楊柳 任春梅 陸芳 繆倩 程兆榜 季英華

摘要：為了分析瓜類褪綠黃化病毒（cucurbit chlorotic yellow virus，CCYV）在江蘇省葫蘆科作物上的分布情況、發(fā)生趨勢以及變異情況，本研究對疑似感染CCYV的葫蘆科樣本進行采集，覆蓋了江蘇省8個地區(qū)的7種常見葫蘆科作物，通過RT-PCR方法對病樣進行了分子鑒定，并對在泰州采集的黃瓜分離物CCYV-JSXH進行分段克隆與測序，拼接獲得CCYV的全基因組序列后對其進行了序列比對和進化分析。檢測結(jié)果顯示，在建湖采集的西葫蘆樣本、泰州興化和南京江寧地區(qū)采集的黃瓜樣本均有CCYV感染。序列拼接與比對結(jié)果顯示，分離物CCYV-JSXH的RNA1序列與目前已經(jīng)公布的各個分離物基因組序列相似度在99.58%以上，在進化樹上與山東西葫蘆分離物聚為一支；其RNA2序列與各分離株的相似性為99.47%以上，在進化上與廣東分離物聚為一支。本研究結(jié)果表明，CCYV可能由多個途徑傳入江蘇，并已經(jīng)擴大蔓延到江蘇省多個地區(qū)和多種寄主上，對該病毒的監(jiān)測防控已逐漸擴大為葫蘆科作物生產(chǎn)中亟待解決的突出問題之一。

關(guān)鍵詞：瓜類褪綠黃化病毒；分布；分子鑒定；基因組；系統(tǒng)進化分析

中圖分類號：S436.429? 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）06-0036-07

收稿日期：2023-04-28

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（編號：2022YFD1401200）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（19）3108]。

作者簡介：楊柳（1984—），女，江蘇徐州人，博士，助理研究員，主要從事蔬菜作物病毒病研究。E-mail：suiyangy@126.com。

通信作者：季英華，研究員，主要從事蔬菜病毒病研究。E-mail：jiyinghua@jaas.ac.cn。

瓜類褪綠黃化病毒（cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV）屬于長形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（Crinivirus）。它最早于2009年在日本甜瓜上被發(fā)現(xiàn)^[1]，隨后在許多國家都有報道，包括蘇丹、黎巴嫩、伊朗、希臘、土耳其、沙特阿拉伯、塞浦路斯、以色列、美國、阿爾及利亞、西班牙、韓國和印度等^[2-14]。2010年，CCYV于我國臺灣地區(qū)首次被發(fā)現(xiàn)^[15]，而后在山東、北京、上海、河南、湖南、廣西、乃至海南、新疆和貴州等省份逐漸被報道，并且其危害地區(qū)還在不斷擴大^[16-25]。

CCYV是煙粉虱以半持久方式進行傳播的，在自然情況下主要感染葫蘆科作物，目前已經(jīng)報道的以甜瓜、西瓜、黃瓜、南瓜、西葫蘆等常見作物居多，但室內(nèi)試驗顯示該病毒能夠侵染19種葫蘆科作物^[1]。此外CCYV 還可以侵染本氏煙、甜菜、紫花苜蓿、曼陀羅等植物，Orfanidou等明確了13種雜草為CCYV的寄主^[6]，莊新建等報道CCYV可以感染藥用作物地黃^[26]，韋建明等報道CCYV可以感染山藥^[25]。這些結(jié)果表明，CCYV的寄主范圍也在不斷擴大。

被CCYV感染的植株在早期會出現(xiàn)中部或基部葉片的褪綠黃化，而后逐步向上發(fā)展逐漸蔓延至植株頂部，葉片最初呈現(xiàn)褪綠癥狀，隨著病情發(fā)展，葉片黃化，同時仍能看見保持綠色的葉脈等局部組織，最后導(dǎo)致整個植株黃化，在大田生產(chǎn)中嚴(yán)重影響了葫蘆科作物的產(chǎn)量和產(chǎn)品品質(zhì)，已逐漸擴大為葫蘆科作物生產(chǎn)中亟待解決的突出問題之一^[27]。

CCYV的基因組由2條正單鏈RNA （RNA1和RNA2）組成，其中RNA1約 8 607 nt，可編碼甲基磷酸轉(zhuǎn)移酶、依賴RNA的病毒解旋酶、依賴 RNA 的 RNA 聚合酶，P6-1蛋白和P22 蛋白；RNA2約 8 041 nt，可編碼外殼蛋白、小外殼蛋白、70 ku 類熱激蛋白、P59蛋白、P26蛋白、P9蛋白、P6-2蛋白和P4.9蛋白。在病毒的侵染、復(fù)制和傳播過程中，這些蛋白都發(fā)揮了重要的功能^[23]。

江蘇地區(qū)的設(shè)施蔬菜和露地蔬菜在我國蔬菜生產(chǎn)中均占有重要地位，但病毒病的發(fā)生也一直威脅著省內(nèi)蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，根據(jù)目前已有報道，在我國許多葫蘆科作物種植區(qū)都出現(xiàn)了CCYV的感染，但在江蘇地區(qū)尚未有針對性的報道。筆者所在課題組于2022年在江蘇省內(nèi)針對葫蘆科作物CCYV感染進行了普查，并對在主要感染區(qū)（泰州興化）采集的CCYV分離物進行了全基因組序列分析。

1? 材料與方法

1.1? 病原材料

2022年6—11月在江蘇省多個葫蘆科作物生產(chǎn)地采集到各種葫蘆科作物疑似病毒病感染樣品，主要為植株葉片，少部分為果實，癥狀表現(xiàn)為斑駁、褪綠、黃化、皺縮、畸形等。需要保存的樣品經(jīng)液氮速凍存于-80 ℃冰箱。

1.2? RNA提取和cDNA的合成

取0.5 g病葉樣品，如果是病果則切取果皮部分，于液氮中充分研磨成粉末，使用多糖多酚植物RNA試劑盒（上海浦迪生物科技有限公司）按說明書步驟操作提取RNA。而后取2 μL RNA使用HiScriptⅡ Q RT SuperMix試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）按說明書步驟反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于PCR和克隆。

1.3? PCR檢測分析

采用引物CCYV-dtF （5′-AGAACATGATCAAGTCGTGAGTC-3′）和CCYV-dtR （5′-GGTAGGAATGAACTCAGTGTCVG-3′）對反轉(zhuǎn)錄后的病樣cDNA進行PCR擴增。擴增體系為2×Taq Master mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）12.5 μL，前后引物各0.5 μL，模板cDNA 1 μL，ddH₂O補足至 25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性 20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)后再 72 ℃ 延伸5 min。若電泳后在約792 bp處出現(xiàn)目的條帶則將PCR產(chǎn)物送至南京擎科生物科技有限公司進行序列測定。

1.4? CCYV基因組序列克隆與測序

根據(jù)干射香等設(shè)計的引物^[28]分段擴增并通過拼接獲得CCYV1和CCYV2序列全長。擴增體系：2×phanta PCR mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）25 μL，前后引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，ddH₂O補至50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s，52 ℃退火20 s，72 ℃延伸2 min 30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下切取凝膠上的目的條帶，使用Axygen膠回收試劑盒（愛思進生物技術(shù)有限公司）根據(jù)說明書步驟進行回收?；厥债a(chǎn)物連接至pEASY-Blunt載體（北京全式金生物技術(shù)有限公司），轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α（南京擎科生物科技有限公司），挑取單克隆經(jīng)PCR篩選后送至南京擎科生物科技有限公司測序。

1.5? 序列比對分析

將測序測得的所有序列利用Invitrogen軟件里的ContigExpress功能進行拼接獲得CCYV1和CCYV2全長序列。比對分析使用NCBI網(wǎng)站的BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和ClustalX軟件，聚類分析和進化樹的構(gòu)建使用MEGA6軟件。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 江蘇省CCYV的發(fā)生情況

本研究于2022年在江蘇省內(nèi)共采集樣本246份，分別來自于8個地區(qū)的7種常見葫蘆科作物（表1），寄主植物樣品大多數(shù)來源于種植面積較大的葫蘆科作物，如西瓜、甜瓜、南瓜和黃瓜。對所采樣品提取RNA，經(jīng)過RT-PCR檢測后發(fā)現(xiàn)在建湖、興化、南京采集的樣品中均檢測出了CCYV，其他地區(qū)樣品中均未檢出（圖1）。在南京江寧采集的21份甜瓜中有3份檢出CCYV，13份黃瓜樣品中有7份檢出，總檢出率為29.4%。在興化采集的30份樣品中黃瓜占29份，絲瓜1份，其中包括絲瓜在內(nèi)的26份樣品檢出CCYV，檢出率為86.7%。在建湖采集的9份西葫蘆樣品中全部檢出CCYV。在全部246份樣品中，CCYV總檢出率為18.3%。

2.2? CCYV泰州興化分離物基因組特征分析

采用分段克隆拼接的策略，對CCYV泰州興化

黃瓜分離物CCYV-JSXH的每條鏈分別分4段進行克隆，通過軟件拼接獲得CCYV-JSXH全基因組序列。對CCYV-JSXH序列信息進行分析比對發(fā)現(xiàn)，該分離物的RNA1序列全長共計8 607個堿基，包含4個開放閱讀框（ORF），其中74～6 034位堿基為ORF1a，編碼1個由1 987個氨基酸組成、分子量約226.5 ku的蛋白，6 036～7 553位堿基為ORF1b，編碼1個由505個氨基酸組成、分子量約 58.7 ku的蛋白，7 629～7 787位堿基編碼1個由52個氨基酸組成、分子量約6.1 ku的蛋白 P6，7 791～8 357位堿基編碼1個由188個氨基酸組成、分子量約22.1 ku的蛋白P22，5′UTR和 3′UTR 的長度分別為73 nt和250 nt。

RNA2序列全長共計8 041個堿基，編碼8個蛋白，其中1 035～1 166位堿基編碼由43個氨基酸組成、分子量約4.9 ku的蛋白P4.9，1 207～2 877位堿基編碼由556個氨基酸組成、分子量約62.4 ku的蛋白HSP70h，2 878～3 042位堿基編碼1個由54個氨基酸組成、分子量約6.6的蛋白P6，3 036～4 589 位堿基編碼由517個氨基酸組成、分子量約59.7 ku的蛋白P59，4 571～4 810 位堿基編碼由79個氨基酸組成、分子量約9.3 ku的蛋白P9，4 941～5 693位堿基編碼由250個氨基酸組成、分子量約28.7 ku的蛋白CP，5 693～7 117位堿基編碼由474個氨基酸組成、分子量約54.5 ku的蛋白CPm，7 179～7 820位堿基編碼由213個氨基酸組成、分子量約24.9 ku的蛋白P26，5′UTR和3′UTR的長度分別為1 034 nt和221 nt。

BLAST分析結(jié)果表明，CCYV-JSXH的RNA1序列與目前已經(jīng)公布的各個分離物基因組序列的相似度在99.58%以上，其中與北京分離物JQ904628和河南分離物MW768903的相似度最高，序列一致性達99.88%。但CCYV-JSXH RNA1的各編碼基因和非編碼序列與已知CCYV分離物的各序列相似度不完全一致，其中5′UTR、3′UTR和 P6基因序列保守性較高，大多數(shù)分離物的相似性為100%，堿基變化較多存在于ORF1a、ORF1b 和P22基因上，它們的一致性在99.27%～99.90%之間（表2）。

CCYV-JSXH的RNA2序列與目前已公布的分離物基因組序列相似度在99.47%以上，其中與廣東分離物GDLJ（MZ392421）相似度最高，序列一致性達99.80%。CCYV-JSXH RNA2的各編碼基因和非編碼序列與已知CCYV分離物的各序列相似度也不完全一致，其中P4.9、P6、P9和 3′UTR序列保守性較高，許多分離物的相似性高達100%，而5′UTR、HSP70h、 P59、CP、CPm和P26上的變異較多，其一致性在99.09%～99.94%之間（表3）。

將本研究獲得的分離物CCYV-JSXH與已經(jīng)公布的和其一致性較高的3個分離物（JQ904628、MW768903、MZ392420）的序列進行比較分析。結(jié)果（表4）顯示，這4個分離物中共有51個位點存在堿基變化，RNA1中有21個差異堿基位點，RNA2中有30個。JSXH與其他3個分離物均不相同的位點有23個，RNA1中8個，RNA2中15個。RNA1上的差異堿基位點共有13個為同義突變，8個位點為錯義突變；RNA2上有9個位點為同義突變，12個錯義突變，另外還有9個突變位點處于RNA2的UTR區(qū)域。錯義突變存在的位置分別位于ORF1a、ORF1b、P22、HSP70h、CP、CPm和P26上。

將NCBI中有全基因組序列報道的CCYV RNA1和RNA2序列分別使用鄰接法（neighbor-joining，NJ）進行聚類分析，將毛形病毒屬成員萵苣褪綠病毒（LCV）（NC012909）作為外群，進化樹分支置信度（Bootstrap）使用1 000次自導(dǎo)復(fù)制驗證，由此構(gòu)建的Bootstrapconsensustree結(jié)果（圖2）顯示，CCYV-JSXH與其他CCYV分離物聚在一起，表明該分離物確實為CCYV成員之一。根據(jù)RNA1序列的系統(tǒng)進化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析可以看出CCYV-JSXH與山東分離物CC-XH聚為一支（圖2-A），說明它們之間RNA1親緣關(guān)系較近。但從RNA2序列的系統(tǒng)進化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以看出CCYV-JSXH與廣東分離物GDLJ聚為一支（圖2-B），表明這2個分離物的RNA2親緣關(guān)系較近。

3? 討論與結(jié)論

CCYV 最初在2009年被發(fā)現(xiàn)，后來在世界許多國家的葫蘆科作物上均有發(fā)生報道，近些年來出現(xiàn)越來越多的報道，2010年該病毒在我國臺灣地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，而后在多個省市陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。劉放等調(diào)查發(fā)現(xiàn)湖南省南瓜CCYV檢出率呈上升趨勢，并且對CCYV分離物的CP基因進行選擇壓力和中性檢測分析，結(jié)果顯示，我國種群受到正向選擇壓力或多樣化選擇作用，其種群多態(tài)性較低，正處于擴張趨勢，但從世界范圍來看，CCYV維持相對穩(wěn)定狀態(tài)^[21]。本研究團隊在前期研究普查中，曾于2019年在山東壽光的黃瓜上發(fā)現(xiàn)CCYV感染^[29]，后于2019—2020年在江蘇7個地區(qū)的7種葫蘆科作物調(diào)查中發(fā)現(xiàn)豐縣、睢寧、南京、蘇州采集的樣品中出現(xiàn)該病毒，感染寄主有黃瓜、西瓜和甜瓜，總感染率為6.64%^[30]，這是首次在江蘇省境內(nèi)發(fā)現(xiàn)CCYV的侵染。2022年在對南京市、泰州市姜堰區(qū)和另外6個地區(qū)進行葫蘆科作物調(diào)研的過程中，又發(fā)現(xiàn)了該病毒的侵染，除了黃瓜和甜瓜外，絲瓜和西葫蘆也檢出CCYV，本次樣品CCYV總檢出率為18.3%。該病毒在江蘇省內(nèi)的傳播可能也呈現(xiàn)逐漸擴大的趨勢。

煙粉虱的流行暴發(fā)本身就會給蔬菜產(chǎn)業(yè)造成損失，而且煙粉虱又可以同時攜帶多種病毒，再加上它們食性繁雜、寄主廣泛，這就給相關(guān)病毒的擴

展蔓延提供了很多機會^[31]。走訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病毒病的暴發(fā)時間與煙粉虱的暴發(fā)時間相吻合，條件適宜的溫室環(huán)境下隨時可能暴發(fā)；而露地作物在 8—10 月期間也有可能集中暴發(fā)。不僅煙粉虱向周邊地區(qū)的擴散會造成病毒的蔓延，蔬菜作物和種子的貿(mào)易往來等也會造成病毒長距離的傳播^[32]。圖2為分別基于NCBI中不同CCYV分離物的RNA1和RNA2全序列分析構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹，該類型的進化樹是很多次Bootstrap得到的平均結(jié)果。從圖2可以看出，無論是RNA1還是RNA2，來自國外的分離物（美國分離物、日本分離物和以色列分離物）都聚在一個大分支上，這說明CCYV的進化具有一定的地域性。在國內(nèi)分離物中，江蘇分離物JSXH的RNA1與山東分離物CC-XH親緣關(guān)系最近，但是其RNA2卻與廣東分離物GDLJ親緣關(guān)系最近，這可能意味著該病毒通過多種途徑傳入江蘇，并在不同毒株之間發(fā)生了復(fù)制重組。

實驗室條件下發(fā)現(xiàn)該病毒能感染19種葫蘆科作物，本研究在葫蘆科作物集中生產(chǎn)地采集的黃瓜、甜瓜、絲瓜和西葫蘆上均發(fā)現(xiàn)了該病毒，這說明該病毒在自然狀態(tài)下確實可以感染多種作物導(dǎo)致生產(chǎn)問題。目前已有報道該病毒在自然情況下侵染西甜瓜、西葫蘆、黃瓜等多種葫蘆科作物，其中CCYV感染絲瓜還未有詳細(xì)報道。因此該病毒是葫蘆科作物生產(chǎn)中的巨大威脅。還有研究報道其能感染13種雜草，這更加大了該病毒的防控難度，在生產(chǎn)中不僅要注意作物本身的防控還要注意田邊雜草的管理。此外，相似度和系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)來源于同一寄主的分離物并沒有聚在一起（圖2），表明該病毒的進化不受寄主的影響。

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