顏夢凡,李鑫輝,劉泳釗,李彩云,蔣 嘯

(湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院,長沙 410208)

葉桂(1667—1746),字天士,號香巖,清代著名醫(yī)學家,“溫病四大家”之一。葉天士畢生專注臨床研究,親筆著述的醫(yī)案并不多,所傳于世者,多為其門人、后裔纂輯?！度~天士醫(yī)學全書》所輯醫(yī)書13部,輯錄葉天士對溫病學理論的闡釋及其豐富的臨床經(jīng)驗,廣泛涉及內(nèi)、外、婦、兒、五官等各科。

胸痹心痛病是以胸部悶痛、喘息不得臥為主癥的疾病,甚者心痛徹背,背痛徹心[1],屬于西醫(yī)所指“冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、缺血性心臟病、心絞痛”等范疇[2-3]。東漢張仲景在《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治第九》中論述“夫脈當取太過不及,陽微陰弦,即胸痹而痛,所以然者,責其極虛也。今陽虛知在上焦,所以胸痹、心痛者,以其陰弦故也”[4],首次明確胸痹的病名,提出“陽微陰弦”是其基本病機。葉天士對胸痹心痛病的理解是基于張仲景思想的繼承與發(fā)展,但因其設(shè)“胸痹”“心痛”專篇醫(yī)案較少,其余醫(yī)案分散,又多伴隨其他癥狀,收集難度較大等原因,鮮少有人系統(tǒng)整理分析葉天士治療胸痹心痛病的醫(yī)案,本文將收集整理《葉天士醫(yī)學全書》中有關(guān)胸痹心痛病的醫(yī)案,分析其中用藥規(guī)律,期望能從中找出葉天士治療胸痹心痛病特有的學術(shù)思想,以啟發(fā)現(xiàn)代臨床治療胸痹心痛病遣方用藥的思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源與篩選

本次醫(yī)案資料選自中國中醫(yī)藥出版社出版、黃志英主編的2015年3月第二版《葉天士醫(yī)學全書》[5]中《臨證指南醫(yī)案》《種福堂公選醫(yī)案》《葉氏醫(yī)案存真》《葉天士晚年醫(yī)案真本》《眉壽堂方案選存》《未刻本葉天士醫(yī)案》。此6本書為數(shù)據(jù)來源,其中《臨證指南醫(yī)案》第十卷為《幼科要略》,未納入數(shù)據(jù)整理范圍。

從《葉天士醫(yī)學全書》中所選的6本書籍共載醫(yī)案數(shù)千例,按以下納入標準和排除標準篩選,通過手工檢索、錄入、復核的方式,最終篩選出100首符合標準的方劑。

1.2 納入標準

在方劑功效主治中依據(jù)檢索詞“胸痹”“心痛”“心痛引背”“背痛徹心”“胸痛”進行檢索;病案中方劑有完整藥物組成;首診與復診處方所屬醫(yī)案獨立;重復醫(yī)案取一則;劑型包括湯劑、丸劑、散劑、丹劑、膏劑。

1.3 排除標準

檢索詞為“胸痞”“胸脅痛”“胸脘痛”等;藥物羅列不全或未給出完整方劑的醫(yī)案;重復醫(yī)案。

1.4 數(shù)據(jù)規(guī)范

本次數(shù)據(jù)整理所選的醫(yī)案部分缺乏對方藥名稱的規(guī)范化統(tǒng)一,帶有別名、年代和葉天士的學術(shù)特色,故參照2020年版《中華人民共和國藥典》(一部)[6]規(guī)范中藥名稱,如“廣皮”規(guī)范名稱為“陳皮”,“小茴”規(guī)范名稱為“小茴香”,“官桂”規(guī)范名稱為“肉桂”,“炒桃仁”規(guī)范名稱為“桃仁”等;未標注炮制方法的藥物,皆歸為生品,如“甘草、白芍、半夏”等;對于未列出完整藥物組成的方劑,參照《葉天士醫(yī)學全書》中《臨證指南醫(yī)案集方》將藥物組成補充完整。

1.5 數(shù)據(jù)賦值與錄入

數(shù)據(jù)使用二分類賦值法,運用Excel 2021軟件將出現(xiàn)的中藥列為1,未出現(xiàn)的列為0,構(gòu)建原始數(shù)據(jù)庫。參照《中華人民共和國藥典》和“十三五”規(guī)劃教材《中藥學》[7],按中藥名稱、藥性、藥味、歸經(jīng)、功效作為類別收錄整理,存在的計為1,不存在的計為0,建立數(shù)據(jù)矩陣模型。為保證數(shù)據(jù)的準確性,此次數(shù)據(jù)挖掘由2位研究人員進行數(shù)據(jù)錄入與核對。

1.6 統(tǒng)計方法

采用Microsoft Excel 2021軟件,利用頻次統(tǒng)計方法,對數(shù)據(jù)庫中高頻中藥(頻次≥8次)名稱,藥性、藥味、歸經(jīng)和功效等變量分布情況進行統(tǒng)計分析,構(gòu)建三線表,使用Origin 2022軟件制作相應(yīng)的頻次雷達圖。

采用SPSS Modeler 18.0軟件的Apriori算法進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析,構(gòu)建藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則網(wǎng)狀圖。

采用SPSS 25.0對高頻中藥進行聚類分析和因子分析,繪制聚類圖并提取載荷較高的公因子。

1.7 網(wǎng)絡(luò)藥理學研究

1.7.1 核心藥物組合半夏-生姜-茯苓的活性成分和預測靶點篩選 在BATMAN-TCM[8]網(wǎng)站中分別以“BAN XIA”“SHENG JIANG”“FU LING”為檢索式,調(diào)整“Score cutoff=80”“AdjustedP-value=0.05”,獲取每味中藥的活性成分和潛在作用靶點,排除重復靶點。

1.7.2 胸痹心痛病的相關(guān)靶點篩選 分別以“angina pectoris”“ischemic heart disease”“coronary heart disease”“chest pain”“heartache”為檢索式,在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https：//www.drugbank.ca/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https：//www.omim.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(https：//db.idrblab.net/ttd/)中獲取疾病的相關(guān)靶點,合并并刪除重復靶點。

1.7.3 獲取核心藥物組合與疾病的相關(guān)靶點 使用Venny2.1(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲取核心藥物組合半夏-生姜-茯苓與胸痹心痛病的交集靶點,并繪制韋恩圖。

1.7.4 疾病相關(guān)靶點的相互作用和核心靶點的篩選 將1.7.3獲取的交集靶點導入STRING網(wǎng)站(https：//string-db.org),設(shè)置生物體是“Homo sapiens”,預測靶蛋白的互作關(guān)系(protein-protein interaction,PPI)。通過軟件Cytoscape3.9.1中“Analyze Network”功能對從1.7.3獲得的靶點進行拓撲屬性分析,Degree值取中位數(shù)進行可視化展示,尋找核心靶點。

1.7.5 通路富集分析 利用1.7.3獲得的靶點,采用Metascape網(wǎng)站(https：//metascape.org)進行基因本體(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)富集分析,設(shè)置物種為H.sapiens,富集靶點大于3,P<0.01,各取生物過程(biological process,BP),細胞組成(cellular component,CC),分子功能(molecular function,MF)結(jié)果的前10位,應(yīng)用微生信網(wǎng)站(www.bioinformatics.com.cn)做BP、CC、MF三合一圖。以KEGG通路結(jié)果的Gene In GO And Hit List降序排列,取前20位,應(yīng)用微生信網(wǎng)站做富集氣泡圖。

2 結(jié)果

收錄的6本醫(yī)籍中符合標準的處方共100首,涉及中藥169味,中藥使用總頻次為655次。其中,茯苓的使用頻次為45次,是使用頻次最高的藥物,用方率占45%,用藥率占6.87%。將本次數(shù)據(jù)挖掘中單味中藥使用頻次≥8次的中藥作為高頻中藥,分別是茯苓、半夏、桂枝、生姜等,共計20味,累計使用頻次300次,占總中藥使用頻次的45.8%,具體結(jié)果見表1。

表1 葉天士治療胸痹心痛病的高頻中藥頻次表

2.1 高頻中藥藥性和藥味分析結(jié)果

對納入標準的高頻中藥藥性和藥味進行統(tǒng)計分析,一味中藥有多種性味,則全部統(tǒng)計在內(nèi)。高頻中藥藥性分為溫(6味,30%),微溫(3味,15%),平(5味,25%),寒(4味,20%),微寒(2味,10%)5種。高頻中藥藥味分為苦味(11次,35.48%),甘味(10次,32.26%),辛味(8次,25.81%),酸味(1次,3.23%),淡味(1次,3.23%)。見圖1。

圖1 葉天士治療胸痹心痛病的高頻中藥藥性、藥味雷達圖

2.2 高頻中藥歸經(jīng)和功效分析結(jié)果

依據(jù)分類標準,一味中藥如果有多個歸經(jīng),則全部統(tǒng)計在內(nèi)。高頻中藥歸經(jīng)分為心經(jīng)(12次,18.46%),肺經(jīng)(10次,15.38%),脾經(jīng)(10次,15.38%),肝經(jīng)(9次,13.85%),大腸經(jīng)(7次,10.77%),胃經(jīng)(7次,10.77%),腎經(jīng)(6次,9.23%),膀胱經(jīng)(2次,3.08%),小腸經(jīng)(1次,1.54%),膽經(jīng)(1次,1.54%)。高頻中藥功效分為補虛藥(74次,24.67%),化痰止咳平喘藥(48次,16%),利水滲濕藥(45次,15%),解表藥(44次,14.67%),清熱藥(26次,8.67%),理氣藥(24次,8%),活血化瘀藥(23次,7.67%),化濕藥(8次,2.67%),安神藥(8次,2.67%)。見圖2。

圖2 葉天士治療胸痹心痛病的高頻中藥歸經(jīng)、功效雷達圖

2.3 高頻中藥的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析結(jié)果

設(shè)置最小規(guī)則置信度≥60%,最低條件支持度≥7%,最大前項數(shù)是5,獲得常用藥物組合11項。所得藥物組合由3味藥組成的有3項,由2味藥組成的有8項,具體結(jié)果見表2。其中,中藥使用頻次與點的大小呈正相關(guān),用線條粗細深淺表示藥物關(guān)聯(lián)強弱程度。見圖3。

圖3 葉天士治療胸痹心痛病的高頻中藥配伍網(wǎng)絡(luò)圖

表2 葉天士治療胸痹心痛病的高頻中藥關(guān)聯(lián)規(guī)則分析結(jié)果

2.4 高頻中藥聚類分析結(jié)果

以橫向聚類圖展示,當截距為21,聚為5類時,各類別中藥基本達到穩(wěn)定。聚類分析結(jié)果見表3,聚類譜系圖見圖4。

圖4 葉天士治療胸痹心痛病的高頻中藥聚類分析圖

表3 葉天士治療胸痹心痛病的高頻中藥聚類分析結(jié)果

2.5 因子分析結(jié)果

選用Kaiser-Meyer-Olkin(KMO)取樣適切性量度和巴特利特(Bartlett)球形度檢驗辨別樣本是否適合進行因子分析,對使用頻次≥8次的20味高頻中藥降維分析,得出KMO值為0.550,Bartlett球形度檢驗近似卡方值為389.384,自由度為190,顯著性P<0.001,提示各變量間具有較強的相關(guān)性,可以進行因子分析。

采用主成分分析,最大方差旋轉(zhuǎn)法提取初始特征值大于1的公因子,使用觀測相關(guān)系數(shù)與偏相關(guān)系數(shù),排除小系數(shù),指標大于0.3,提取出符合初始特征值的8個公因子,具體結(jié)果見表4。繪制因子載荷圖和碎石圖。見圖5。

圖5 葉天士治療胸痹心痛病的高頻中藥因子分析的載荷圖與碎石圖

表4 葉天士治療胸痹心痛病的高頻中藥公因子信息

2.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)果

2.6.1 核心藥物組合的活性成分及預測靶點 半夏-生姜-茯苓是關(guān)聯(lián)性最強的一項藥物組合,將其作為核心中藥分析葉天士治療胸痹心痛的潛在機制。使用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫篩選獲得半夏的活性成分有22個,生姜的活性成分有67個,茯苓的活性成分有10個,去除1個重復項“Choline”后共得活性成分98個。篩選獲得半夏預測靶點256個,生姜預測靶點394個,茯苓預測靶點72個,合并去重后獲得核心藥物組合半夏-生姜-茯苓靶點共520個。

2.6.2 疾病的相關(guān)靶點 設(shè)定GeneCards數(shù)據(jù)庫的Relevance score>10,以檢索式在上述4個選定的數(shù)據(jù)庫里分別檢索,合并4個數(shù)據(jù)庫結(jié)果并去重,獲得胸痹心痛病相關(guān)靶點共4 322個。

2.6.3 核心藥物組合與疾病交集靶點 將核心藥物組合半夏-生姜-茯苓的520個靶點與胸痹心痛病的4 322個靶點取交集,見圖6。獲得交集靶點205個,此為核心藥物組合半夏-生姜-茯苓治療胸痹心痛病的關(guān)鍵靶點。

圖6 核心藥物組合-疾病的共同靶點韋恩圖

2.6.4 疾病相關(guān)靶點的相互作用和核心靶點篩選結(jié)果 將2.6.3得到的205個靶點導入STRING網(wǎng)站,PPI分析包括204個節(jié)點,1 668條邊,平均節(jié)點度是16.4,平均局部聚類系數(shù)是0.464,PPI富集P<0.001,提示靶點間相互作用較強。獲取共同作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖,見圖7。將PPI網(wǎng)絡(luò)作用關(guān)系結(jié)果導入Cytoscape3.9.1,由圖8可知,Degree值排名前3的核心靶點分別是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、FOS原癌基因(fos proto-oncogene,FOS)、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)3,其中Degree值最高的是TNF。

圖7 核心藥物組合治療胸痹心痛病共同作用靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖8 核心藥物組合治療胸痹心痛病的靶蛋白互作關(guān)系圖

2.6.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析結(jié)果 GO功能富集結(jié)果得出BP共1 268個條目,主要涉及調(diào)節(jié)血液循環(huán)(regulation of blood circulation)、心臟收縮的調(diào)節(jié)(regulation of heart contraction)、心率調(diào)節(jié)(regulation of heart rate)、心肌細胞收縮(cardiac muscle cell contraction)等; CC共126個條目,主要涉及跨膜轉(zhuǎn)運復合物(transmembrane transporter complex)、質(zhì)膜蛋白復合物(plasma membrane protein complex)、鈣通道復合物(calcium channel complex)、肌纖維膜(sarcolemma)等; MF共207個條目,主要涉及單原子離子門控通道活性(monoatomic ion gated channel activity)、單原子離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性(monoatomic ion transmembrane transporter activity)、被動跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性(passive transmembrane transporter activity)等。BP、CC、MF按排序結(jié)果各選取前10條,見圖9。

圖9 核心藥物組合靶點的GO功能富集分析圖

KEGG通路富集結(jié)果得出171個條目,核心藥物組合靶標基因顯著富集在鈣離子(calcium,Ca2+)和環(huán)狀鳥苷單磷酸酯-蛋白激酶G(cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G,cGMP-PKG)等信號通路。按排序條件選取前20條,見圖10。

圖10 核心藥物組合靶點的KEGG信號通路富集分析氣泡圖

3 討論

《葉天士醫(yī)學全書》集葉天士所編著的醫(yī)學著作于一體,縱觀其記載的胸痹心痛篇諸案,可見葉天士勤求古訓,博采眾長,學習張仲景寶貴治療經(jīng)驗并加以繼承和發(fā)揚,守“陽微陰弦”之病機,以溫通之法消散陰痹,同時重視臟腑間功能協(xié)調(diào)。本文基于上述數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果,對用藥規(guī)律進一步討論,分析新處方組方特色,同時運用網(wǎng)絡(luò)藥理學探討核心藥物組合的潛在通路和靶點,具體結(jié)果如下。

用藥頻次統(tǒng)計顯示,使用頻次最高的是茯苓。茯苓有利尿、降血脂、調(diào)節(jié)胃腸道功能的作用,常被用于治療水腫、痰飲、心悸、心衰和脾虛泄瀉等疾病[9]。細胞凋亡、炎性因子大量釋放是心肌缺血的重要發(fā)生機制[10],而茯苓中的茯苓酸成分有抑制細胞凋亡的功能,桂枝茯苓丸組合方的活性成分能有效抑制炎性因子的釋放[11-13],并且此方中的主要成分桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁皆是本次數(shù)據(jù)挖掘的高頻中藥。高頻中藥的藥性多為溫、平,甚少使用大寒、大熱之品,藥味多甘、苦、辛之品,甘能補、能和緩,苦能燥濕、能泄降氣逆,辛能行氣血、能發(fā)散。入心、肺、脾經(jīng)藥物最多,功效多為補虛、化痰止咳平喘、利水滲濕等。葉天士認為“若夫胸痹,則但因胸中陽虛不運……惟流運上焦清陽為主”。這一觀點繼承了張仲景“陽微陰弦”的思想,因此在用藥上多使用了桂枝、薤白、生姜、人參這類溫陽補氣的藥物來改善心氣不足或心陽虧虛時出現(xiàn)的胸痛癥狀。這既反映了葉天士治療胸痹心痛病用藥多溫補、避免攻伐之性的特色,也與胸痹心痛病的主證和本虛標實的病機相符合?！鹅`樞·本藏》記載“肺大則多飲,善病胸痹,喉痹,逆氣”,證實胸痹與肺中水飲有關(guān),水濕停聚,上犯心肺,氣行失暢,發(fā)為胸痹[14],故用半夏、瓜蔞、茯苓、厚樸化痰散結(jié),行氣祛濕。血脈痹阻,不通則痛,葉天士喜用“活血化瘀法”,桃仁、延胡索、當歸等藥物是養(yǎng)血活血、行氣止痛之品,現(xiàn)代藥理學證明此類藥物能改善心肌缺氧、擴張血管、抗血小板凝集、降低心絞痛的發(fā)作頻率[15]。葉天士治療胸痹心痛病不僅考慮陽虛證候,亦兼顧陰虛之象。若腎陰虧虛,不能濡養(yǎng)五臟之陰,水不涵木,心肝火旺,損傷心陰,心脈失于濡養(yǎng),亦可導致胸痹,因此葉天士常用枸杞子、地黃、白芍、甘草、人參等藥物益氣養(yǎng)陰,滋補肝腎。

關(guān)聯(lián)規(guī)則分析發(fā)現(xiàn)3味藥組成的藥物組合半夏-生姜-茯苓的關(guān)聯(lián)性最強,2味藥組成的藥物組合半夏-生姜關(guān)聯(lián)性最強。半夏、生姜和茯苓這3味藥在《傷寒雜病論》中被視為心系病證的通用藥[16],半夏和生姜組成了“小半夏湯”。孫思邈《千金要方》卷十小半夏湯條方后附記記載“有人常積氣而死,其心上暖,以此半夏湯少許汁入口中遂活”,此積氣即為孫思邈對胸痹的一種稱呼,“積氣而死”指的是胸痹發(fā)作瀕臨死亡,煎服小半夏湯后則可得救。此外生姜可以制約半夏毒性,二者配伍,以半夏為主藥,生姜為輔藥,若加入茯苓,則為小半夏加茯苓湯的組方,有加強燥濕化痰、降逆止嘔的功效,故此方常被使用在心臟移植術(shù)后減輕心臟損傷[17]。

聚類分析可以得出5類藥物組合,根據(jù)功效能總結(jié)為3首新處方。C1(半夏,生姜,苦杏仁,厚樸,薤白,瓜蔞,茯苓)是瓜蔞薤白半夏湯合小半夏加茯苓湯的化裁方,有通陽散結(jié)、祛痰寬胸的功效。C2(白芍,甘草,桂枝)+C4(川楝子,延胡索,桃仁),方中桂枝和甘草溫心陽,白芍、川楝子、延胡索和桃仁養(yǎng)血活血,化瘀止痛。C3(人參,黃連)+C5(當歸,柏子仁,枸杞子,牡丹皮,地黃)是柏子養(yǎng)心湯合清胃散的化裁方,有補氣養(yǎng)血、養(yǎng)陰安神、清臟腑熱的功效。

因子分析與聚類分析結(jié)果大致相同,共得到8個公因子,根據(jù)功效總結(jié)為3首新處方,F1(生姜,半夏,苦杏仁,厚樸,薤白)+F6(人參,瓜蔞)+F7(茯苓)為瓜蔞薤白半夏湯合厚樸生姜半夏甘草人參湯化裁,主通陽散結(jié),健脾消滿,祛痰寬胸;F2(延胡索,川楝子,桃仁)+F3(甘草,白芍,桂枝)主養(yǎng)血活血,疏肝理氣,溫通止痛;F4(枸杞子,當歸,柏子仁)+F5(地黃,牡丹皮)+F8(黃連)能益氣養(yǎng)陰,養(yǎng)血安神。

網(wǎng)絡(luò)藥理學研究結(jié)果顯示,與本病密切相關(guān)的核心靶點是TNF、FOS、NOS3,最核心的靶點可能是TNF。研究發(fā)現(xiàn),TNF在心臟廣泛表達[18],TNF為炎性因子,參與炎癥反應(yīng),它可以調(diào)節(jié)外周阻力和心臟收縮力,當冠心病癥狀改善時,TNF水平降低[19-20]。NOS3又稱一氧化氮合酶3,已被證實多與冠心病發(fā)病有關(guān)[21]。核心藥物組合半夏-生姜-茯苓治療胸痹心痛病的相關(guān)靶點顯著富集的信號通路是鈣離子信號通路和cGMP-PKG信號通路。Ca2+是心肌細胞收縮過程中關(guān)鍵的離子電流,與體內(nèi)多種鈣離子信號通路緊密結(jié)合[22]。研究表明,鈣通道阻滯劑能明顯緩解冠狀動脈痙攣,減輕心絞痛,改善心肌梗死[23]。cGMP由鳥苷酸環(huán)化酶(guanylate cyclase,GC)產(chǎn)生,通過激活下游PKG靶向各種分子來調(diào)節(jié)心肌細胞中的細胞功能,能有效治療伴有心力衰竭的冠心病[24-26],同時活化Ca2+激動冠狀動脈血管平滑肌上K+通道從而調(diào)控血管舒張力[27]。由此可見,核心藥物組合半夏-生姜-茯苓可能通過TNF、FOS、NOS3等靶點對鈣離子信號通路,cGMP-PKG信號通路進行調(diào)控從而發(fā)揮改善胸痹心痛的作用,網(wǎng)絡(luò)藥理學的結(jié)果與現(xiàn)代研究的結(jié)論一致。

本研究通過數(shù)據(jù)挖掘《葉天士醫(yī)學全書》中葉天士治療胸痹心痛病常用處方,結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學,分析葉天士治療胸痹心痛疾病的用藥規(guī)律,得出葉天士治療胸痹心痛病多從溫陽化痰、活血化瘀、益氣養(yǎng)陰3個方面選方用藥,通過關(guān)聯(lián)規(guī)則分析得出核心藥物組合,揭示其潛在靶點和通路,為現(xiàn)代臨床使用中藥治療胸痹心痛病提供了新的組方思路。本研究相關(guān)醫(yī)案收集較少,樣本量稍顯不足,且未記載用藥劑量,今后將進一步深入研究。