賈瀅暄 張樹(shù)林 張達(dá)娟 戴偉 畢相東

摘要：為探究磷饑餓及磷恢復(fù)對(duì)銅綠微囊藻光合色素、藻膽蛋白和抗氧化酶等生理指標(biāo)的影響，將其進(jìn)行磷饑餓處理7 d后再進(jìn)行磷恢復(fù)，檢測(cè)磷恢復(fù)前后銅綠微囊藻的藻細(xì)胞密度、葉綠素a、類胡蘿卜素、藻藍(lán)蛋白（phycocyanin，PC）、別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC）、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和過(guò)氧化氫（H2O2）含量及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的變化。結(jié)果表明，銅綠微囊藻磷饑餓處理7 d后，藻細(xì)胞密度為2.54×107 cell·mL-1，顯著低于對(duì)照組（3.11×107 cell·mL-1）。磷恢復(fù)144 h后，處理組藻細(xì)胞密度為4.05×107 cell·mL-1，仍顯著低于對(duì)照組（4.32×107 cell·mL-1）；葉綠素a、類胡蘿卜素和PC、APC、PE含量均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，在144 h時(shí)分別達(dá)到5.96、1.44 μg·mL-1和0.031、0.02、0.065 mg·L-1；MDA、H2O2含量和SOD活性呈先上升后下降趨勢(shì)，均在48 h達(dá)到最大值，較對(duì)照組分別增加36.2%、47.7%、51.1%。由此表明，磷恢復(fù)后銅綠微囊藻的藻細(xì)胞密度、葉綠素a、類胡蘿卜素和藻膽蛋白含量雖呈升高趨勢(shì)，但難以恢復(fù)到對(duì)照水平；MDA、H2O2含量及SOD活性的變化也說(shuō)明，從磷饑餓到磷恢復(fù)后銅綠微囊藻藻細(xì)胞受到氧化損傷，并對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)產(chǎn)生破壞。

關(guān)鍵詞：磷恢復(fù)；磷饑餓；銅綠微囊藻；光合色素；藻膽蛋白；抗氧化酶

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.0561

中圖分類號(hào)：S946.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：10080864（2024）01007008

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生產(chǎn)工藝的增多，大量氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)排入水體。水體富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題日趨嚴(yán)重[12]，常導(dǎo)致藍(lán)藻門(mén)種群大量繁殖，成為優(yōu)勢(shì)種群，進(jìn)而形成水華[34]。藍(lán)藻水華不僅使水生態(tài)環(huán)境惡化，還易產(chǎn)生毒素，通過(guò)生物積累影響人類健康。微囊藻（Microcystis）作為重要的藍(lán)藻水華種群之一，受到廣泛關(guān)注[5]。影響微囊藻生長(zhǎng)的因素較多，包括浮游動(dòng)物捕食等生物因素以及營(yíng)養(yǎng)鹽、光照、溫度等非生物因素[6]。長(zhǎng)期以來(lái)，普遍認(rèn)為過(guò)多的營(yíng)養(yǎng)元素會(huì)促使微囊藻爆發(fā)性增長(zhǎng)[7]，水體中氮、磷濃度與微囊藻的生長(zhǎng)關(guān)系密切，且磷對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)有較大的限制作用[8]。

磷是藻類重要的營(yíng)養(yǎng)元素，既是核酸、蛋白質(zhì)和磷脂的主要成分，又是合成葉綠素的必需物質(zhì)[9]。磷在水體中的形態(tài)主要以溶解態(tài)磷和顆粒態(tài)磷為主，微生物可直接利用溶解性無(wú)機(jī)磷[10-11]。微囊藻對(duì)磷鹽的利用主要通過(guò)自身核酸、葉綠素和磷脂等物質(zhì)的合成來(lái)完成。當(dāng)水體磷水平較高時(shí)，微囊藻細(xì)胞能吸收大量的含磷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并在細(xì)胞內(nèi)以不同形式儲(chǔ)存，用來(lái)支持磷缺乏時(shí)藻細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和分裂[5]。因此磷元素被認(rèn)為是影響微囊藻爆發(fā)性增長(zhǎng)的重要限制性因素[12]。許海等[13]研究發(fā)現(xiàn)，不同形態(tài)的磷均能被銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）吸收利用，且銅綠微囊藻在低磷水平下的生長(zhǎng)速率高于高磷水平。岳冬梅等[14]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)氮、磷饑餓的銅綠微囊藻在補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)鹽后都能快速生長(zhǎng)，然而，經(jīng)氮饑餓處理的銅綠微囊藻在氮恢復(fù)后雖然可快速生長(zhǎng)但容易出現(xiàn)衰亡；而磷饑餓處理的藻細(xì)胞在磷恢復(fù)后均以較穩(wěn)定的速率增長(zhǎng)，且未出現(xiàn)衰亡，藻細(xì)胞的碳固定能力也可以恢復(fù)到最初水平。目前研究者大多關(guān)注不同氮磷的質(zhì)量比或不同氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽來(lái)源、種類對(duì)銅綠微囊藻的影響，及在營(yíng)養(yǎng)鹽恢復(fù)后微囊藻的生長(zhǎng)情況，而有關(guān)生理指標(biāo)及氧化損傷等方面的研究較少。

因此本研究以銅綠微囊藻905藻株為研究對(duì)象，分析磷饑餓后恢復(fù)供磷對(duì)其生理指標(biāo)（色素、藻膽蛋白及抗氧化酶等）的影響，為探討磷營(yíng)養(yǎng)鹽在銅綠微囊藻生長(zhǎng)中的作用以及預(yù)防和治理微囊藻水華提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藻種

銅綠微囊藻905藻株購(gòu)自中國(guó)武漢科學(xué)院水生生物研究所。使用BG11 培養(yǎng)基在光照強(qiáng)度40 μmol·m-2·s-1、（27±2） ℃、光照12 h/黑暗12 h的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置1個(gè)對(duì)照組和1個(gè)處理組，二者分別使用標(biāo)準(zhǔn)BG11培養(yǎng)基和不添加磷營(yíng)養(yǎng)鹽的BG11培養(yǎng)基，每組分別設(shè)置3個(gè)平行。銅綠微囊藻初始密度均為2×107 cell·mL-1，進(jìn)行不同水平磷處理7 d后，將對(duì)照組和處理組中的銅綠微囊藻離心，取藻泥，分別接種至標(biāo)準(zhǔn)的BG11培養(yǎng)基中。在磷恢復(fù)后的0、12、24、48、72、96、120、144 h取樣，測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。

1.3 生理指標(biāo)的測(cè)定

1.3.1 藻細(xì)胞密度測(cè)定 用血球計(jì)數(shù)板對(duì)銅綠微囊藻進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)平行樣品均重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取平均值。

1.3.2 葉綠素a和類胡蘿卜素含量測(cè)定 參考戴立洲等[15]的方法測(cè)定葉綠素a（chlorophyll a，Chla）和類胡蘿卜素（carotenoid，Car）含量（μg·mL-1）。具體操作步驟如下：取10 mL 藻液，以4 000 r·min-1 離心10 min，得到藻泥沉淀，加入10 mL的95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇，搖晃使乙醇與藻泥混合均勻，在4 ℃下進(jìn)行8 h的提取，提取結(jié)束后再次離心取上清液，分別在665、649和470 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光光度值，計(jì)算葉綠素a和類胡蘿卜素含量。

1.3.3 藻膽蛋白含量測(cè)定 參考戴立洲等[15]的方法并作修改。取5 mL藻液，在4 000 r·min-1條件下離心10 min，得到藻泥沉淀，向離心管中加入5 mL磷酸緩沖液（0.05 mol·L-1，pH 7.0）充分混勻，包錫紙，放入?80 ℃的超低溫冰箱冷凍8 h 以上；然后取出于室溫下避光溶解，反復(fù)凍融3次，再次離心取上清液，分別測(cè)定其在650、620和565 nm的吸光值并記錄。計(jì)算藻藍(lán)蛋白（phycocyanin，PC）、別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC）和藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）含量（mg·L-1）。

1.3.4 丙二醛、超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫的測(cè)定 取2 mL 藻液以4 000 r·min-1 離心10 min，棄上清液，藻泥加入200 μL生理鹽水混勻，使用超微粉碎機(jī)進(jìn)行破碎處理，得到破碎液待用。從破碎液中取50 μL，加入200 μL 的生理鹽水，以2 500 r·min-1離心10 min，取上清液用于測(cè)定蛋白含量；剩余的破碎液以4 000 r·min-1離心10 min，取250 μL上清液以10 000 r·min-1離心10 min，用于測(cè)定過(guò)氧化氫（H2O2）含量；剩余上清液用于丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的測(cè)定。以上指標(biāo)測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定，具體方法參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010 和SPSS 24.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷恢復(fù)對(duì)磷饑餓銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

磷恢復(fù)后銅綠微囊藻的生長(zhǎng)趨勢(shì)如圖1所示。與對(duì)照組相比，磷饑餓7 d后，處理組銅綠微囊藻密度為2.54×107 cell·mL-1，顯著低于對(duì)照組；隨著磷的恢復(fù)，處理組銅綠微囊藻細(xì)胞密度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)（144 h），對(duì)照組藻密度為4.32×107 cell·mL-1；處理組藻密度為4.05×107 cell·mL-1，兩組間差異顯著（P<0.05）。由此表明，經(jīng)過(guò)饑餓處理的銅綠微囊藻生長(zhǎng)在恢復(fù)供磷后仍然難以恢復(fù)至對(duì)照生長(zhǎng)水平。

2.2 磷恢復(fù)對(duì)磷饑餓銅綠微囊藻色素的影響

由圖2可知，恢復(fù)供磷對(duì)磷饑餓銅綠微囊藻的葉綠素a含量影響顯著。在整個(gè)培養(yǎng)期，處理組的葉綠素a含量均顯著或極顯著低于對(duì)照組。經(jīng)7 d磷饑餓處理的葉綠素a含量較對(duì)照組顯著降低0.99 μg·mL-1；恢復(fù)供磷后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)處理組藻細(xì)胞的葉綠素a含量呈上升趨勢(shì)，在144 h時(shí)升至5.96 μg·mL-1，但仍顯著低于對(duì)照組。

銅綠微囊藻類胡蘿卜素含量變化如圖3 所示，在磷恢復(fù)0 h時(shí)，處理組銅綠微囊藻的類胡蘿卜素含量為1.12 μg·mL-1，顯著低于對(duì)照組（0.14 μg·mL-1）；在磷恢復(fù)144 h時(shí)，處理組藻細(xì)胞的類胡蘿卜素含量升至1.44 μg·mL-1，與對(duì)照組差異不顯著。

2.3 磷恢復(fù)對(duì)磷饑餓銅綠微囊藻藻膽蛋白含量的影響

由圖4可知，在磷恢復(fù)144 h內(nèi)，處理組銅綠微囊藻的藻藍(lán)蛋白（PC）含量極顯著低于對(duì)照組。經(jīng)7 d磷饑餓處理后，處理組PC含量極顯著低于對(duì)照組；恢復(fù)供磷后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組PC含量逐漸上升至0.031 mg·L-1，但仍極顯著低于對(duì)照組。經(jīng)7 d磷饑餓處理后，處理組藻細(xì)胞的別藻藍(lán)蛋白（APC）含量為0.013 mg·L-1，極顯著低于對(duì)照組；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，APC含量呈上升趨勢(shì)，在144 h時(shí)升至0.020 mg·L-1，但仍極顯著低于對(duì)照組。經(jīng)7 d磷饑餓處理后，處理組藻細(xì)胞的藻紅蛋白（PE）含量極顯著低于對(duì)照組；在恢復(fù)供磷144 h時(shí)，對(duì)照組與處理組的PE含量分別為0.071和0.065 mg·L-1，二者差異顯著。

2.4 磷恢復(fù)對(duì)磷饑餓銅綠微囊藻MDA 及H2O2含量的影響

由圖5可知，對(duì)照組銅綠微囊藻細(xì)胞MDA含量在培養(yǎng)期相對(duì)穩(wěn)定；經(jīng)7 d磷饑餓處理后的處理組MDA含量為1.63 nmol·mg-1，與對(duì)照組差異不顯著，隨后MDA含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在48 h時(shí)升至2.52 nmol·mg-1，較對(duì)照組極顯著增加36.2%。在磷恢復(fù)48～144 h，處理組MDA含量逐漸下降并趨于穩(wěn)定；在144 h時(shí)處理組與對(duì)照組間無(wú)顯著差異。在恢復(fù)供磷0～48 h，處理組藻細(xì)胞的H2O2含量逐漸升高，并在48 h時(shí)升至10.41 mmol·g-1，較對(duì)照組極顯著增加47.7%；隨后H2O2含量逐漸下降，并在120～144 h趨于穩(wěn)定，在144 h時(shí)處理組H2O2含量為5.40 mmol·g-1，與對(duì)照組差異不顯著（圖5）。

2.5 磷恢復(fù)對(duì)磷饑餓銅綠微囊藻SOD 活性的影響

磷恢復(fù)對(duì)磷饑餓藻細(xì)胞SOD 活性有顯著影響（圖6）。恢復(fù)供磷后，處理組藻細(xì)胞SOD活性顯著升高，并在48 h時(shí)升至10.62 U·mg-1，較對(duì)照組極顯著提高51.1%；48 h后，SOD活性逐漸降低并趨于穩(wěn)定，在144 h時(shí)，處理組藻細(xì)胞SOD活性為7.70 U·mg-1，較對(duì)照組極顯著高20.9%。

3 討論

前人對(duì)環(huán)境因素對(duì)微囊藻生長(zhǎng)的影響進(jìn)行了大量研究[16]。磷是微藻細(xì)胞組成和合成ATP的重要元素，參與細(xì)胞膜構(gòu)建、能量傳遞和信號(hào)傳導(dǎo)等代謝活動(dòng)。謝靜等[17]研究發(fā)現(xiàn)，氮、磷元素均對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)有顯著影響，但高磷水平對(duì)其生長(zhǎng)的影響更為顯著。微囊藻的胞內(nèi)磷主要以有機(jī)磷形式存在，因此，其生長(zhǎng)速度也取決于胞內(nèi)磷含量[18]，微囊藻對(duì)磷的最大攝取速率較高，具有比其他藻類更強(qiáng)的儲(chǔ)磷能力。磷限制會(huì)影響藻類的生長(zhǎng)繁殖、光合作用、產(chǎn)毒及胞內(nèi)物質(zhì)合成等[19]，當(dāng)外界環(huán)境磷缺乏時(shí)，微藻可以利用自身儲(chǔ)存的磷營(yíng)養(yǎng)鹽繼續(xù)生長(zhǎng)[20-21]。

藻類依靠光合作用將有機(jī)物固定在體內(nèi)，因此光合作用是藻類生長(zhǎng)過(guò)程中最重要的生理過(guò)程之一[22]，葉綠素a與類胡蘿卜素在光合作用中起著重要作用。田雅琪[23]研究發(fā)現(xiàn)，不同氮、磷水平及氮磷比對(duì)微囊藻生長(zhǎng)的影響相似，均表現(xiàn)為低水平抑制，高水平促進(jìn)；隨著氮、磷水平的升高，β-胡蘿卜素含量呈先增加后下降趨勢(shì)，葉綠素a呈直線上升趨勢(shì)。葉倩[24]研究發(fā)現(xiàn)，缺磷時(shí)銅綠微囊藻的藻細(xì)胞中葉綠素a和類胡蘿卜素含量都呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，其生長(zhǎng)受到抑制，并在培養(yǎng)后期逐漸衰亡。李曉梅等[25]指出，磷限制會(huì)使三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum Bohlin）葉綠素a含量降低。在缺磷環(huán)境中，藻類的細(xì)胞分裂受阻，且對(duì)光能的吸收和利用能力降低，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可能會(huì)更多地流向其他代謝過(guò)程，而對(duì)光合色素合成上的投入減少。本研究中磷饑餓會(huì)抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)，且在磷恢復(fù)后處理組銅綠微囊藻的生長(zhǎng)速率仍難以恢復(fù)；磷饑餓導(dǎo)致藻細(xì)胞葉綠素a和類胡蘿卜素含量顯著降低，隨著磷恢復(fù)后培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，二者含量逐漸升高，但在培養(yǎng)末期仍未恢復(fù)至對(duì)照水平，可見(jiàn)磷饑餓對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)及葉綠素a和類胡蘿卜素含量有明顯的抑制作用。

藻膽蛋白主要存在于藍(lán)藻、紅藻、隱藻和少數(shù)甲藻中，是重要的捕光色素蛋白，在一些藻類中也可作為儲(chǔ)藏蛋白[26]。鄭彩云等[27]研究表明，隨著氮水平的上升，紫球藻（Porphyridium cruentum）的藻膽蛋白含量明顯增多，在一定范圍內(nèi)其含量與氮含量呈正相關(guān)。劉潔等[28]指出，低水平Ni增加銅綠微囊藻PC含量，而高水平Ni則降低其含量；但不同Ni水平均使APC含量降低。本研究表明，磷恢復(fù)后銅綠微囊藻的藻膽蛋白含量均呈上升趨勢(shì)，且與葉綠素a 含量和藻細(xì)胞生長(zhǎng)呈正相關(guān)。由此可見(jiàn)，磷恢復(fù)后，隨著藻細(xì)胞葉綠素a含量升高，光合作用能力逐漸提高，對(duì)培養(yǎng)基中磷源的利用能力增強(qiáng)，合成藻膽蛋白含量增加[27]。

抗氧化酶系統(tǒng)是生物體減輕細(xì)胞遭受氧化損傷的重要防御系統(tǒng)，通過(guò)清除細(xì)胞中的活性氧（reactive oxide species，ROS）提高細(xì)胞對(duì)氧化壓力耐受性，是生物的一種保護(hù)機(jī)制。超氧化物歧化酶（SOD）是生物體清除ROS的關(guān)鍵酶，能催化O-2發(fā)生歧化反應(yīng)，生成H2O2，后者再被其他抗氧化酶去氧化生成水分子，是藻體防御ROS的第一道防線。MDA是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，能夠反映膜氧化損傷程度[2930]。H2O2是光合電子傳遞鏈的天然產(chǎn)物，對(duì)藻類具有毒害作用[31]。Li等[32]探究了磷限制對(duì)小球藻（Chlorella）的影響，結(jié)果表明隨著磷水平的增加藻細(xì)胞MDA含量和SOD活性均逐漸降低。王小冬等[33]發(fā)現(xiàn)，磷饑餓抑制了赤潮異彎藻（Heterosigma akashiwo）和海洋卡盾藻（Chattonella marina）生長(zhǎng)，藻細(xì)胞SOD 活性提高以緩解脅迫損傷。馬金華等[31]研究發(fā)現(xiàn)，鏈狀亞歷山大藻（Alexandrium catenella）在衰亡期及高、低氮條件下，藻細(xì)胞內(nèi)H2O2 含量明顯上升，說(shuō)明脅迫條件下藻細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的O-2，致使H2O2積累。楊蕾[34]研究發(fā)現(xiàn)，在不同鹽脅迫下發(fā)狀念珠藻（Nostoc flaglliforme）藻細(xì)胞的O-2 和H2O2含量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，表明鹽脅迫對(duì)其膜系統(tǒng)造成破壞。本研究發(fā)現(xiàn)，磷恢復(fù)后銅綠微囊藻藻細(xì)胞的MDA、H2O2含量及SOD活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，表明磷饑餓處理使細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，造成蛋白質(zhì)降解，產(chǎn)生大量的ROS，使得H2O2 和MDA 含量上升；細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)被激活，SOD等抗氧化酶活性上升，以緩解ROS等有害物質(zhì)對(duì)機(jī)體造成的損傷[31]。

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（責(zé)任編輯：張冬玲）