭、德國牧羊犬（工作犬系）1頭、史賓格犬1頭；分成BMSCs 靜脈輸注組和AMSCs 靜脈輸注組，每組4 頭。對每頭犬進行連續(xù)3 次輸細胞，劑量為1×105/kg 體重，每次間隔1個月，在輸細胞前進行血常規(guī)和血液生化指標檢驗、評價健康狀況，并在輸細胞前和輸細胞后1 個月采集血樣，檢測HSP70、β-gal和P53 濃度。此外，對各組犬在試驗前和每次輸細胞1月后進行錄像，比較和觀察其精神狀態(tài)和體況表現(xiàn)。

三、結(jié)果與分析

（一）犬衰老評價指標篩選結(jié)果

1.4 歲、6 歲、8 歲、10 歲和12 歲警犬血清HSP70 濃度測定結(jié)果見圖1（n=4）。從圖可看出，犬除從4 歲到6 歲血清HSP70 濃度升高外，從8歲到12 歲血清HSP70 濃度呈直線下降趨勢，這與犬衰老變化趨勢相吻合，因此HSP70 血清濃度變化水平可作為犬衰老評價指標。

圖1 不同年齡犬血清HSP70 濃度變化

2.4 歲、6 歲、8 歲、10 歲和12歲警犬血清β-gal濃度測定結(jié)果見圖2（n=4）。從圖2 可看出，犬從4 歲開始直到12 歲血清β-gal 濃度呈逐漸上升趨勢，這與犬衰老變化趨勢相吻合，因此β-gal 血清濃度變化水平可作為犬衰老評價指標。

圖2 不同年齡犬血清β-gal 濃度變化

3.4 歲、6 歲、8 歲、10 歲和12 歲警犬血清P53 濃度測定結(jié)果見圖3（n=4）。從圖3 可看出，P53 血清濃度在犬4 歲～12 歲之間會緩慢增加，與犬衰老變化趨勢相吻合，因此P53 血清濃度變化水平可作為犬衰老評價指標。

圖3 不同年齡犬血清P53 濃度變化

（二）犬MSCs 抗衰老試驗結(jié)果

1.警犬輸細胞前后血清HSP70 濃度檢測結(jié)果

輸細胞前和每次間隔1 個月連續(xù)3 次輸細胞后，BMSCs 組4 頭犬的血清HSP70 濃度檢測結(jié)果見圖4，AMSCs 組4 頭犬的血清HSP70 濃度檢測結(jié)果見圖5。由圖看出，輸注干細胞后BMSCs 組和AMSCs 組每頭犬血清HSP70 濃度的下降速度均得到有效抑制，表明BMSCs和AMSCs 均具有抗衰效果。并且由圖5 可看出，間隔1個月連續(xù)3 次輸注AMSCs 后，抗衰效果至少可延續(xù)2個月。

圖4 輸BMSCs 前后HSP70 濃度變化

圖5 輸AMSCs 前后HSP70 濃度變化

2.警犬輸細胞前后血清β-gal 濃度檢測結(jié)果

輸細胞前和每次間隔1 個月連續(xù)3 次輸細胞后，BMSCs 組4 頭犬血清β-gal 濃度檢測結(jié)果見圖6，AMSCs 組4 頭犬血清β-gal 濃度檢測結(jié)果見圖7。由圖可看出，3 次輸細胞后，BMSCs 組和AMSCs 組血清β-gal濃度均顯著低于輸細胞前，并且均具有下降趨勢，表明BMSCs 和AMSCs 均有抗衰老效果，多次輸注有疊加效應。此外，由圖7 可看出，每次間隔1個月連續(xù)3 次輸注AMSCs 后，抗衰效果至少可延續(xù)2 個月。

圖6 輸BMSCs 前后β-gal 濃度變化

圖7 輸AMSCs 前后β-gal濃度變化

3.警犬輸細胞前后血清P53 濃度檢測結(jié)果

輸細胞前和每次間隔1 個月連續(xù)3 次輸細胞后，BMSCs 組4 頭犬血清P53 濃度檢測結(jié)果見圖8，AMSCs組4 頭犬血清P53 濃度檢測結(jié)果見圖9。由圖看出，連續(xù)3 次輸細胞后，BMSCs 組和AMSCs 組血清P53 濃度上升勢頭均明顯受到抑制，第2 次和第3 次輸細胞后血清P53 濃度均低于第1 次，并且AMSCs 組的P53 濃度下降趨勢比BMSCs 組明顯，證明BMSCs 和AMSCs 均具有抗衰效果，AMSCs 比BMSCs 抗衰效果更好；多次輸細胞有疊加效果。此外由圖9 看出，間隔1個月連續(xù)輸注3 次AMSCs 后，抗衰效果至少可延續(xù)2 個月。

圖8 輸BMSCs 前后P53 濃度變化

圖9 輸AMSCs 前后P53 濃度變化

4.輸細胞后警犬的服役情況和精神狀態(tài)變化

2 頭服役犬中，搜爆犬“艾莉”（史賓格犬），2015年10月19日生，海關(guān)巡查犬“多多”（拉布拉多犬），2015年5月25日生，輸細胞后直到目前仍在服役，工作狀態(tài)良好。

退役犬中，試驗前已有12 歲的“米克斯”和“31”（馬里努阿犬），輸細胞后直到現(xiàn)在體況和精神狀態(tài)良好，看不出衰老跡象。

四、討論

（一）警犬衰老評價指標

衰老機體表現(xiàn)為正常生理功能的不可逆衰退，包括記憶力下降、反應遲鈍、運動能力減弱、相關(guān)激素分泌減少等多種臟器退行性變化，以及老年斑、皮膚褶皺、頭發(fā)稀疏變白等外在表現(xiàn)，是生長抑制和獲得性軀體損傷的累積效應。衰老機體中幾乎普遍存在的是組織結(jié)構(gòu)的改變，不僅在微觀和宏觀層面均有明顯表現(xiàn)，而且伴隨著組織功能的損傷和對損傷的反應缺失?？陀^評價機體的衰老程度一直是科學研究的重要課題。西班牙奧維耶多大學的卡洛斯教授等（2023）提出了12 個衰老標志：基因組不穩(wěn)定、端粒磨損、表觀遺傳改變、蛋白質(zhì)平衡喪失、巨噬功能喪失、營養(yǎng)感知失調(diào)、線粒體功能障礙、細胞衰老、干細胞衰竭、細胞間通訊改變、慢性炎癥和生態(tài)失調(diào)。最近，中國衰老標志物研究聯(lián)合體（ABC）六十多個研究組聯(lián)合撰寫綜述，定義了衰老標志物的6 個支柱，包括生理學特征、影像學特征、組織學特征、細胞改變、分子改變和體液分泌因子。并指出，生理行為特征、影像學特征和體液分泌因子可作為衰老標志物臨床轉(zhuǎn)換的3 個可用指標。似乎機體的每個系統(tǒng)、每個器官、每種組織細胞都有不同的衰老標志物。我們從臨床實用考慮，初選了3 個具有不同代表性的體液分泌因子——HSP70、β-gal 和P53 作為檢測對象，分析他們在4 歲、6 歲、8 歲、10 歲和12 歲警犬血清中的濃度變化規(guī)律。結(jié)果表明，HSP70、β-gal和P53 血清濃度變化規(guī)律均與犬衰老變化趨勢相吻合，可作為犬衰老評價指標。

（二）警犬MSCs 抗衰效果評價

研究表明，機體衰老的根本原因是干細胞的衰老，隨著年齡增加干細胞數(shù)量不斷減少，不能及時修復或替換正常衰老死亡的體細胞，造成整個機體組織結(jié)構(gòu)和器官功能損害。MSCs 作為兼具再生和免疫調(diào)節(jié)功能的干細胞類型，可通過直接分化的細胞替代和細胞賦能方式促進衰老組織的再生修復。中國科學院昆明動物研究所博士生曾敏等（2023）將犬臍帶MSCs 靜脈注射到老齡犬（平均9 歲）體內(nèi)進行抗衰老研究。結(jié)果表明，MSCs 逆轉(zhuǎn)了3 個關(guān)鍵的潛在年齡相關(guān)基因(PYCR1, CCRL2 和TOX)的表達水平，顯著降低了炎癥因子(IL-6、TNF-α)水平，有效地改善了老齡犬的心臟功能。我們選用8 ～12 歲健康警犬8頭，以1×105/kg 體重的劑量，間隔1個月連續(xù)3 次靜脈輸注BMSCs（4 頭）和AMSCs（4 頭），對比輸細胞前后每頭犬血清HSP70、β-gal 和P53 濃度變化水平。結(jié)果表明，BMSCs 和AMSCs均可改變每頭犬血清HSP70、β-gal 和P53 濃度的正常變化趨勢，均具有抗衰老效果，而且AMSCs 比BMSCs 抗衰效果更好；多次輸細胞有疊加效果；間隔1個月連續(xù)輸注3 次AMSCs 后，抗衰效果至少可延續(xù)2 個月。此結(jié)果為MSCs 在警犬抗衰老和延長工作犬服役年限中的廣泛應用提供了可靠證據(jù)。

此外，從我們的試驗結(jié)果看出，犬在輸細胞前后血清HSP70、β-gal 和P53 濃度變化水平、工作犬服役年限、老齡犬的體況和精神狀態(tài)，可構(gòu)成犬MSCs 抗衰老評價體系。

五、結(jié)論

（一）HSP70、β-gal 和P53 均可作為犬衰老和MSCs 抗衰老評價指標。輸細胞前后，犬血清HSP70、β-gal 和P53 濃度變化水平、工作犬服役年限、老齡犬的體況和精神狀態(tài)，可構(gòu)成犬MSCs 抗衰老評價體系。

（二）犬BMSCs 和AMSCs 均具有抗衰老效果，但AMSCs 比BMSCs 更好一些；MSCs 多次輸注有疊加效應；每次間隔1個月以1×105/kg 劑量連續(xù)3次輸注細胞后，抗衰效果至少可延續(xù)2個月。