常曉寧 郭金英 榮成博 谷彤彤 劉宇

摘要：北京歐文氏菌（Erwinia beijingensis）可引起刺芹側(cè)耳細(xì)菌性軟腐病，為明確該病原菌中糖基轉(zhuǎn)移酶的功能，以糖基轉(zhuǎn)移酶基因?yàn)檠芯繉ο?，?gòu)建重組表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)純化；并測定蛋白活性，分析蛋白間相互作用。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體，獲得4個可溶性蛋白。經(jīng)親和層析柱純化獲得MshA、WbnH2、EpsH及TuaG 蛋白，活性測定顯示4 個蛋白均可以利用UDP-糖，并優(yōu)先利用UDP-半乳糖。GST pull down 證實(shí)WbnH2及TuaG蛋白分別與MshA及EpsH蛋白在體外具有相互作用。以上研究結(jié)果為進(jìn)一步研究北京歐文氏菌糖基轉(zhuǎn)移酶基因功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：北京歐文氏菌；軟腐?。惶腔D(zhuǎn)移酶；原核表達(dá)

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.0736

中圖分類號：Q933 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：10080864（2024）01012508

軟腐病作為一種重要的侵染性病害，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-4]。近年來，刺芹側(cè)耳細(xì)菌性軟腐?。╞acterial soft-rot disease）在韓國[5]及中國的北京[6]、廣州[7]等地均有發(fā)現(xiàn)。感染該病害的子實(shí)體上出現(xiàn)水漬狀病斑，嚴(yán)重時整個子實(shí)體腐爛[89]。本課題組前期鑒定表明，北京地區(qū)刺芹側(cè)耳細(xì)菌性軟腐病的病原菌為北京歐文氏菌（Erwinia beijingensis），該病原菌上存在1 個和多糖合成相關(guān)的可移動元件，推測其與致病性相關(guān)。胞外多糖是由細(xì)菌分泌、暴露在細(xì)胞表面的多糖[1011]，可以保護(hù)細(xì)菌免受干燥等惡劣環(huán)境的影響[12]，對病原菌的毒力至關(guān)重要[1314]。糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferases，GT）是產(chǎn)生多種復(fù)雜糖綴合物所必需的酶[15]，負(fù)責(zé)將單糖共價連接到多種有機(jī)底物，并催化糖的附著[16]。大多數(shù)糖基化蛋白暴露于細(xì)胞表面，通常參與細(xì)胞間識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫調(diào)節(jié)等[17]。研究證明，糖基轉(zhuǎn)移酶作為重要的毒力因子在致病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18-20]。通過分析，發(fā)現(xiàn)北京歐文氏菌中存在6個糖基轉(zhuǎn)移酶基因，分別為mshA、wbnH1、wbnH2、EpsH、tuaG 和1422，其中，EpsH、tuaG 及1422 基因?qū)儆谔腔D(zhuǎn)移酶GTA 型超家族（Glycosyltransferase _GTA-type superfamily）； mshA、wbnH1、wbnH2 基因?qū)儆谔腔D(zhuǎn)移酶GTB 型超家族（Glycosyl transferase _GTB-type superfamily）。

為進(jìn)一步了解這些糖基轉(zhuǎn)移酶基因的功能，本研究擬構(gòu)建糖基轉(zhuǎn)移酶基因的原核表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)純化，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，同時利用GST pulldown分析蛋白間的相互關(guān)系，旨在明確糖基轉(zhuǎn)移酶基因在北京歐文氏菌中的作用，為刺芹側(cè)耳細(xì)菌性軟腐病的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

北京歐文氏菌LMG 27579T 由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存，大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌BL21（DE3）pLysS 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

1.2.1 主要試劑 氨芐西林購自上海金畔生物科技有限公司；TBST （TBS with Tween-20， 10×）、卡那霉素、BCA 蛋白檢測試劑盒、BeyoECL Plus（超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LB MILLER 肉湯培養(yǎng)基購自美國BD公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；NP-40裂解液、脫脂奶粉、二硫蘇糖醇購自北京酷來搏科技有限公司；一抗Anti-6×His tag 抗體[EPR20547]-ChIP Grade 購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；二抗Anti-rabbit lgG、HRPlinkedAntibody 購自美國Cell SignalingTechnology （CST）公司；Fast Blue蛋白染色液購自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；Ni-NTA樹脂購買自凱杰企業(yè)管理（上海）有限公司；谷胱甘肽瓊脂糖、還原型谷胱甘肽購自sigma-aldrich 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購買于天根生化科技（北京）有限公司；無縫克隆試劑盒購買于中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司。JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購自寧波新芝生物科技股份有限公司所用引物（表1）由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2.2 培養(yǎng)基及主要試劑配置 LB（luriabertani）液體培養(yǎng)基：2 g LB粉末溶于100 mL去離子水中；LB固體培養(yǎng)基：2 g LB粉末，2 g瓊脂粉溶于100 mL去離子水中；121 ℃，高壓滅菌30 min。使用時根據(jù)試驗(yàn)要求按照1∶1 000比例添加相應(yīng)抗生素。

緩沖液A：20 mmol·L?1 Tris-HCl，50 mmol·L?1NaCl，pH 8.0。

緩沖液B：20 mmol·L?1 Tris-HCl，50 mmol·L?1NaCl，5%甘油，pH 8.0。

緩沖液C：20 mmol·L?1 Tris-HCl，50 mmol·L?1NaCl，5 mmol·L?1 DTT，5%甘油，pH 8.0。

緩沖液D：20 mmol·L?1 Tris-HCl，50 mmol·L?1NaCl，5 mmol·L?1 DTT，0.4% NP40，pH 8.0。

緩沖液E：20 mmol·L?1 Tris-HCl，50 mmol·L?1NaCl，5 mmol·L?1 DTT，pH 8.0。

洗脫緩沖液A：20 mmol·L?1 Tris-HCl，1 mol·L?1咪唑，pH 8.0。

洗脫緩沖液B：20 mmol·L?1 Tris-HCl，20 mmol·L?1 GSH。

1×糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)液：50 mmol·L?1 Tris-HCl（pH 7.5），5 mmol·L?1 MnCl2。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 重組質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建 以北京歐文氏菌LMG 27579T 基因組DNA 為模板，設(shè)計(jì)合成引物wbnH2-F 和wbnH2-R，wbnH2 基因PCR 體系（50 μL）包含：5×Phusion 10 μL，10 mmol·L?1 dNTP1 μL，正、反向引物各2.5 μL，模板DNA 1 μL，DMSO 1.5 μL，Phusion DNA 聚合酶0.5 μL。PCR程序?yàn)椋?8 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。10%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒切膠回收。利用限制性內(nèi)切酶Xho I/EcoR Ⅰ雙酶切pGEX-KG載體，利用無縫克隆試劑盒將目的基因片段與pGEX-KG 質(zhì)粒載體連接，連接體系（10 μL）包含：wbnH2 DNA 片段4 μL，pGEX-KG1 μL，Mix酶5 μL；50 ℃反應(yīng)15 min。反應(yīng)完成后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌中，涂布于含有50 mg·L?1氨芐西林（ampicillin，Amp）的抗性平板，37 ℃倒置過夜培養(yǎng)，獲得重組克隆；提取質(zhì)粒送北京諾賽基因組研究中心有限公司測序驗(yàn)證，測序正確的命名為pGEX-wbnH2。將其余5個糖基轉(zhuǎn)移酶基因委托中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司分別構(gòu)建到pGEX-及pET-30a-載體，獲得表達(dá)質(zhì)粒分別命名為pET-30a-mshA、pET-30awbnH1、pET-30a-EpsH、pGEX-6p-1-tuaG、pET-30a-1422 及pGEX-6p-1-1422。

1.3.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 將上述構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組表達(dá)菌株并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

挑取pET-30a-載體的E. coli BL21/ pET-30amshA、E. coli BL21/pET-30a- wbnH1、E. coli BL21/pET-30a-EpsH 及E. coli BL21/pET-30a-1422 菌株單克隆接種于含有50 mg·L?1 卡那霉素（kanamycin，Kan）的LB 液體培養(yǎng)基中，挑取pGEX-KG- 載體的E. coli BL21/pGEX-wbnH2、E.coli BL21/pGEX-6p-1-tuaG、E. coli BL21/pGEX-6p-1-1422 菌株單克隆接種于含有50 mg·L?1 氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min?1振蕩過夜培養(yǎng)。將所得培養(yǎng)物按照1∶10比例轉(zhuǎn)接到帶有相應(yīng)抗生素的新鮮培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，取出部分菌液命名為未誘導(dǎo)組；其余菌液加入IPTG過夜誘導(dǎo)，180 r·min?1振蕩過夜培養(yǎng)。在上述條件下，對IPTG 終濃度（0.1 mmol·L?1 和1.0 mmol·L?1）及誘導(dǎo)溫度（16 ℃和37 ℃）做優(yōu)化和篩選。

離心收集菌體，pET-30a-載體的菌株使用緩沖液B將細(xì)胞重懸，pGEX-KG載體的菌株用緩沖液C將細(xì)胞重懸。使用超聲破碎儀在冰浴條件下對細(xì)胞超聲破碎裂解，破碎至菌液澄清，在4 ℃條件下離心（12 000 r·min?1、10 min）獲得上清液，SDS-PAGE檢測蛋白誘導(dǎo)情況。

1.3.3 重組蛋白純化 將上一步經(jīng)誘導(dǎo)獲得可溶性蛋白的E. coli BL21/pET-30a-mshA、E. coli BL21/pET-30a-EpsH、E. coli BL21/pGEX-wbnH2、E. coliBL21/pGEX-6p-1-tuaG 菌株進(jìn)行大量培養(yǎng)表達(dá)，并進(jìn)行純化。

pET-30a-載體的菌株使用鎳離子金屬鰲合親和層析介質(zhì)（Ni-NTA）樹脂進(jìn)行純化。取500 μL的Ni-NTA鎳柱加入純化柱中，無菌水沖洗5個柱體積，緩沖液A平衡5個柱體積，將誘導(dǎo)后的蛋白上清液過濾上柱，并加入10 mmol·L?1 咪唑1 mL（除去非特異性結(jié)合），冰上搖動結(jié)合4 h。用緩沖液A 洗脫至無雜帶，再用洗脫緩沖液A 配置成20～300 mmol·L?1 咪唑洗脫并收集目的蛋白。SDS-PAGE 電泳檢測，利用超濾管對收集的蛋白液進(jìn)行脫鹽處理。將純化好的蛋白保存于?80 ℃超低溫冰箱。

pGEX-KG-載體的菌株使用谷胱甘肽瓊脂糖進(jìn)行純化。取500 μL溶解好的的谷胱甘肽瓊脂糖加入純化柱中，無菌水沖洗5個柱體積，緩沖液E平衡5個柱體積，將上清液過濾上柱，冰上搖動結(jié)合4 h，用緩沖液A洗脫至無雜蛋白，用洗脫緩沖液B洗脫并收集目的蛋白。SDS-PAGE電泳檢測，用超濾管對收集的蛋白液進(jìn)行脫鹽處理。將純化好的蛋白保存于?80 ℃超低溫冰箱。

1.3.4 糖基轉(zhuǎn)移酶活性測定 利用Pomega UDPGlo糖基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒，參照MIDDLETON[18]的方法并稍作改進(jìn)，分析4個糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白對UDP- 半乳糖（UDP-GAL）、UDP- 葡萄糖（UDPGlucose）、UDP-尿苷葡萄糖醛酸三鈉（UDP-GlcA）的水解能力。將純化的MshA、EpsH、WbnH2、TuaG蛋白利用BCA蛋白檢測試劑盒標(biāo)定蛋白含量，在不存在受體的情況下，在含有50 mmol·L?1Tris（pH7.5）和5 mmol·L?1 MnCl2 的25 μL 1×糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)液中，將蛋白質(zhì)與100 mmol·L?1 的單一UDP-糖在室溫下孵育30 min，添加25 μL 的UDP-Glo檢測試劑來終止水解反應(yīng)，并在室溫下孵育1 h，使用酶標(biāo)儀檢測發(fā)光值。

1.3.5 GST pull down 分析 ① MshA 蛋白與WbnH2、TuaG 蛋白互作分析。取500 μL 谷胱甘肽瓊脂糖（glutathione-agarose）加入到純化柱中，使用無菌水分別沖洗5個柱體積，再用緩沖液A分別沖洗5個柱體積，將WbnH2、TuaG及GST蛋白（陰性對照）的蛋白裂解液，分別加入到各層析柱中，冰上搖動結(jié)合4 h。棄流出液，使用緩沖液A沖洗柱體洗脫雜蛋白。洗脫完成后，將每個純化柱中分別加入200 μL的MshA蛋白，并用緩沖液A 補(bǔ)充至500 μL，冰上搖動結(jié)合4 h，4 ℃結(jié)合過夜。用緩沖液A、D沖洗柱體洗脫去除雜蛋白，用洗脫緩沖液B洗脫目的蛋白，收集樣品，加入一定量的蛋白上樣緩沖液，10% SDS-PAGE電泳檢測，同時用His 抗體進(jìn)行Western-blot 檢測。用Western-blot電轉(zhuǎn)儀于300 mA 低溫轉(zhuǎn)膜1h，加入含有5%脫脂牛奶的封閉液中封閉1h，TBST（TBSwith Tween-20）洗滌，加入一抗室溫?fù)u動孵育3 h并4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次，加入二抗，室溫?fù)u動孵育1 h，TBST洗滌3次。使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒孵育2～3 min，用凝膠成像儀成像并拍照記錄。② EpsH蛋白與WbnH2、TuaG蛋白互作分析。方法同①。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組載體可溶性蛋白篩選結(jié)果

對構(gòu)建成功的糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白表達(dá)載體進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)，同時對IPTG 濃度及誘導(dǎo)溫度進(jìn)行篩選，結(jié)果表明E. coli BL21/pET-30a-mshA（圖1A）、E. coli BL21/pET-30a-EpsH（圖1B）、E.coli BL21/pGEX-6p-1-tuaG（ 圖1C）在16 ℃ 、0.1 mmol·L?1 IPTG 情況下誘導(dǎo)可獲得可溶性蛋白；E. coli BL21/pGEX-wbnH2 在16 ℃、1.0 mmol·L?1IPTG情況下誘導(dǎo)可獲得可溶性蛋白（圖1D）。

2.2 糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白純化結(jié)果

對pET-30a- 載體的E. coli BL21/pET-30amshA和E. coli BL21/pET-30a-EpsH 進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，并利用Ni柱純化，利用不同濃度咪唑洗脫；對pGEX-載體的E. coli BL21/pGEX-wbnH2、E. coliBL21/pGEX-6p-1-tuaG 利用谷胱甘肽瓊脂糖純化，利用GSH 洗脫。結(jié)果表明，MshA（圖2A 泳道8、9）、EpsH（圖2B泳道4）、WbnH2（圖2C泳道3）及TuaG（圖2D 泳道3）目的條帶大小正確、雜帶較少、蛋白水平相對較高，因此收集對應(yīng)泳道蛋白，并利用超濾管進(jìn)行脫鹽處理，保存至?80 ℃超低溫冰箱，備用。

2.3 糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白活性測定結(jié)果

利用Pomega UDP-Glo 糖基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒測試4個蛋白在沒有受體底物的情況下對UDP-半乳糖（UDP-GAL）、UDP-葡萄糖（UDP-Glucose）、UDP-尿苷葡萄糖醛酸三鈉（UDP-GlcA）的水解能力，在水解后通過檢測游離UDP來評估反應(yīng)，以無酶反應(yīng)作為空白對照。結(jié)果（圖4）表明，4個蛋白均可以水解UDP-糖，其中4 種蛋白均優(yōu)先利用UDP-半乳糖，對UDP-葡萄糖、UDP-尿苷葡萄糖醛酸三鈉的水解能力相似，無明顯差異。WbnH2蛋白對UDP-半乳糖的水解能力最強(qiáng)；TuaG對UDP-半乳糖的水解能力低于其他3種蛋白。

2.4 蛋白互作分析

利用GST pull down 分析WbnH2、TuaG 蛋白分別與MshA、EpsH蛋白的互作情況， SDS檢測結(jié)果（圖4）表明，蛋白目的條帶正確，可進(jìn)行Western-blot 檢測。Western-blot 檢測結(jié)果（圖5）表明， WbnH2、TuaG蛋白分別與MshA、EpsH蛋白結(jié)合后，western-blot能檢測到MshA、EpsH 蛋白，而GST蛋白與MshA、EpsH蛋白結(jié)合洗滌去除非特異結(jié)合后，Western-blot檢測不到，說明WbnH2、TuaG蛋白分別與MshA、EpsH蛋白在體外具有相互作用。

3 討論

病原細(xì)菌分泌的胞外多糖有助于細(xì)菌入侵宿主 [4]，同時影響細(xì)菌的多種行為。研究表明，丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）[14]、水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）、沙門氏菌（Salmonella）[21]等引起宿主致病的原因均與胞外多糖有關(guān)。細(xì)菌多糖由糖基轉(zhuǎn)移酶（GT）合成，GT是個酶家族，負(fù)責(zé)將碳水化合物殘基從供體轉(zhuǎn)移至受體底物[22]。報道指出，糖基轉(zhuǎn)移酶是重要的毒力因子，如糖基轉(zhuǎn)移酶MoGt2 在稻瘟病菌發(fā)病機(jī)制中起重要作用[23]；嗜冷黃桿菌（Flavobacterium psychrophilum）中的2型糖基轉(zhuǎn)移酶基因fpgA 與毒力相關(guān)[24]；布魯氏菌屬（Brucellaspp.）中的糖基轉(zhuǎn)移酶促進(jìn)多糖的產(chǎn)生[25]。糖基轉(zhuǎn)移酶相互作用介導(dǎo)病原菌對宿主的黏附，侵入性致病菌不可分型流感嗜血桿菌（nontypeableHaemophilus influenzae， NTHi）可引發(fā)中耳炎等疾病，其糖基轉(zhuǎn)移酶HMW1C/2C將黏附蛋白HMW1/2糖基化，從而黏附于宿主上皮細(xì)胞，導(dǎo)致宿主發(fā)病[26]；Fap1是一種黏附素，糖基轉(zhuǎn)移酶Gtf1與Gtf2互作，增強(qiáng)Gtf1對黏附素Fap1的糖基化修飾，從而增強(qiáng)副血鏈球菌（Streptococcus parasanguinis）對宿主的致病能力[27]。

本研究從北京歐文氏菌中篩選出6個糖基轉(zhuǎn)移酶基因，為了解其蛋白特性，分別將目的基因克隆入pET-30a 及pGEX 載體，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)一步用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，利用IPTG誘導(dǎo)4個基因，獲得可溶性表達(dá)蛋白。4個糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白對UDP-半乳糖有較強(qiáng)的水解能力，且蛋白在體外存在相互作用，為進(jìn)一步研究糖基轉(zhuǎn)移酶基因在北京歐文氏菌中的作用奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

［1］ WANG Q， ZHANG C， WU X， et al .. Chitosan augmentstetramycin against soft rot in kiwifruit and enhances itsimprovement for kiwifruit growth， quality and aroma [J].Biomolecules， 2021， 11（9）：1257-1270.

［2］ LIU M， WU F， WANG S， et al .. Comparative transcriptomeanalysis reveals defense responses against soft rot in Chinesecabbage [J]. Hortic. Res.， 2019， 6：68-86.

［3］ SUN M， LIU H， HUANG J， et al .. A loop-mediated isothermalamplification assay for rapid detection of Pectobacteriumaroidearum that causes soft rot in konjac [J]. Int. J. Mol. Sci.，2019， 20（8）：1937-1950.

［4］ YAKOVLIEVA L， WALVOORT M. Processivity in bacterialglycosyltransferases [J]. ACS Chem. Biol.， 2019， 15（1）：3-16.

［5］ KIM M K， LEE S M， SEUK S W， et al .. Characterization of thercsA gene from Pantoea sp. strain PPE7 and its influence onextracellular polysaccharide production and virulence onPleurotus eryngii [J]. Plant Pathol. J.， 2017， 33（3）：276-287.

［6］ XU F， YAN H， LIU Y， et al .. A re-evaluation of the taxonomyand classification of the type Ⅲ secretion system in apathogenic bacterium causing soft rot disease of Pleurotuseryngii [J]. Curr. Microbiol.， 2021， 78（1）：179-189.

［7］ 賴亮民，胡晶晶，王艷，等.刺芹側(cè)耳軟腐病病原菌鑒定及其致病機(jī)制[J].食用菌學(xué)報，2021，28（2）：89-99.

LAI L M， HU J J， WANG Y， et al .. Identification andpathogenic mechanisms of pathogens causing soft rot diseasein Pleurotus eryngii [J]. Acta Edulis Fungi， 2021， 28（2）：89-99.

［8］ 張瑞穎，胡丹丹，顧金剛，等.刺芹側(cè)耳細(xì)菌性軟腐病病原菌分離鑒定[J].食用菌學(xué)報，2013，20（3）：43-49.

ZHANG R Y， HU D D， GU J G， et al .. Identification andcharacterization of an Erwinia sp. causing bacterial soft-rotdisease on pleurotuseryngii cultivated in China [J]. Acta EdulisFungi， 2013， 20（3）：43-49.

［9］ 馬元偉，馬康，王守現(xiàn)，等.一株刺芹側(cè)耳軟腐病致病菌新種的分離與鑒定[C]//第十屆全國食用菌學(xué)術(shù)研討會論文匯編，北京，2014：382-389.

MA Y M， MA K， WANG S X， et al .. Isolation and identificationof a novel pathogenic bacteria， causing soft-rot diease ofPleurotus eryngii [C]// Proceedings of the 10th NationalSymposium on edible fungi， Beijing， 2014：382-389.

［10］ LERMINIAUX N A， MACKENZIE K D， CAMERON A.Salmonella pathogenicity island 1 （SPI-1）： the evolution andstabilization of a core genomic type three secretion system [J].Microorganisms， 2020， 8（4）：2-22.

［11］ KLEE S M， SINN J P， CHRISTIAN E， et al .. Virulencegenetics of an Erwinia amylovora putative polysaccharidetransporter family member [J]. J. Bacteriol.， 2020， 202（22）：1-19.

［12］ ROBERTS， IAN S. The biochemistry and genetics of capsularpolysaccharide production in bacteria [J]. Annu. Rev.Microbiol.， 1996， 50（1）：285-315.

［13］ ASKARIAN F， UCHIYAMA S， MASSON H， et al .. The lyticpolysaccharide monooxygenase CbpD promotes Pseudomonasaeruginosa virulence in systemic infection [J]. Nat. Comm.，2021， 12（1）：1-19.

［14］ BAE N， PARK H J， PARK H， et al .. Deciphering the functionsof the outer membrane porin OprBXo involved in virulence，motility， exopolysaccharide production， biofilm formation andstress tolerance in Xanthomonas oryzae pv. Oryzae [J]. Mol.Plant Pathol.， 2018， 19（12）：2527-2542.

［15］ JEON J G， ROSALEN P L， FALSETTA M L， et al .. Natural products in caries research： current （limited） knowledge，challenges and future perspective [J]. Caries Res.， 2011， 45（3）：243-263.

［16］ BISWAS A， THATTAI M. Promiscuity and specificity ofeukaryotic glycosyltransferases [J]. Portland Press OpenAccess.， 2020， 48（3）：891-900.

［17］ LU Q， LI S， SHAO F. Sweet talk： protein glycosylation inbacterial interaction with the host [J]. Trends Microbiol.， 2015，23（10）：630-641.

［18］ MIDDLETON D R， ACEIL J， MUSTAFA S， et al ..Glycosyltransferases within the psrP locus facilitatepneumococcal virulence [J]. J. Bacteriol.， 2021， 203（7）：389-400.

［19］ JIANG Y L， JIN H， YANG H B， et al .. Defining the enzymaticpathway for polymorphic O-glycosylation of the pneumococcalserine-rich repeat protein PsrP [J]. J. Biol. Chem.， 2017， 292（15）：6213-6224..

［20］ DENG Q， WU H， GU Q， et al .. Glycosyltransferase FvCpsAregulates fumonisin biosynthesis and virulence in Fusariumverticillioides [J]. Toxins， 2021， 13（10）：718-730.

［21］ ECHEVERZ M， GARC?A B， SABALZA A， et al .. Lack of thePGA exopolysaccharide in Salmonella as an adaptive trait forsurvival in the host [J]. PLoS Genetics， 2017， 13（5）：816-843.

［22］ EMI L， TYKESSO N， YAN G， et al .. Deciphering the mode ofAction of the processive polysaccharide modifying enzymedermatan sulfate epimerase 1 by hydrogen-deuterium exchangemass spectrometry [J]. Chem. Sci.， 2016， 7（2）：1447-1456.

［23］ DENG S， SUN W， DONG L， et al .. MoGT2 is essential formorphogenesis and pathogenicity of Magnaporthe oryzae [J].Msphere， 2019， 4（5）：309-319.

［24］ P?REZ-PASCUAL D， G?MEZ E， GUIJARRO J A. Lack of atype-2 glycosyltransferase in the fish pathogen Flavobacteriumpsychrophilum determines pleiotropic changes and loss ofvirulence [J]. Veterinary Res.， 2015， 46（1）：1-9.

［25］ DABRAL N， JAIN-GUPTA N， SELEEM M N， et al ..Overexpression of Brucella putative glycosyltransferase WbkAin B. abortus RB51 leads to production of exopolysaccharide [J].Front. Cellular Infect. Microbiol.， 2015， 5（4）：54-68.

［26］ SUSAN G， KATHERINE， et al .. Structural determinants of theinteraction between the TpsA and TpsB proteins in theHaemophilus influenzae HMW1 two-partner secretion system [J].J. Bacteriol.， 2015， 197（10）：1769-1781.

［27］ ECHLIN H， ZHU F， LI Y， et al .. Gap2 promotes the formation ofa stable protein complex required for mature fap1 biogenesis [J].J. Bacteriol.， 2013， 195（10）：2166-2176.

（責(zé)任編輯：張冬玲）