王彬彬 高妍夏 郭欣慰 紀(jì)宏亮 王敬 王暉

摘 要 以北柴胡根為試材，采用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法，獲得uingene序列信息，研究分析SSR分布、基元特征，設(shè)計(jì)、驗(yàn)證EST-SSR引物的有效性，為開發(fā)、豐富EST-SSR分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明：從北柴胡根轉(zhuǎn)錄組中共篩選到31 176個(gè)SSR位點(diǎn)，分布于21 732條unigenes，出現(xiàn)的頻率為20.08%，分布密度為3.20個(gè)/10 kb，主要重復(fù)基元類型以二核苷酸最為豐富，共21 056個(gè)，占SSR位點(diǎn)總數(shù)的67.54%；其次是單核苷酸和三核苷酸，分別占總SSR的19.05%和12.07%；四核苷酸～六核苷酸重復(fù)基元數(shù)量均較少。不同核苷酸基序類型共有131種基元，重復(fù)基元次數(shù)在5～11次的數(shù)量最多，占SSR總數(shù)的91.7%，且長(zhǎng)度基本小于15 bp，其中AT/AT和AC/GT這兩種基元在二核苷酸中出現(xiàn)頻率最高。2 064條和1 004條含有SSR位點(diǎn)的unigenes分別注釋到GO和KEGG通路，獲得注釋的基因功能主要與基礎(chǔ)代謝相關(guān)。從 22 090對(duì)具有潛在多態(tài)性的EST-SSR引物中，隨機(jī)挑選20對(duì)引物對(duì)3個(gè)北柴胡種質(zhì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增成功率最高達(dá)85%。北柴胡根轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)豐富、可用性較強(qiáng)，將促進(jìn)柴胡的種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及分子標(biāo)記輔助育種等? 工作。

關(guān)鍵詞 北柴胡；根；轉(zhuǎn)錄組；SSR；位點(diǎn)信息

北柴胡（Bupleurum chinense DC.）屬于傘形科柴胡屬多年生草本植物。目前全世界分布的柴胡屬植物有200余種，中國(guó)有42種、17變種、7變型，占全世界種類的1/5以上［1］。柴胡以根部入藥，有疏散退熱、疏肝解郁、升陽舉氣的功效，用于治療感冒發(fā)熱、寒熱往來、胸脅脹痛、月經(jīng)不調(diào)、子宮脫垂、脫肛等癥狀［2］。近幾年，由于無序性采挖及生態(tài)環(huán)境破壞，野生柴胡已不能滿足市場(chǎng)需求，栽培柴胡已成為最主要的市場(chǎng)供應(yīng)來源。由于栽培柴胡種質(zhì)混雜、異地調(diào)種、種植地域廣，造成其種源混亂、藥材質(zhì)量參差不齊［3-5］，迫切需要對(duì)柴胡不同種質(zhì)進(jìn)行區(qū)分和鑒別，建立統(tǒng)一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，消除柴胡臨床用藥帶來的安全隱患。目前關(guān)于柴胡藥材化學(xué)成分［6-7］、藥理藥效［8-9］等方面的研究較多，柴胡種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)、分子標(biāo)記輔助育種的研究則較少。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）? 標(biāo)記是一類長(zhǎng)度一般不超過200 bp、由? 1～6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的一類短串聯(lián)重復(fù)序列，因其具有多態(tài)性高、共顯性和重復(fù)性好以及屬間和屬內(nèi)種間保守性的特點(diǎn)，使其成為目前常用的分子標(biāo)記之一［10］。目前，SSR標(biāo)記已應(yīng)用在多種藥用植物如黃地老虎 ［11］、多花黃精［12］、半夏［13］、黃連［14］、杜仲［15］等的遺傳多樣性研究。雖然在柴胡屬植物中已開發(fā)出一些SSR標(biāo)記［16-20］，但目前可利用的SSR標(biāo)記仍較少，不能滿足當(dāng)前在柴胡屬植物間進(jìn)行親緣關(guān)系及遺傳多樣性分析等方面的需要。

本研究以北柴胡根為材料進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，基于測(cè)序數(shù)據(jù)，挖掘SSR位點(diǎn)并分析其分布及組成特征，同時(shí)將含有SSR位點(diǎn)的基因在GO、KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋，為柴胡遺傳多樣性分析、優(yōu)良種質(zhì)篩選以及品種選育等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2021年8月至12月進(jìn)行，供試材料為北柴胡品種‘ZC2，將種子用清水反復(fù)淘洗，除去雜質(zhì)及未成熟種子，蒸餾水浸泡12 h后撈出備用。將營(yíng)養(yǎng)土撒在32孔穴盤中，壓實(shí)澆透水，每孔放入10粒種子，覆土約1 mm，蓋上透明蓋，置于人工氣候箱（溫度：25 ℃，光照度為5 000 lx，晝16 h/夜8? h），每3 d噴水1次，種子出苗后，每孔只留1株幼苗，待其進(jìn)入5葉期時(shí)，進(jìn)行低溫? （4 ℃）處理，在處理0 d、1 d、3 d后分別收集根部，每5株隨機(jī)混合為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，蒸餾水清洗根部后用錫箔紙包裹，迅速投入液氮速凍并保存于-80 ℃，備用。

從北柴胡‘ZC2植株采集健康、無病蟲害葉片1～2片；從中國(guó)醫(yī)學(xué)院科學(xué)院藥用植物研究所試驗(yàn)地采集陜西種質(zhì)（簡(jiǎn)稱S′X，下同）、山西種質(zhì)（簡(jiǎn)稱SX，下同）北柴胡植株的健康、無病蟲害葉片1～2片，上述材料均保存于-20 ℃。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

將‘ZC2根部樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司，使用Illumina NovaSeq 6000測(cè)序儀（illumina，USA）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等工作。

1.3 SSR位點(diǎn)篩選

將組裝得到的unigene作為參考序列，使用MISA（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa）軟件搜索SSR位點(diǎn)，軟件參數(shù)設(shè)置：?jiǎn)?、二、三、四、五、六核苷酸SSR最少重復(fù)次數(shù)依次為10、6、5、5、5、5；獲得SSR類型、出現(xiàn)頻率、分布平均距離等信息。

1.4 含SSR位點(diǎn)的unigene 功能分析

將unigene進(jìn)行功能注釋和富集分類分析；注釋數(shù)據(jù)庫選擇KEGG （https：//www.genome.jp/kegg）和GO （http：//geneontology.org），對(duì)比參數(shù)為 e＜1×10-10。

1.5 SSR引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

使用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)引物，隨機(jī)挑選20對(duì)，由北京文達(dá)通科科技有限公司合成。使用通用基因組DNA提取試劑盒（Solarbio，D2100）提取3種北柴胡種質(zhì)（ZC2、S′X、SX）葉片DNA。PCR擴(kuò)增體系：1 μL 50 ng·μL-1 DNA模板，10 μL 2×Taq Master Mix，10 μmol·L-1正反向引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸? 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分析并制表，使用Origin 2022b軟件的對(duì)應(yīng)作圖模塊繪制三維柱狀圖、二維餅狀圖、雙Y軸圖等。

2 結(jié)果與分析

2.1 北柴胡根轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)數(shù)量和分布

北柴胡根部轉(zhuǎn)錄組測(cè)序組裝得到108 247條unigenes，序列總長(zhǎng)為97 514 625? bp。共檢測(cè)到31 176個(gè)SSR位點(diǎn)，分布于21 732條unigenes，平均每3 128 bp出現(xiàn)1個(gè)SSR，分布密度為3.20個(gè)/10 kb，SSR位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率為20.08%，其中有6 500條unigenes含有1個(gè)以上的SSR位點(diǎn)，含復(fù)合型 SSR 序列數(shù)為3 804個(gè)（表1）。SSR位點(diǎn)的分布特征表明，根轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)較為豐富，其主要重復(fù)基元類型以二核苷酸為主，占SSR位點(diǎn)總數(shù)的67.54%，出現(xiàn)頻率為19.45%；其次是單核苷酸和三核苷酸，分別占總SSR數(shù)的19.05%和12.07%，出現(xiàn)頻率依次為5.49%和3.48%；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)基元類型數(shù)量較少，分別占總SSR數(shù)的0.89%、? 0.14%和 0.31%。不同類型SSR的平均距離則與出現(xiàn)頻率相反，二核苷酸類型平均距離最小，相距4.63 kb；五核苷酸類型平均距離最大，相距? 2 267.78 kb（表2）。

2.2 北柴胡根轉(zhuǎn)錄組SSR基序重復(fù)類型和頻率特征

北柴胡根轉(zhuǎn)錄組不同類型SSR重復(fù)次數(shù)出現(xiàn)的頻率差異較大，隨著各基元重復(fù)次數(shù)的增加SSR 位點(diǎn)數(shù)量逐漸降低（表3；圖1）。SSR位點(diǎn)重復(fù)基元次數(shù)在5～11次的數(shù)量最多，占SSR總數(shù)的91.7%，其中，重復(fù)次數(shù)6次的SSR位點(diǎn)數(shù)（6 171個(gè)）最多，占總數(shù)的19.79%；其次是重復(fù)次數(shù)為10次（5 314個(gè)），占SSR總數(shù)的17.05%。單核苷酸重復(fù)次數(shù)均大于10次，所占比例為? 19.05%，其中重復(fù)次數(shù)10～14次的頻率較高；二核苷酸重復(fù)次數(shù)的變化范圍均大于6次，所占比例為67.54%，其中重復(fù)次數(shù)6～12次的頻率較高；三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)次數(shù)的變化范圍均大于4次，占SSR總數(shù)的比例分別為12.07%、0.89%、0.14%和0.31%，其中三核苷酸重復(fù)次數(shù)5～10次的頻率最高，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)次數(shù)較少，重復(fù)次數(shù)5～7次的頻率均最高。

2.3 北柴胡根轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)基序類型分析

北柴胡根轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)中共有131種基元，每種核苷酸含有多種基序類型（表4，圖2）。單核苷酸基序類型以A/T為主，有5 799個(gè)，占SSR總數(shù)的18.60%，基序C/G出現(xiàn)頻率很低；二核苷酸基序類型有4種，以AT/AT為主，有? 12 517個(gè)，占SSR總數(shù)的40.15%，占二核苷酸基序類型的59.40%，其次為AC/GT（6 339個(gè)）、AG/CT（2 141個(gè)）和CG/CG（59個(gè)），分別占SSR總數(shù)的20.33%、6.87%和0.19%。三核苷酸基序類型有10種，以ATC/ATG（686個(gè)）為主，占SSR總數(shù)的2.20%。四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸基序的重復(fù)類型比較多，依次有26、30和59種，但其重復(fù)基元的個(gè)數(shù)在總數(shù)中所占比例較小，以ACAT/ATGT、AAAAT/ATTTT、ACTGGC/AGTGCC為主，分別占SSR總數(shù)的0.36%、0.01%和0.02%。

2.4 北柴胡根轉(zhuǎn)錄組SSR的可用性評(píng)價(jià)

研究表明，SSR位點(diǎn)的基序長(zhǎng)度≥20 bp 時(shí)，其多態(tài)性較高；長(zhǎng)度為12～19 bp時(shí)，SSR多態(tài)性明顯下降；長(zhǎng)度<12 bp時(shí)，其多態(tài)性極低［20］。北柴胡根轉(zhuǎn)錄組SSR基序長(zhǎng)度分布范圍在10～360 bp，其中，基序長(zhǎng)度在10～11 bp的低多態(tài)性SSR位點(diǎn)有3 223個(gè)，占11.77%；長(zhǎng)度在12～19 bp之間的中度多態(tài)性SSR位點(diǎn)有14 632個(gè)，占? 53.45%；長(zhǎng)度≥20 bp的高度多態(tài)性SSR位點(diǎn)有? 9 518個(gè)，占34.77%，說明可以從該轉(zhuǎn)錄組中開發(fā)出具有高度多態(tài)性的SSR引物；當(dāng)基序長(zhǎng)度≥12 bp時(shí)，SSR分布頻率隨著基序長(zhǎng)度的增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖3）。

2.5 北柴胡根轉(zhuǎn)錄組含有SSR位點(diǎn)的unigene的功能注釋

將含有SSR位點(diǎn)的21 732條序列在GO、KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)和功能預(yù)測(cè)，分別有2 064和1 004條unigenes注釋到GO、KEGG數(shù)據(jù)庫。

GO功能注釋結(jié)果表明，含SSR的unigenes被注釋到44個(gè)功能組，分布于分子功能、細(xì)胞組分和生化過程3個(gè)類別（圖4）。在分子功能類別中，789條unigenes得到注釋，注釋結(jié)果主要包括序列特異性DNA結(jié)合，泛素-蛋白轉(zhuǎn)移酶活性，蛋白質(zhì)二聚化活性。在細(xì)胞成分類別中，558條unigenes得到注釋，注釋結(jié)果主要包括核仁和后期促成熟復(fù)合物。在生化過程類別中，717條unigenes得到注釋，注釋結(jié)果主要包括蛋白質(zhì)泛素化和DNA復(fù)制啟動(dòng)。

KEGG代謝通路分析中，含SSR的unigenes被注釋到17個(gè)代謝通路，其中168條unigenes注釋到了植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，此通路注釋到的基因最多，占16.73%；其次是mRNA監(jiān)控通路、植物MAPK信號(hào)通路和NOD樣受體信號(hào)通路，分別有103條（10.26%）、97條（9.66%）和93條（9.26%）。

2.6 EST-SSR引物的設(shè)計(jì)及驗(yàn)證

22 090條unigenes設(shè)計(jì)得到66 270對(duì)EST-SSR特異性引物，從中隨機(jī)篩選出20對(duì)不同SSR重復(fù)類型的引物用于引物的通用性和多態(tài)性評(píng)價(jià)（表5）。隨機(jī)挑選的20對(duì)引物在S′X、ZC2和SX中依次有14、15和17對(duì)擴(kuò)增成功，擴(kuò)增成功率分別為70%、75%和85%，其中13對(duì)引物在3個(gè)樣品中均擴(kuò)增成功，3對(duì)引物均沒有擴(kuò)增成功，其余4對(duì)引物呈現(xiàn)一定的多態(tài)性（圖6），初步表明上述SSR引物可靠性較好，且在3種北柴胡種質(zhì)之間通用。

3 結(jié)論與討論

通過北柴胡根部轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得108 247條unigenes，MISA軟件共檢測(cè)到31 176個(gè)SSR位點(diǎn)，分布于21 732條unigenes上，平均每3.13 kb出現(xiàn)1個(gè)SSR，即平均分布距離為3.13 kb，SSR位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率為20.08%，表明北柴胡轉(zhuǎn)錄組中SSR數(shù)量較為豐富。柴胡種間相比，SSR的出現(xiàn)頻率會(huì)有所差異，柴胡種子轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的244 194條unigenes中共鑒定出29 898個(gè)SSR位點(diǎn)，SSR的出現(xiàn)頻率為12.24%，平均分布距離為6.46 kb［19］，這種差異可能與取材器官部位、建庫軟件等因素不同有關(guān)。與其他藥用植物相比，北柴胡轉(zhuǎn)錄組SSR出現(xiàn)頻率高于黃精? （9.73%）［12］、野三七（6.99%）［21］、金釵石斛? （12.90%）［22］，低于蒙古黃芪（31.26%）［23］、黃秦艽（30.73%）［24］、萬壽菊（28.29）［25］等。SSR 出現(xiàn)的平均距離低于杜仲（1.75 kb）［15］、苦蕎（3.04 kb）［26］、萬壽菊（2.51 kb）［25］，高于膜莢黃芪（7.97 kb）［27］、太子參（14.7 kb）［28］、云黃連（9.48 kb）［14］。由此可見，不同物種轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)存在明顯差異，這可能與物種自身有關(guān)，還可能與轉(zhuǎn)錄組中unigene數(shù)量和長(zhǎng)度、SSR篩選條件等有關(guān)［29］。

SSR重復(fù)基元類型是轉(zhuǎn)錄組的重要特征之一。研究表明，多數(shù)植物SSR位點(diǎn)的重復(fù)類型主要以二核苷酸和三核苷酸為主，但不同物種中重復(fù)基元類型及所占的比例會(huì)有所差異［10］。本研究中，北柴胡根部轉(zhuǎn)錄組SSR以二核苷酸重復(fù)為主，占SSR總數(shù)的67.54%，其次是單核苷酸? （19.05%）和三核苷酸（12.07%）類型，其中二核苷酸重復(fù)基元以AT/AT（12 517個(gè)）為主，占SSR總數(shù)的40.15%；三核苷酸以ATC/ATG（686個(gè)）為主，占SSR總數(shù)的2.20%，這與三島柴胡全基因組、北柴胡種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得到的結(jié)果相一致［17，19］，即SSR位點(diǎn)均以二核苷酸重復(fù)為主。在不同物種中，多花黃精（53.14%）［12］、野三七? （52.52%）［21］以二核苷酸重復(fù)為主，與本研究結(jié)果相一致；而人參果（58.78%）［30］、蒙古黃芪（31.26%）［23］以單核苷酸為主；裸花紫珠［31］以單核苷酸和二核苷酸為主；蘇丹草［32］、黃地老虎［11］以單核苷酸和三核苷酸為主，藍(lán)玉簪龍膽（54.7%）［33］、亞麻（60.1%）［34］以三核苷酸為主；半夏［13］、蒙藥冷蒿［35］以二核苷酸和三核苷酸為主，上述研究結(jié)果表明，SSR位點(diǎn)的重復(fù)基元類型在不同物種間的分布有較大差異。此外，北柴胡轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)中，長(zhǎng)度在20 bp 以上的有9518個(gè)，占 SSR總數(shù)的34.77%，這部分多態(tài)性能比較高的 SSR 可能具有較高的應(yīng)用價(jià)值。本研究隨機(jī)挑選的20對(duì)引物，在3種北柴胡種質(zhì)中擴(kuò)增成功率為70% ～85%，有13對(duì)引物在3個(gè)樣品中擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度與預(yù)期相符，4對(duì)引物呈現(xiàn)一定的多態(tài)性，說明開發(fā)的北柴胡基因組SSR引物具有較強(qiáng)的可用性。

本研究從北柴胡根轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘到大量的SSR位點(diǎn)，并對(duì)其基元特征、分布、出現(xiàn)頻率等進(jìn)行分析，并進(jìn)行了初步的可用性驗(yàn)證；不僅豐富了柴胡種質(zhì)鑒定的SSR位點(diǎn)，同時(shí)可以為柴胡遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記開發(fā)及分子輔助育種提供一定理論參考。

參考文獻(xiàn) Reference：

［1］ ZHANG G，WANG H，SHI L，et al.Identification of the original plants of cultivated Bupleuri Radix based on DNA barcoding and chloroplast genome analysis［J］.PEERJ，2022，10：e13208.

［2］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部［M］.北京：? 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：293.

Chinese Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China：Vol.1［M］.Beijing：China Medical Science and Technology Press，2020：293.

［3］ 石麗霞，李 科，秦雪梅，等.基于糖特征圖譜的不同柴胡的品種鑒別［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2020，55（12）：2968-2975.

SHI L X，LI K，QIN X M，et al.Identification of different Bupleurum varieties based on carbohydrate-specific chromatograms［J］.Acta Pharmaceutica Sinica，2020，55（12）：2968-2975.

［4］ 劉照東，楊林林，張 陽，等.不同產(chǎn)地北柴胡中柴胡皂苷含量與土壤因子的關(guān)系［J］.中草藥，2020，51（20）：5328-5336.

LIU ZH D，YANG L L，ZHANG Y，et al.Effects of soil factors on saikosaponin content of Bupleurum chinense in different habitats［J］.Chinese Traditional and Herbal Drugs，2020，51（20）：5328-5336.

［5］ 韓文靜，萬河妨，劉海軍，等.不同產(chǎn)區(qū)來源柴胡的農(nóng)藝性狀及品質(zhì)比較［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2022，38（13）：77-83.

HAN W J，WAN H F，LIU H J，et al.Comparative study on agronomic traits and quality of cultivated Chinese Thorowax root from different? producing areas［J］.Chinese Agricultural Science Bulletin，2022，38（13）：77-83.

［6］ 侯會(huì)平，趙士博，于康平，等.北柴胡不同產(chǎn)地、不同采收期和不同炮制品中6種柴胡皂苷的含量測(cè)定［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2018，53（11）：1887-1893.

HOU H P，ZHAO SH B，YU K P，et al.Determination of six saikosaponins in Bupleurum chinense DC.samples collected from different producing areas at different harvest time with different processing methods［J］.Acta Pharmaceutica Sinica，2018，53（11）：1887-1893.

［7］ 李文斌，劉長(zhǎng)利，安立成，等.野生北柴胡根與根莖中化學(xué)成分比較研究［J］.環(huán)球中醫(yī)藥，2018，11（1）：58-63.

LI W B，LIU CH L，AN L CH，et al.Comparative studies on chemical constituents of root and rhizome of wild Bupleurum chinense DC.［J］.Global Traditional Chinese Medicine，2018，11（1）：58-63.

［8］ 竇增花，李虎業(yè)，趙鵬飛.中藥柴胡疏肝散加減治療慢性胰腺炎對(duì)胰腺外分泌功能及胰腺纖維化的影響研究［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2022，? 17（2）：398-401.

DOU Z H，LI H Y，ZHAO P F.Influence of chaihu shugan powder on pancreatic exocrine function and pancreatic fibrosis in treating chronic pancreatitis［J］.World Journal of Integrated Traditional and Western Medicine，2022，? 17（2）：398-401.

［9］ 秦雪梅，高 耀，田俊生，等.從柴胡藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)到抗抑郁新藥開發(fā)的研究思路與策略［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2019，54（8）：1402-1408.

QIN X M，GAO Y，TIAN J SH，et al.Ideas and strategies from quality evaluation of Radix Bupleurum?? for development of new anti-depressant drugs［J］.Acta Pharmaceutica Sinica，2019，54（8）：1402-1408.

［10］WANG L M，JIAO S J，JIANG Y X，et al.Genetic diversity in parent lines of sweet sorghum based on agronomical traits and SSR markers［J］.Field Crops Research，2013，149：11-19.

［11］ 常 虹，高 燕，王思威，等.基于黃地老虎轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的SSR和SNP特征分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，49（2）：118-125.

CHANG H，GAO Y，WANG S W，et al.Analysis of SSR and SNP? loci in Agrotis segetum based on transcriptome sequencing［J］.Guangdong Agricultural Sciences，2022，49（2）：118-125.

［12］ 陳友吾，廖榮俊，葉碧歡，等.多花黃精轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)分析及分子標(biāo)記開發(fā)［J］.中草藥，2020，51（1）：182-189.

CHEN Y W，LIAO R J，YE B H，et al.Analysis on SSR loci in transcriptome and development of molecular markers in Polygonatum cyrtonema［J］.Chinese Traditional and Herbal Drugs，2020，51（1）：182-189.

［13］ 王 森，張 震，姜倪皓，等.半夏轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點(diǎn)信息分析［J］.中藥材，2014，37（9）：1566- 1569.

WANG S，ZHANG ZH，JIANG N H，et al.SSR information in transcriptome of Pinellia ternata［J］.Journal of Chinese Medicinal Materials，2014，37（9）：1566-1569.

［14］ 叢 琨，楊生超，張廣輝，等.兩種黃連轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)信息分析與多態(tài)性引物開發(fā)［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2018，37（5）：192-200.

CONG K，YANG SH CH，ZHANG G H，et al.SSR loci information analysis and polymorphism primers development in two kinds of Coptidis transcriptome［J］.Genomics and Applied Biology，2018，37（5）：192-200.

［15］ 吳 敏，杜紅巖，烏云塔娜，等.杜仲基因組微衛(wèi)星特征及SSR標(biāo)記開發(fā)［J］.林業(yè)科學(xué)研究，2015，28（3）：387-393.

WU M，DU H Y，WUYUN? T N，et al.Characterization of genomic microsatellites and development of SSR markers of eucommia ulmoides［J］.Forest Research，2015，28（3）：387-393.

［16］ 戰(zhàn)晴晴，隋 春，魏建和，等.利用ISSR和SSR分子標(biāo)記構(gòu)建北柴胡遺傳圖譜［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45（4）：517-523.

ZHAN Q Q，SUI CH，WEI J H，et al.Construction of genetic linkage map of Bupleurum chinense DC.using ISSR and SSR markers［J］.Acta Pharmaceutica Sinica，2010，45（4）：517-523.

［17］ 朱楚然，徐 嬌，都明理，等.三島柴胡基因組Survey分析及SSR位點(diǎn)挖掘［J］.中國(guó)中藥雜志，2019，44（18）：3960-3966.

ZHU CH R，XU J，DU M L，et al.Genome survey analysis and SSR loci mining of Bupleurum falcatum［J］.China Journal of Chinese Materia Medica，2019，44（18）：3960-3966.

［18］ 吳素瑞，高 珂，趙立子，等.利用SSR分子標(biāo)記鑒別柴胡栽培種質(zhì)的方法學(xué)研究［J］.世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2015，17（9）：1806-1812.

WU S R，GAO K，ZHAO L Z，et al.Studies on identification of Bupleurum? cultivated germplasm using SSR molecular markers［J］.Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Materia-World Science and Technology，2015，17（9）：1806-1812.

［19］ 劉 迪，歐陽艷飛，徐 鵬，等.柴胡轉(zhuǎn)錄組SSR的分布及序列特征分析［J］.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2022，53（3）：676-683.

LIU D，OUYANG Y F，XU P，et al.Analysis of SSR distribution and sequence characteristics of Bupleurum chinense DC.transcriptome［J］.Journal of Southern Agriculture，2022，53（3）：676-683.

［20］ TEMNYKH S，DECLERCK G，LUKASHOVA A.Computational and experimental analysis of microsatellites in rice（Oryza sativa L.）：frequency，length variation.transposon associations and genetic marker potential［J］.Genome Research，2001，11（8）：1441-1452.

［21］ 李翠婷，張廣輝，馬春花，等.野三七轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)信息分析及其多態(tài)性研究［J］.中草藥，2014，45（10）：1468-1472.

LI? C T，ZHANG G H，MA CH H，et al.Analysis on SSR loci information in transcriptome of Panax vienamensis var. fuscidiscus? and its polymorphism［J］.Chinese Traditional and Herbal Drugs，2014，45（10）：1468-1472.

［22］ 李 清，李 標(biāo)，郭順星.金釵石斛轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)信息分析［J］.中國(guó)中藥雜志，2017，42（1）：63-69.

LI Q，LI B，GUO SH X.SSR information in transcriptome of Dendrobium nobile［J］.China Journal of Chinese Materia Medica，2017，42（1）：63-69.

［23］ 賀潤(rùn)麗，韓毅麗，王 芳，等.蒙古黃芪轉(zhuǎn)錄組SSR標(biāo)記開發(fā)及遺傳多樣性研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2018，43（9）：1838-1843.

HE R L，HAN Y L，WANG F，et al.Analysis on SSR information in transcriptome of Astragalus membranaceus var.mongholicus and its polymorphism［J］.China Journal of Chinese Materia Medica，2018，43（9）：1838-1843.

［24］ WANG L，WANG Z，CHEN J，et al.De novo transcriptome assembly and development of novel microsatellite markers for the traditional Chinese medicinal herb，Veratrilla baillonii Franch （Gentianaceae） ［J］.Evolutionary Bioinformatics，2015，11（S1）：39-45.

［25］ 張華麗，叢日晨，王茂良，等.基于萬壽菊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的SSR標(biāo)記開發(fā)［J］.園藝學(xué)報(bào)，2018，45（1）：159- 167.

ZHANG H L，CONG R CH，WANG M L，et al.Development of SSR molecular markers based on transcriptome sequencing of Tagetes erecta［J］.Acta Horticulturae Sinica，2018，45（1）：159- 167.

［26］ 蔡齊宗，王佳蕊，陳慶富，等.苦蕎全基因組SSR位點(diǎn)鑒定及分子標(biāo)記開發(fā)［J］.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，56（3）：392-400.

CAI Q Z，WANG J R，CHEN Q F，et al.Identification of SSR loci and molecular marker development in the whole genome of Tartary buckwheat［J］.Journal of Henan Agricultural University，2022，56（3）：392-400.

［27］ 常 越，閆 嵩，劉振鵬，等.膜莢黃芪的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量評(píng)估及其SSR位點(diǎn)信息分析的研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2016，41（8）：1430-1434.

CHANG Y，YAN S，LIU ZH P，et al.Study on quality?? evaluation of sequence and SSR information in transcriptome of Astragalus membranacus［J］.China Journal of Chinese Materia Medica，2016，41（8）：1430-1434.

［28］ 韋德群，周 濤，江維克，等.太子參轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)信息分析及其多態(tài)性分析［J］.分子植物育種，2018，16（23）：7754 -7759.

WEI D Q，ZHOU T，JIANG W K，et al.Analysis on SSR loci information in transcriptome of Pseudostellaria heterophylla and its polymorphism［J］.Molecular Plant Breeding，2018，16（23）：7754 -7759.

［29］ BISWAS M K，CHAI L，MAYER C，et al.Exploiting BAC-end sequences for the mining，characterization and?? utility of new short sequences repeat （SSR） markers in Citrus［J］.Molecular Biology Reports，2012，39（5）：5373-5386．

［30］ 陳姝欣，朱浩東，楊夢(mèng)思，等.基于人參果轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的SSR和SNP特征分析［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2020，33（11）：2412-2416.

CHEN SH X，ZHU H D，YANG M S，et al.Evaluation of SSR and SNP loci in Solanum muricatumbased on transcriptome［J］.Southwest China Journal of Agricultural Sciences，2020，33（11）：2412-2416.

［31］ 于福來，黃 梅，張影波，等.裸花紫珠基因組調(diào)研及SSR特征分析［J］.中國(guó)中藥雜志，2019，44（18）：3974-3978.

YU F L，HUANG M，ZHANG Y B，et al.Genome survey and characteristic analysis of SSR in Callicarpa nudiflora［J］.China Journal of Chinese Materia Medica，2019，? 44（18）：3974-3978.

［32］ 朱永群，彭丹丹，林超文，等.蘇丹草轉(zhuǎn)錄組SSR分子標(biāo)記開發(fā)及遺傳多樣性評(píng)價(jià)［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2018，27（5）：178-189.

ZHU Y Q，PENG D D，LIN CH W，et al.Development of SSR markers based on transcriptome sequence and analysis of genetic diversity in Sorghum sudanense［J］.Acta Prataculturae Sinica，2018，27（5）：178-189.

［33］ 田尊哲，高慶波，陳世龍，等.基于高通量測(cè)序分析青藏高原特有植物藍(lán)玉簪龍膽的SSR和SNP特征［J］.植物研究，2016，36（5）：747-752.

TIAN Z ZH，GAO Q B，CHEN SH L，et al.Characteristics of SSR and SNP in Gentiana veitchiorum? in Qinghai-Tibetan Plateau，by high-throughput sequencing［J］.Bulletin of Botanical Research，2016，36（5）：747-752.

［34］ 龍松華，李 翔，鄧 欣，等.亞麻EST-SSR信息分析與標(biāo)記開發(fā)［J］.武漢植物學(xué)研究，2010，28（5）：634-638.

LONG S H，LI X，DENG X，et al.Flax （Linum sitatissimum L.） EST-SSR information analysis and marker development［J］.Journal of Wuhan Botanical Research，2010，28（5）：634-638.

［35］ 岳春江，陳川川，郭鳳仙，等.蒙藥冷蒿轉(zhuǎn)錄組SSR信息分析［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2016，18（6）：31-43.

YUE CH J，CHEN CH CH，GUO F X，et al.Data mining of simple sequence repeats in transcriptome sequences of mongolia medicinal plant Artemisia frigidawilld［J］.Journal of Agricultural Science and Technology，2016，18（6）：31-43.

SSR Loci Analysis Using High-throughput Transcriptome Sequencing in Roots of? Bupleurum chinense

Abstract This study aimed to investigate the distribution and motif characteristic of SSR loci of unigenes in Bupleurum chinense DC by using high-throughput RNA-seq technology.Furthermore，EST-SSR primers were designed and the validity of these primers was evaluated to provide a foundation for enriching and developing? valuable molecular markers.The results indicated that a total of 31 176 SSR loci were? identified from 21 732? unigenes，with an SSR? occurrence frequency of 20.08% and an SSR density of 3.20 SSRs per 10 kb.As the predominant repeat type，di-nucleotide repeats accounted for?? 67.54% （21 056） of the? SSR loci，followed by the mono-nucleotide? and tri-nucleotide types，accounting for 19.05% and 12.07%，respectively.Tetra-nucleotide，penta-nucleotide and hexa-nucleotide repeat types had a lower proportion.One hundred and thirty-one repeat motifs were detected in? the transcriptome data.Most of the SSR repeat number （91.7%）ranged from 5 to 11，and the length was less than 15 bp.Among the di-nucleotide motif types，the AT/AT and AC/GT motifs were the most abundant-type.Moreover，2 064 and 1 004 SSR-containing unigenes were functionally annotated by using Gene Ontology and KEGG pathways，respectively.Furthermore，those unigenes were involved inbasal metabolism.Furthermore，20 pairs of primers were designed and evaluated for PCR amplification ofthree B.chinense DC.Germplasms，with an amplification success rate of 85%.Overall，these results suggest that SSR loci are abundant and versatile in B.chinense DC，and can be utilized to accelerate the process of germplasm evaluation and molecular marker-assisted breeding.

Key words Bupleurum chinense; Root; Transcriptome; SSR; Loci information