解冰輝，李同川，段曉紅，駱菲，王貴江，羅文學(xué)，馬軍紅，張軍輝

（河北省畜牧良種工作總站，河北石家莊 050061）

為了加快培養(yǎng)和選拔農(nóng)業(yè)行業(yè)高技能人才，河北省每兩年開展一次種豬繁殖職業(yè)技能競賽，大賽有利于進一步提高家畜繁殖人員的業(yè)務(wù)素質(zhì)，強化并提升技能，為加快農(nóng)業(yè)農(nóng)村現(xiàn)代化提供有力的人才支撐。 大賽結(jié)合生豬繁殖生產(chǎn)的實際情況，采取理論知識考試和現(xiàn)場技能操作考核相結(jié)合的形式，以全國大賽的比賽方案和評分細(xì)則為標(biāo)準(zhǔn)。 現(xiàn)筆者對技能考核中豬常溫精液精子活力和密度檢測操作步驟中容易出現(xiàn)的問題進行匯總。

1 使用的設(shè)備注意事項

1.1 恒溫加熱臺

設(shè)置為37℃，打開開關(guān)，只顯示當(dāng)前實際溫度，按下set 鍵顯示設(shè)定溫度，數(shù)字閃爍，按上下箭頭鍵調(diào)到37℃， 再按下set 鍵進入工作狀態(tài)。選手常犯錯誤：打開開關(guān)，看到顯示的37℃就不設(shè)置了。 設(shè)置好了37℃，再按下set 鍵后發(fā)現(xiàn)顯示的不是37℃， 以為設(shè)置錯了又重新操作耽誤時間。 忘記再按下set 鍵。

1.2 恒溫水浴鍋

設(shè)置為37℃，打開開關(guān)，顯示屏顯示兩個溫度，上面的ST：30：00 是設(shè)定溫度（水浴鍋關(guān)閉電源后，設(shè)定溫度自動恢復(fù)出廠設(shè)置30℃，不保存上次設(shè)定溫度，所以每次打開開關(guān)就顯示設(shè)定溫度30℃），下面的WD：☆☆是當(dāng)前實際溫度。直接按箭頭鍵調(diào)到37℃， 每按一下向上箭頭鍵增加1℃，每按一下向下箭頭鍵減少0.1℃，完成溫度設(shè)定后， 按下紅色運行鍵進入工作狀態(tài)，水浴鍋最上邊的紅色加熱指示燈亮，表明水浴鍋開始加熱，當(dāng)水溫達到設(shè)定溫度時，加熱指示燈自動滅。 選手常遇問題：不小心設(shè)置成了38℃，需要按向下箭頭鍵10 次， 所以操作要謹(jǐn)慎小心。忘記按下紅色運行鍵。 按下運行鍵后發(fā)現(xiàn)加熱指示燈不亮以為操作出了問題，實際上是水溫達到了37℃。

1.3 溫度計

溫度計保持豎直。 溫度計的玻璃泡全部浸入水中，不要碰到容器底或壁，從立體的角度看玻璃泡應(yīng)放在水中央位置。 讀數(shù)時溫度計的玻璃泡要繼續(xù)留在水中，視線應(yīng)與溫度計水銀面相平。 玻璃泡浸在水中稍候一會兒，示數(shù)穩(wěn)定后再讀數(shù)。

1.4 顯微鏡

旋轉(zhuǎn)鏡頭轉(zhuǎn)換器， 使低倍物鏡對準(zhǔn)載物臺中央的通光孔，當(dāng)聽到“咔噠”聲時，說明鏡頭位置調(diào)整到位。 將要觀察的樣品先移到通光孔位置，然后眼睛看著物鏡，用粗動手輪調(diào)節(jié)載物臺，緩慢上移近距離接近鏡頭但不要損壞到物鏡，然后慢慢下移載物臺的過程中看顯示屏，當(dāng)看到顯示屏出現(xiàn)模糊圖像時，再調(diào)節(jié)細(xì)動手輪，直至圖像清晰為止，然后換成高倍物鏡觀察。

比賽使用的顯微鏡， 物鏡有4 倍、10 倍、20倍，先用4 倍物鏡觀察再轉(zhuǎn)換成10 倍物鏡觀察，因為使用了顯示屏就不用考慮操作步驟中提到的200 倍了； 接通電源， 在顯微鏡底座上顯示38℃，它代表載物臺會自動加熱到38℃，廠家設(shè)置好了不需要調(diào)整；顯微鏡最上面的顯示屏開關(guān)是獨立的， 與顯微鏡開關(guān)沒有關(guān)系。 常犯錯誤：裁判助手事先接通電源，打開顯示屏，顯微鏡下面的溫度顯示38℃， 選手到位后看到顯示屏是亮的，溫度也有顯示，就認(rèn)為顯微鏡是打開狀態(tài)。載物臺上移的時候看顯示屏， 容易損壞物鏡鏡頭。 接近精液的位置經(jīng)常遇見類似雜質(zhì)的東西，接著移動載物臺就能找到，選手通常以為精子就在這個位置，上下微調(diào)就是找不到而浪費時間。

1.5 移液器

舉例，取1 毫升精液放入小試管，手握移液器，拇指下壓到第一道阻力時吸取精液取出的就是1 毫升， 如果再向下壓死取的就大于1 毫升了。 慢慢吸入，吸取精液時手松開太快就吸不夠1 毫升，因為吸頭的一端太細(xì)，來不及吸入。放入小試管時，沿側(cè)壁慢慢流入,如果手壓太快精液迅速到達小試管底部反彈噴出。 移液器吸入精液后不可倒放不可平放，應(yīng)盡快將精液放入小試管，防止精液倒流損壞移液器。 恢復(fù)移液器初始狀態(tài)時， 調(diào)節(jié)移液器使其內(nèi)部彈簧處于放松狀態(tài)，如果調(diào)反了方向，過了極限從而造成移液器的損壞。

2 關(guān)于精液的搖勻

2.1 打開17℃精液保存箱，取出一瓶常溫精液輕輕搖勻。 如果劇烈搖晃就會影響精子活力和畸形率，如果不搖勻，瓶內(nèi)不同位置活力和密度會有差異，影響最終結(jié)果的判斷。

2.2 取2700 微升3%氯化鈉溶液和300 微升精液于小試管混勻，不搖勻，計數(shù)不準(zhǔn)確，兩個計數(shù)室誤差超過5%則需要重做。 應(yīng)該形成一個習(xí)慣，只要是精液，拿到手里第一件事就是輕輕搖勻。

3 關(guān)于取樣

保持精液瓶與視線水平， 使其傾斜約45° ,微量移液器吸頭深入液面下15～20 毫米處取樣。多次實驗數(shù)據(jù)表明，15 毫米處活力和密度是最高的。

4 關(guān)于血球計數(shù)板

4.1 確定計數(shù)的5 個中方格

計數(shù)板有兩個計數(shù)室，每個計數(shù)室有9 個大方格，正中間是計數(shù)用的大方格，只有這個大方格由25 個中方格組成，每個中方格由16 個小方格組成，每個中方格邊緣線是雙線，取左上角-右上角-右下角-左下角-中間5 個中方格計數(shù)。

4.2 計數(shù)

5 個中方格按照固定順序計數(shù)，避免丟失一格。計數(shù)原則：以精子頭部為準(zhǔn)，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。 意思是計數(shù)時看頭部在哪，在計數(shù)的中方格以內(nèi)都計數(shù)，在邊緣雙線內(nèi)的：在上邊緣雙線和左邊緣雙線內(nèi)計數(shù)，在下邊緣雙線和右邊緣雙線內(nèi)不計數(shù)。 如果精子比較多，避免丟數(shù)或重復(fù)計數(shù)，在每一個小方格也使用這個原則。 計數(shù)另一計數(shù)室5 個中方格的精子數(shù)， 并記錄數(shù)據(jù)。

4.3 計算精子密度

公式：密度=兩個計數(shù)室中5 個中方格總精子數(shù)的平均數(shù)×5×10 （1 立方毫米）×1000 （1 毫升）×10 （稀釋倍數(shù)）=平均數(shù)×50 萬=平均數(shù)×0.005 億=平均數(shù)÷200 億。

解釋：一個大方格長寬都是1 毫米，高為0.1毫米，體積為0.1 立方毫米。 平均數(shù)×5，為25 個中方格即一個大方格的精子數(shù)，即0.1 立方毫米內(nèi)的精子數(shù)，×10 后為1 立方毫米內(nèi)的精子數(shù)，1毫升等于1000 立方毫米，×1000 后為1 毫升的精子數(shù)，這個時候的數(shù)據(jù)是精液稀釋后的，所以再×10（稀釋倍數(shù)）后的數(shù)據(jù)為精液每毫升的精子數(shù)。 密度單位：億個/毫升。

5 活力和密度結(jié)果要求

國標(biāo)規(guī)定，活力小數(shù)點后保留一位，密度小數(shù)點后保留3 位。 原則：四舍六入五成雙，遇見5時， 舉例活力：65.25 修訂為65.2；65.35 修訂為65.4，去掉5 后末位為雙數(shù)。

6 其他注意事項

6.1 佩戴乳膠手套并消毒。 保持手部干燥，向手套內(nèi)吹一口氣，讓手套充分鼓起再佩戴。 用酒精噴霧對手消毒，避免噴在操作臺上。

6.2 載玻片、蓋玻片放到恒溫加熱臺上預(yù)熱，只預(yù)熱載玻片或蓋玻片或者把蓋玻片放在載玻片上預(yù)熱，都是不對的，要分開預(yù)熱。

6.3 微量移液器吸取20 微升預(yù)熱好的精液滴于載玻片上，加蓋已預(yù)熱的蓋玻片，并無明顯氣泡。產(chǎn)生氣泡的可能性：加蓋蓋玻片方式不對，要傾斜著放下蓋玻片；移液器滴出精液后還用力下壓就擠出氣泡了。 有人把載玻片拿起來滴精液，一方面是載玻片離開了加熱臺影響了精液溫度， 另一方面因為緊張手打哆嗦滴不好位置，在恒溫臺上滴相對穩(wěn)定一些。

6.4 調(diào)整載物臺，確定3 個不同視野，調(diào)整顯微鏡，視野清晰，準(zhǔn)確評定不同視野下精子活力。精液只有一滴，還被壓成薄薄一層，所以精子死的快，這就要求判斷活力要快，另一方面比賽時間是有限制的。 常常有選手在此耗費時間，左思量右思量，對數(shù)據(jù)的判斷猶豫不決。

6.5 取2700 微升3%氯化鈉溶液和300 微升精液于小試管，混勻，吸取20 微升稀釋后的精液置于血蓋片邊緣， 使精液依靠虹吸流入計數(shù)室，均勻充滿，計數(shù)室內(nèi)無氣泡。 用同樣方法在血細(xì)胞計數(shù)板另一側(cè)計數(shù)室加樣。 越是精細(xì)的動作越容易緊張，左手手肘支在操作臺上，左手扶住移液器，右手滴精液，盡量避免手顫抖。 操作要穩(wěn)要慢，充滿計數(shù)室后立刻停止，否則誤差太大。 如果發(fā)現(xiàn)有氣泡，應(yīng)該重新操作此步驟。