傅詠梅，盧偉玲，王歡，黃后楷，陳靜，車軫潮，羅錦波，梁硯康

國藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528303

復(fù)方羅布麻顆粒是由羅布麻葉、菊花、山楂經(jīng)提取制備而成，具有清熱、平肝、安神功效，可用于治療高血壓、神經(jīng)衰弱引起的頭暈、心悸、失眠等。其君藥羅布麻葉為夾竹桃科植物羅布麻Apocynum venetumL.的干燥葉[1]。研究表明，羅布麻葉具有降血壓、降血糖、調(diào)血脂等作用[2-4]，有效成分多為黃酮類成分，如金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素等[5-6]。目前，復(fù)方羅布麻顆粒試行標(biāo)準(zhǔn)中僅測定金絲桃苷和總黃酮含量[7]，還有研究測定復(fù)方羅布麻顆粒中槲皮素含量[8-10]或所含菊花的木犀草苷含量[9]等，整體研究較少，不易全面控制復(fù)方羅布麻顆粒的質(zhì)量。國家藥典委員會于2013 年8 月13日公示了“關(guān)于2010 年版《中國藥典》（一部）增補(bǔ)本品種及藥品標(biāo)準(zhǔn)提高修訂公示”附件24 復(fù)方羅布麻顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)公示稿，對該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了提升，但《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版仍未收錄該品種。因此，本研究在參考羅布麻葉、菊花、山楂配方顆粒指紋圖譜和羅布麻葉黃酮類成分含量測定等質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[10-14]的基礎(chǔ)上，采用超高效液相色譜法（UPLC），選取了不同飲片來源制備的15 批復(fù)方羅布麻顆粒，建立了復(fù)方羅布麻顆粒的特征圖譜，同時(shí)對新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、木犀草苷進(jìn)行了含量測定，可為全面、有效地控制復(fù)方羅布麻顆粒的質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

AB135-S 型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；BT124S 型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；HH-8 型恒溫水浴鍋（常州市憶能實(shí)驗(yàn)儀器廠）；JM-30D-40 型超聲清洗儀（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）；ACQUITY UPLC H-Class Plus 型超高效液相色譜儀、H-Class Plus-PDA型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）。

1.2 試藥

對照品金絲桃苷（純度：94.9%，批號：111521-201809）、異槲皮苷（純度：97.2%，批號：111809-201804）、綠原酸（純度：96.3%，批號：110753-202119）、木犀草苷（純度：96.6%，批號：111720-202111）、4,5-二-O-咖啡?；鼘幩幔兌龋?5.1%，批號：111894-202104），對照藥材羅布麻葉（批號：120979-201906）、菊花（批號：121384-201805）、山楂（批號：121138-201206）均購于中國食品藥品檢定研究院；對照品新綠原酸（純度：99.5%，批號：D23GB172337，上海源葉生物科技有限公司）；對照品隱綠原酸（純度：98.0%，批號：3208，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）；乙腈為色譜純（美國Honeywell公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

按中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究要求自制的15 批復(fù)方羅布麻顆粒所用飲片來自不同廠家，均由國藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司王歡主管中藥師鑒定，且經(jīng)本單位檢測中心按《中國藥典》2020 年版要求檢驗(yàn)合格，飲片信息見表1。

表1 復(fù)方羅布麻顆粒飲片信息

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

不同產(chǎn)地飲片隨機(jī)組合為15 批復(fù)方羅布麻顆粒，按國藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司復(fù)方羅布麻顆?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（YBZ13042004）制備15 批浸膏，取浸膏加糊精及矯味劑適量，混勻，制成顆粒，干燥即得。

2.2 色譜條件

Waters CORTECS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；以乙腈為流動(dòng)相A、0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～7 min，6%～12%A；7～11 min，12%～13%A；11～17 min，13%～15%A；17～20 min，15%～19%A；20～25 min，19%～30%A；25～28 min，30%～60%A；28～33 min，60%～75%A）；流速為0.33 mL·min-1；檢測波長為360 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為1 μL；理論板數(shù)以金絲桃苷色譜峰計(jì)＞6000。

2.3 供試品溶液制備

精密稱取研細(xì)后的本品顆粒約2.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min（250 W，40 kHz），放冷，再用70%甲醇補(bǔ)減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm 濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 混合對照品溶液制備

分別精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、木犀草苷對照品適量，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為29.651、176.807、36.652、58.980、58.369、51.391 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.5 對照藥材溶液制備

分別取羅布麻葉對照藥材1.0 g、菊花對照藥材0.5 g 和山楂對照藥材0.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水15 mL，加熱回流提取1 h，放冷，濾過，濾液置25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm 濾過，取續(xù)濾液，分別作為對照藥材溶液。

2.6 復(fù)方羅布麻顆粒特征圖譜的建立

2.6.1 精密度試驗(yàn) 取同一份復(fù)方羅布麻顆粒樣品，按2.2項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次。以綠原酸色譜峰為參照峰，計(jì)算14 個(gè)特征峰與參照峰的相對保留時(shí)間、相對峰面積，相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均小于1.0%，說明所用儀器的精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份復(fù)方羅布麻顆粒樣品，在0、3、6、9、15、24、30 h 分別進(jìn)樣分析，以綠原酸色譜峰作為參照峰，計(jì)算14 個(gè)特征峰與參照峰的相對保留時(shí)間、相對峰面積，相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 均小于1.8%，表明供試品溶液在30 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（S8）復(fù)方羅布麻顆粒樣品6 份，平行制備后按2.2 項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，以綠原酸色譜峰作為參照峰，計(jì)算14 個(gè)特征峰與參照峰的相對保留時(shí)間、相對峰面積，相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 均小于1.2%，說明本方法具有較好的重復(fù)性。

2.6.4 中間精密度試驗(yàn) 與2.6.3 項(xiàng)下不同的操作人員取同一批復(fù)方羅布麻顆粒樣品（S8）6 份，平行制備后在不同時(shí)間、不同超高效液相色譜儀上測定分析，以綠原酸色譜峰作為參照峰，計(jì)算14 個(gè)特征峰與參照峰的相對保留時(shí)間、相對峰面積，相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD 均小于2.2%；中間精密度試驗(yàn)制備的6 份供試品溶液和重復(fù)性試驗(yàn)制備的6 份供試品溶液中，14 個(gè)特征峰與參照峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積RSD 均小于3.0%，說明本方法具有較好的中間精密度。

2.6.5 特征圖譜 15 批（S1～S15）復(fù)方羅布麻顆粒制備后按2.2 項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，其色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”（2012 版）軟件，得到15 批樣品的特征圖譜及對照特征圖譜（圖1）。3 味對照藥材特征圖譜見圖2。比對發(fā)現(xiàn)，2 號峰（綠原酸）歸屬于羅布麻葉、菊花、山楂，1、3～5 號峰（新綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷）歸屬于羅布麻葉、山楂，6 號峰（木犀草苷）歸屬于菊花，8～11 號未知峰歸屬于羅布麻葉，12 號峰（4,5-二-O-咖啡?；鼘幩幔┘?、13、14號未知峰歸屬于菊花。從上述結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，對復(fù)方羅布麻顆粒特征圖譜影響較大的藥材是羅布麻葉和菊花，山楂對其影響較小。

圖1 15批復(fù)方羅布麻顆粒UPLC特征圖譜及對照特征圖譜

圖2 羅布麻葉、菊花、山楂對照藥材特征圖譜

2.6.6 復(fù)方羅布麻顆粒特征圖譜的相似度分析 分析15 批復(fù)方羅布麻顆粒樣品的色譜圖，與對照特征圖譜比較得到其相似度結(jié)果，S1～S15 相似度分別為0.993、0.965、0.992、0.979、0.991、0.990、0.975、0.988、0.960、0.967、0.995、0.993、0.991、0.991、0.991，相似度均大于0.95，可知15批不同飲片來源的復(fù)方羅布麻顆粒相似度良好。

由于綠原酸含量最高、峰形對稱、與相鄰峰的分離度也符合要求，因此選取綠原酸峰作為參照峰，計(jì)算15 批樣品14 個(gè)特征峰與參照峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。15 批樣品的14 個(gè)特征峰與參照峰的相對保留時(shí)間RSD分別為0.1%、0、0.1%、0.1%、0.1%、0.1%、0.1%、0.1%、0.1%、0.1%、0.2%、0.2%、0.2%、0.1%，相對峰面積RSD分別為22.2%、0、18.1%、11.2%、16.5%、32.8%、33.8%、8.9%、21.9%、16.4%、30.4%、21.8%、35.3%、37.4%。從相對峰面積RSD 結(jié)果可知，15 批復(fù)方羅布麻顆粒的化學(xué)組分大體相同，但特征峰的具體含量存在一定差異。

2.7 復(fù)方羅布麻顆粒中6個(gè)成分的含量測定

2.7.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 將復(fù)方羅布麻顆粒樣品溶液、對照品溶液按2.2 項(xiàng)下條件分析測定，色譜圖見圖3。由圖3 可知，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、木犀草苷與各相鄰峰間的分離度均大于1.5，以金絲桃苷色譜峰計(jì)，理論板數(shù)＞6000。

圖3 混合對照品溶液及復(fù)方羅布麻顆粒供試品溶液UPLC圖

2.7.2 線性關(guān)系考察 精密稱取新綠原酸對照品5.96 mg、綠原酸對照品36.72 mg、隱綠原酸對照品7.48 mg、金絲桃苷對照品12.43 mg、異槲皮苷對照品12.01 mg、木犀草苷對照品10.64 mg 置100 mL量瓶中（以此時(shí)各對照品質(zhì)量濃度為200%計(jì)），分別稀釋成5 種質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，進(jìn)樣分析，測定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、木犀草苷的峰面積。以混合對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y），分別對新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、木犀草苷進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。由表2 可知，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)6 個(gè)成分線性關(guān)系均良好。

表2 復(fù)方羅布麻顆粒線性關(guān)系考察結(jié)果

2.7.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份復(fù)方羅布麻顆粒樣品溶液，按2.2 項(xiàng)下條件分別在0、3、6、9、15、24、30 h 進(jìn)樣分析，測定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、木犀草苷的峰面積。結(jié)果顯示，6個(gè)成分的峰面積RSD分別為1.8%、1.5%、1.9%，1.5%、1.3%、1.6%，表明在30 h 內(nèi)復(fù)方羅布麻顆粒樣品溶液具有良好的穩(wěn)定性。

2.7.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按2.3 項(xiàng)下條件平行制備復(fù)方羅布麻顆粒樣品溶液（S8）6 份，進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、木犀草苷的平均含量分別為2.5、16.5、3.4、5.3、6.6、6.1 mg/袋，其RSD 分別為1.5%、1.0%、1.2%、0.3%、0.4%、0.7%，表明本方法的重復(fù)性較好。

2.7.5 中間精密度試驗(yàn) 與2.7.4 項(xiàng)下不同的操作人員取同一批次的復(fù)方羅布麻顆粒樣品（S8）6 份，平行制備后在不同時(shí)間、不同的超高效液相色譜儀上測定分析，結(jié)果顯示，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、木犀草苷的平均含量分別為2.5、16.6、3.5、5.4、6.6、6.1 mg/袋，其RSD 分別為1.8%、1.3%、1.1%、0.8%、0.7%、1.0%；中間精密度試驗(yàn)制備的6 份供試品溶液和重復(fù)性試驗(yàn)制備的6 份供試品溶液中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、木犀草苷的平均含量分別為2.5、16.6、3.4、5.3、6.6、6.1 mg/袋，其RSD 分別為1.7%、2.0%、2.1%、1.1%、1.3%、1.5%，表明本方法的中間精密度較好。

2.7.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批復(fù)方羅布麻顆粒樣品（S8），以含量測定分析方法中的樣品測定質(zhì)量濃度為100% 計(jì)，設(shè)計(jì)50%、100%、150% 3 種質(zhì)量濃度，每種質(zhì)量濃度分別制備3 份進(jìn)行測定分析，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、木犀草苷的平均回收率分別為99.9%、100.8%、99.9%、97.6%、101.1%、100.6%，其RSD 分別為1.8%、1.4%、1.9%、0.9%、0.8%、1.8%，表明該方法加樣回收率良好。

表3 復(fù)方羅布麻顆粒樣品加樣回收率結(jié)果

2.7.7 含量測定 分別精密稱取15 批復(fù)方羅布麻顆粒樣品，每個(gè)樣品平行取2份，按2.2項(xiàng)下條件對各樣品中的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、木犀草苷含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。

表4 復(fù)方羅布麻顆粒含量測定結(jié)果 mg/袋

2.7.8 測定結(jié)果系統(tǒng)聚類分析 將15 批復(fù)方羅布麻顆粒樣品中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、木犀草苷的含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 20.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，分析方法采用組間聯(lián)接和平方歐氏距離，結(jié)果見圖4。當(dāng)平方歐氏距離為15 時(shí)，15 批樣品可以分為4 類，S1、S3 聚為第1 類，S7、S8 聚為第2 類，S2、S9～S10 聚為第3類，S4～S6、S11～S15聚為第4類。結(jié)合15 批樣品所用羅布麻葉、菊花、山楂飲片信息分析，聚為第1類、第2 類、第3 類的幾批樣品的3 味飲片產(chǎn)地均相同，說明相同產(chǎn)地的飲片含量差異較小，制得的復(fù)方羅布麻顆粒樣品中6 個(gè)成分的含量差異也較小；第4 類的8 批樣品所用3 種飲片的產(chǎn)地不盡相同，說明不同產(chǎn)地的飲片也可能存在含量差異較小的情況，相應(yīng)的樣品中6 個(gè)成分含量差異較??；不同產(chǎn)地的3 種飲片制得的15 批樣品中，6 個(gè)成分含量系統(tǒng)聚類分析聚為4 類，再結(jié)合15 批樣品新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、木犀草苷的含量RSD 分別為22.2%、9.1%、18.2%、9.7%、10.1%、27.3%，差異較大，說明本研究中自制的15批樣品具有代表性。

圖4 15批復(fù)方羅布顆粒含量結(jié)果聚類分析

3 討論

3.1 樣品的收集

目前，雖然獲得復(fù)方羅布顆粒生產(chǎn)批文的廠家有6 家，但近年來僅有吉林紫鑫藥業(yè)股份有限公司和國藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司有產(chǎn)品在市場流通，且僅能收集到1 批吉林紫鑫藥業(yè)股份有限公司的樣品（批號：210901），所以本研究所用的15 批樣品為國藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司制備。

3.2 供試品溶液的制備

采用單因素法，以新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、木犀草苷的總含量作為考察指標(biāo)，選取了超聲提取和加熱回流提取2種方法進(jìn)行比較，結(jié)果超聲提取和加熱回流提取時(shí)含量接近，RSD＜3%，考慮到方法的簡便性，故選擇超聲提取法進(jìn)行提取。在此基礎(chǔ)上，分別選擇50%甲醇、70%甲醇、甲醇作為提取溶劑進(jìn)行超聲處理，根據(jù)含量測定結(jié)果選擇70%甲醇。在70%甲醇超聲提取的基礎(chǔ)上，又考察了超聲時(shí)間（20、30、40 min）和超聲功率（250、450、600 W），結(jié)果顯示，超聲時(shí)間和超聲功率對新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、木犀草苷的總含量影響較小，最終選擇250 W超聲提取30 min。

3.3 色譜條件的選擇

考察了不同流動(dòng)相（0.09% 磷酸水溶液、0.10%磷酸水溶液、0.11%磷酸水溶液）、檢測波長（256、280、320、360 nm）、流速（0.30、0.33、0.35 mL·min-1）及柱溫（25、30、35、40 ℃），結(jié)果顯示，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液、檢測波長為360 nm、流速為0.33 mL·min-1、柱溫為30 ℃時(shí)色譜的各項(xiàng)指標(biāo)較好。

4 結(jié)論

分析15 批復(fù)方羅布麻顆粒的含量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、木犀草苷的總含量均在35 mg/袋以上，可在此基礎(chǔ)上制定復(fù)方羅布麻顆粒的含量限度，以控制其質(zhì)量。目前，復(fù)方羅布麻顆粒試行標(biāo)準(zhǔn)中含量測定評價(jià)指標(biāo)相對單一，且對其特征圖譜研究較少。本研究建立了可以同時(shí)測定其特征圖譜和新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、木犀草苷含量的UPLC 方法，可以定性、定量控制復(fù)方羅布麻顆粒的質(zhì)量。該方法靈敏度高、重復(fù)性好，可為復(fù)方羅布麻顆粒質(zhì)量的科學(xué)全面評價(jià)提供參考。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。