汪文君 劉國(guó)慶 王志花

汪文君，劉國(guó)慶，王志花. 玉米秸稈降解復(fù)合菌系的篩選及發(fā)酵產(chǎn)短鏈脂肪酸［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，63（2）：55-58．

摘要：利用篩選得到的復(fù)合菌系來(lái)發(fā)酵玉米秸稈，研究復(fù)合菌系對(duì)降解秸稈產(chǎn)短鏈脂肪酸的影響，并對(duì)微生物菌群結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行解析。結(jié)果表明，復(fù)合菌系在前4 d的降解速度最快，秸稈、纖維素和木質(zhì)素的降解率分別達(dá)30.35%、27.07%和14.71%，在12 d時(shí)，其降解率分別達(dá)40.02%、32.25%和20.93%。復(fù)合菌系的代謝產(chǎn)物以異丁酸和乙酸為主，其含量分別占總短鏈脂肪酸的36.46%和33.15%。由高通量測(cè)序可知，復(fù)合菌系中的優(yōu)勢(shì)菌屬主要由Clostridium sensu stricto、Cellulosilyticum、Clostridium XIVa、Enterobacteriaceae和Peptostreptococcaceae等組成。

關(guān)鍵詞：玉米秸稈； 復(fù)合菌； 篩選； 降解； 短鏈脂肪酸

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939.9? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）02-0055-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.02.010 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Screening of maize stover degradation complex strains and fermentation to produce short-chain fatty acids

WANG Wen-jun， LIU Guo-qing， WANG Zhi-hua

（School of Food and Biological Engineering， Hefei University of Technology， Hefei? 230601，China）

Abstract： The compound strains obtained by screening were used to ferment corn straw， the effects of the compound strains on degrading straw to produce short-chain fatty acids were studied， and the structural composition of the microbial consortium was analyzed. The results showed that the degradation rate of the compound strain was the fastest in the first 4 days. The degradation rates of straw， cellulose and lignin reached 30.35%， 27.07% and 14.71%， respectively. At 12 days， the degradation rates reached 40.02%， 32.25% and 20.93%， respectively. The metabolites of the compound strain were isobutyric acid and acetic acid， which accounted for 36.46% and 33.15% of the total short chain fatty acids， respectively. According to high-throughput sequencing， the dominant bacteria genera in the compound strains were mainly composed of Clostridium sensu stricto， Cellulosilyticum， Clostridium XIVa， Enterobacteriaceae and Peptostreptococcaceae.

Key words： corn straw； compound bacteria； screening； degradation； short chain fatty acids

中國(guó)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國(guó)，農(nóng)作物秸稈種類(lèi)繁多，占國(guó)內(nèi)生物質(zhì)資源總量的50%以上^［1］。以水稻、小麥和玉米秸稈為主，其中，36.7%為玉米秸稈，在所有秸稈中占最大部分，這可能與中國(guó)大部分地區(qū)主要農(nóng)作物是玉米相關(guān)^［2］。纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素含有極為豐富的碳元素、較低的氧含量，故其能量密度較高，是玉米秸稈的主要組成成分，若能將其合理并高效利用，將是一種極好的生物能源^［3］。因此如何提高秸稈的綜合利用率成為全社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。

厭氧發(fā)酵是秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物高值化利用的有效技術(shù)手段，該方法的實(shí)質(zhì)是厭氧微生物將有機(jī)廢棄物降解為低分子量化合物，在發(fā)酵過(guò)程中獲得沼氣等可燃性能源氣體以及富含有效營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和穩(wěn)定腐殖質(zhì)的產(chǎn)品^［4，5］。但秸稈產(chǎn)沼氣工藝存在降解率低、降解周期長(zhǎng)及成本投資高等缺陷^［6-8］。而秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acids， SCFAs）工藝，因其發(fā)酵周期短、經(jīng)濟(jì)效益高等顯著優(yōu)勢(shì)成為極具前景的新型高值化利用方向^［9］。SCFAs是一種由6個(gè)或6個(gè)以下碳原子組成的短鏈單羧酸。常見(jiàn)的SCFAs有乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和丁酸乙酯等^［10］。在厭氧發(fā)酵過(guò)程中，添加甲烷菌抑制劑可使得產(chǎn)甲烷菌停止作用，SCFAs則無(wú)法被轉(zhuǎn)換為甲烷，從而可獲得高濃度的SCFAs^［11］。這些酸具有廣泛的應(yīng)用，如生產(chǎn)醇、醚等化工原料，替代不可再生的化石資源^［12］。此外，有研究報(bào)道SCFAs在維持人類(lèi)健康方面具有非常特定的功能，影響各種疾病的發(fā)展、預(yù)防和治療^［13］。

本研究從污泥中篩選得到能高效降解玉米秸稈的復(fù)合菌系，通過(guò)高通量測(cè)序，明確該復(fù)合菌系的優(yōu)勢(shì)菌屬組成，同時(shí)對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物即短鏈脂肪酸進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米秸稈取自安徽省阜陽(yáng)市農(nóng)場(chǎng)，烘干粉碎后過(guò)30目篩網(wǎng)，密封常溫保存。

復(fù)合菌系是由合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室從污泥中篩選得到。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基

1）富集培養(yǎng)基：氯化銨1 g/L、磷酸氫二鉀0.4 g/L、磷酸二氫鉀0.4 g/L、氯化鎂1 g/L、酵母膏1 g/L，指示劑為刃天青和L-半胱氨酸，培養(yǎng)基的pH為7.0～7.2。

2）厭氧產(chǎn)酸菌培養(yǎng)基：氯化銨1 g/L、氯化鎂1 g/L、磷酸二氫鉀0.4 g/L、酵母膏1 g/L、氯化鈉1 g/L、葡萄糖8 g/L，溴甲酚紫指示劑5 mL，指示劑為刃天青和L-半胱氨酸（培養(yǎng)基的pH為7.0～7.2）。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基：氯化鈉5 g/L、氯化銨1 g/L、蛋白胨2 g/L、酵母膏提取物1 g/L、碳酸鈣2 g/L。

1.2.2 富集 厭氧瓶預(yù)先分裝0.5%（m/V）濾紙條，通氮?dú)馀趴諈捬跗康难鯕?。預(yù)加900 mL去離子水于1 L的三角瓶中，稱(chēng)取富集培養(yǎng)基組分并依次溶解，調(diào)pH至7左右，補(bǔ)去離子水至1 L并加熱煮沸，直到刃天青的顏色消失，再接著煮沸5 min，最后分裝到厭氧瓶中，121 ℃高溫滅菌30 min，每個(gè)厭氧瓶中分裝50 mL培養(yǎng)基，接種量為10%，35 ℃靜置培養(yǎng)。待濾紙開(kāi)始降解時(shí)，轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基中繼續(xù)富集，將連續(xù)富集3次之后的培養(yǎng)物用于進(jìn)一步篩選。

1.2.3 復(fù)合菌系的篩選 參考張?chǎng)蔚?sup>［14］的研究方法，篩選能夠降解玉米秸稈的復(fù)合菌系。在50 mL培養(yǎng)基中接種富集培養(yǎng)液，并加入5 g秸稈作為碳源，瓶?jī)?nèi)放入1片濾紙條作為分解的外觀指標(biāo)，35 ℃靜置培養(yǎng)。當(dāng)瓶?jī)?nèi)濾紙條降解，秸稈發(fā)生軟化時(shí)取2.5 mL培養(yǎng)液作為種子接種到同樣的新鮮培養(yǎng)基中。如此轉(zhuǎn)接數(shù)代，逐漸淘汰分解速率慢的培養(yǎng)物，留下具有較強(qiáng)分解能力的培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)。等留下的培養(yǎng)物到10代以上仍然具有較好的分解能力時(shí)，選擇具有高分解能力的培養(yǎng)物，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

稱(chēng)取30 g玉米秸稈，置于1%氫氧化鈉溶液中浸泡24 h，之后用去離子水對(duì)秸稈反復(fù)沖洗直至pH接近中性，然后置于80 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行干燥以用于厭氧產(chǎn)酸發(fā)酵，發(fā)酵周期為12 d。為抑制甲烷的產(chǎn)生，在發(fā)酵起始階段添加一定的碘仿乙醇溶液作為甲烷抑制劑。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

采用濾網(wǎng)過(guò)濾產(chǎn)酸發(fā)酵液測(cè)定玉米秸稈降解率，將殘留物于85 ℃烘干并稱(chēng)質(zhì)量，用減質(zhì)量法計(jì)算出秸稈降解率^［15］，采用比色法^［16］測(cè)定纖維素降解率，采用普魯士法^［17］測(cè)定木質(zhì)素的降解率。采用pH計(jì)（PHS-3C型）測(cè)定pH，短鏈脂肪酸采用GC-MS（QP2010 Plus型）測(cè)定。秸稈降解率、pH和短鏈脂肪酸每2 d測(cè)定1次。

1.5 微生物多樣性的測(cè)定

為探究復(fù)合菌系微生物組成，分析降解木質(zhì)纖維素的微生物，采用高通量測(cè)序方法進(jìn)行微生物多樣性的測(cè)定。取3個(gè)平行樣品，將樣品以13 000 r/min離心5 min，棄上清液，剩余沉淀物按照試劑盒（OMEGA E.Z.N.A? Mag-Bind Soil DNA Kit提取試劑盒）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取。將檢測(cè)合格的DNA樣品采用16S V3-V4引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2×Hieff? Robust PCR Master Mix 15 μL、Bar-PCR primer F 1 μL、Primer R 1 μL、PCR products 10～20 ng、ddH2O 9～12 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，預(yù)循環(huán)5次；94 ℃退火20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)20次；72 ℃延伸5 min；10 ℃保存。引入Illumina橋式PCR兼容引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。第二輪PCR反應(yīng)體系：2×Hieff? Robust PCR Master Mix 15 μL、primer F 1 μL、Index-PCR Primer R 1 μL、PCR products 20～30 ng、ddH2O 9～12 μL。第二輪PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性3 min；94 ℃退火20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)5次；72 ℃延伸5 min；10 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米秸稈發(fā)酵中降解率的變化

由圖1可以看出，秸稈降解率的變化趨勢(shì)與潘云霞等^［18］利用復(fù)合菌系預(yù)處理稻稈的降解趨勢(shì)具有一致之處。前4 d秸稈的降解速度最快，在4 d時(shí)，秸稈的降解率達(dá)30.35%，纖維素和木質(zhì)素的降解率分別達(dá)27.07%和14.71%，較青格爾等^［19］篩選的復(fù)合菌系GF-20在玉米秸稈達(dá)到相似降解率時(shí)的時(shí)間縮短了11 d。6 d后，秸稈的降解率逐漸增加緩慢，其原因可能與代謝產(chǎn)物的抑制、底物的減少等因素有關(guān)^［20］。培養(yǎng)至12 d時(shí)，秸稈的降解率達(dá)40.02%，纖維素和木質(zhì)素的降解率也分別達(dá)32.25%和20.93%，這表明該復(fù)合菌系在降解玉米秸稈方面具有較大潛力。

2.2 發(fā)酵體系內(nèi)pH的變化

由圖2可知，pH在前6 d由7.1迅速降至5.0隨后又緩慢降至4.5，這可能是因?yàn)镾CFAs生成速率的變化。之后由于SCFAs含量的降低和蛋白質(zhì)的分解^［18］，使得pH在8 d后稍有增加，在12 d時(shí)達(dá)4.9左右，此變化趨勢(shì)符合細(xì)菌復(fù)合菌群分解木質(zhì)纖維素的特殊規(guī)律，是正常分解能力的體現(xiàn)，如果pH不能回升則證明復(fù)合菌群已經(jīng)失去分解效果^［21］。這也意味著該復(fù)合菌系具有一定的pH調(diào)節(jié)能力。

2.3 短鏈脂肪酸的產(chǎn)生

發(fā)酵過(guò)程中短鏈脂肪酸的濃度變化如圖3所示。由圖3可以看出，復(fù)合菌發(fā)酵產(chǎn)酸過(guò)程中，乙酸在2 d時(shí)就處于較高濃度，達(dá)1.65 μg/mL，隨后乙酸含量迅速下降，在6 d時(shí)降到0.75 μg/mL，之后基本保持恒定。丁酸濃度的變化趨勢(shì)與乙酸相似。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，丙酸的濃度都較低，而且變化不大。復(fù)合菌處理秸稈12 d，異丁酸含量占總SCFAs的36.46%，乙酸含量占總SCFAs的33.15%，而丙酸和丁酸在整個(gè)秸稈發(fā)酵階段都保持較低的含量，僅分別占SCFAs的10.65%和19.74%。這說(shuō)明復(fù)合菌系發(fā)酵秸稈是以乙酸和異丁酸為主的丁酸型發(fā)酵。

2.4 復(fù)合菌系的物種組成

基于樣品OTUs聚類(lèi)分析，該復(fù)合菌系在門(mén)分類(lèi)水平和屬分類(lèi)水平上的微生物相對(duì)豐度如圖4所示。3個(gè)平行樣品在門(mén)分類(lèi)水平上細(xì)菌種類(lèi)相對(duì)較少，主要含有厚壁菌門(mén)（Firmicute）和變形菌門(mén)（Proteobacteria），兩者總相對(duì)豐度占98%以上。其在屬分類(lèi)水平上物種組成結(jié)構(gòu)類(lèi)似，但菌群相對(duì)豐度略有差異，可以看出優(yōu)勢(shì)菌屬主要為Clostridium sensu stricto、Cellulosilyticum、Clostridium XIVa、Enterobacteriaceae和Peptostreptococcaceae等。

3 小結(jié)

1）本試驗(yàn)篩選的復(fù)合菌系降解玉米秸稈過(guò)程中，在前4 d的降解速度最快，秸稈、纖維素和木質(zhì)素的降解率分別達(dá)30.35%、27.07%和14.71%，在12 d時(shí)，其降解率分別達(dá)40.02%、32.25%和20.93%。這表明篩選的復(fù)合菌系在降解木質(zhì)纖維素方面有一定的效果。

2）復(fù)合菌系的代謝產(chǎn)物以異丁酸和乙酸為主，其含量分別占總短鏈脂肪酸的36.46%和33.15%，其中乙酸的最高含量達(dá)1.65 μg/mL。

3）該復(fù)合菌系主要由Clostridium sensu stricto、Cellulosilyticum、Clostridium XIVa、Enterobacteriaceae和Peptostreptococcaceae等優(yōu)勢(shì)菌屬組成。

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收稿日期：2022-11-22

基金項(xiàng)目：安徽省省級(jí)重點(diǎn)基金項(xiàng)目（JZ2022QSKJ0010）

作者簡(jiǎn)介：汪文君（1998-），女，安徽黃山人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全，（電話）15256595484（電子信箱）980370781@qq.com；通信作者，劉國(guó)慶（1963-），男，教授，主要從事生物質(zhì)資源高值化利用的研究，（電子信箱）13675512000@163.com。