孫云萍，武怡，孟令建

作者單位：徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，江蘇 徐州221002

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是兒童最常見的慢性炎癥性疾病之一，嬰幼兒期即可發(fā)病，嚴重影響兒童身心健康。隨著我國經(jīng)濟飛速發(fā)展，環(huán)境污染問題日益嚴重，支氣管哮喘作為呼吸道疾病，其發(fā)病率有逐漸上升趨勢。近年來我國部分兒童哮喘仍未得到良好的控制，早期診斷、規(guī)范化管理和早期干預(yù)，是提高兒童控制水平和改善預(yù)后的重要手段［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性及氣流受限是哮喘的三大特征，其中氣道炎癥是該病的病理基礎(chǔ)，炎癥因子的過量釋放在哮喘發(fā)生、發(fā)展過程中起主要作用［3］。 因此，監(jiān)測病兒的氣道炎癥指標(biāo)對于本病的診治、預(yù)后評估具有重要意義。半乳糖凝集素-3（Galectin-3、Gal-3）也稱半乳糖結(jié)合蛋白-3，是半乳糖凝集素家族的重要成員之一，具有參與炎性反應(yīng)和介導(dǎo)細胞黏附等生物學(xué)功能，Gal-3通過嗜酸性粒細胞與呼吸道上皮細胞緊密黏合，釋放炎癥因子，促進哮喘發(fā)生［4-5］。白細胞介素（IL）-17、IL-35 是近年來廣泛研究的兩種細胞因子，IL-17 是由Th17 細胞分泌的細胞因子，能夠介導(dǎo)并放大氣道炎癥反應(yīng)過程，而IL-35 屬于Treg 細胞分泌的IL-12 家族成員，具有較強的抗炎功能，有研究顯示二者在兒童哮喘中存在異常表達［6］，本研究試圖通過分析哮喘病兒血清Gal-3、IL-35 及IL-17 表達水平及與肺功能的關(guān)系，探討Gal-3、IL-35 及IL-17 在哮喘病兒發(fā)病過程中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究共納入2021 年8 月至2022年8 月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科收治的77 例支氣管哮喘病兒（4～14 歲）為研究對象，其中輕中度急性發(fā)作組40 例，緩解組37 例，對照組26 例（本研究對照組僅為26例，因為這段時間內(nèi)本地區(qū)間斷發(fā)生新冠疫情，因疫情防控之下，徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院門診健康體檢兒童數(shù)量急劇下降，因此符合入組條件并能配合完善肺功能、家長配合同意簽署知情同意書的兒童甚少，因此對照組例數(shù)在基本達到統(tǒng)計樣本量的要求后，未能再繼續(xù)擴充樣本量）。本研究獲得徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準（批號XYFY2022-KL159-01）。所有入組病兒監(jiān)護人對研究方案均簽署知情同意書。

1.2 入選及排除標(biāo)準

1.2.1入選標(biāo)準 兒童哮喘診斷標(biāo)準參照中華醫(yī)學(xué)會兒科分會呼吸學(xué)組制定的兒童支氣管哮喘規(guī)范化診治建議（2020年版）［2］。輕中度哮喘急性發(fā)作組及緩解組病兒評估依據(jù)兒童支氣管哮喘規(guī)范化診治建議（2020 年版）及全球哮喘防治協(xié)議（GINA）2020版診斷標(biāo)準［2］。對照組健康兒童無哮喘及家族史，無濕疹史、過敏性鼻炎史，無其他變態(tài)反應(yīng)性疾病史，無糖皮質(zhì)激素應(yīng)用史，無免疫抑制藥物使用史及資料完整的病例。

1.2.2排除標(biāo)準 ①有過敏性鼻炎或其他過敏性疾病史者；②不能配合肺功能檢查者；③合并炎癥性疾病、惡性血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、癲癇或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；④合并心臟、肝臟、腎臟或其他器官、系統(tǒng)慢性病者；⑤入組前3個月內(nèi)應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑。

1.3 標(biāo)本采集

1.3.1血清Gal-3、IL-35、IL-17 水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immu- nosorbent assay，ELISA）檢測實驗組和對照組血清Gal-3、IL-35、IL-17 表達水平。試劑盒購自上海雅吉生物有限公司，操作步驟嚴格按照說明書執(zhí)行。

1.3.2肺功能檢測 采用Master Screen 肺功能檢測儀進行檢測，主要檢測指標(biāo)包括第1 秒用力呼氣容積/1 s 用力呼氣量預(yù)計值百分比（FEV1%）、1 s 用力呼氣量占用力肺活量比值（FEV1/FVC）、最大呼氣50%瞬間流量（FEF50%），最大呼氣75%瞬間流量（FEF75%）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以例（%）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗；計量資料采用±s表示，進行正態(tài)檢驗及方差齊性檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗；采用Pearson法進行相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組一般情況一般資料結(jié)果，輕中度急性發(fā)作組、緩解組及對照組之間性別、年齡比較，均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 支氣管哮喘77例及對照組26例年齡、性別比較

2.2 三組血清Gal-3、IL-35、IL-17 比較三組血清Gal-3、IL-35、IL-17 水平經(jīng)單因素方差分析結(jié)果顯示，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），進一步采用LSD-t檢驗對各組Gal-3、IL-35、IL-17水平進行兩兩比較結(jié)果顯示，輕中度急性發(fā)作組血清Gal-3 水平顯著高于緩解組及對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），輕中度急性發(fā)作組血清IL-17 水平顯著高于緩解組及對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），輕中度急性發(fā)作組血清IL-35 水平顯著低于緩解組及對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 三組半乳糖凝集素-3（Galectin-3）、白細胞介素35（IL-35）及白細胞介素17（IL-17）水平比較/（ng/L，± s）

表2 三組半乳糖凝集素-3（Galectin-3）、白細胞介素35（IL-35）及白細胞介素17（IL-17）水平比較/（ng/L，± s）

注：①與對照組比較，P＜0.05。②與輕中度急性發(fā)作組比較，P＜0.05。

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2.3 三組肺功能指標(biāo)水平比較三組肺功能指標(biāo)FEV1%、FEV1/FVC、FEF50%、FEF75%經(jīng)單因素方差分析結(jié)果顯示，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），進一步采用LSD-t檢驗對各組肺功能指標(biāo)進行兩兩比較，結(jié)果顯示輕中度急性發(fā)作期肺功能指標(biāo)FEV1%、FEV1/FVC 顯著低于緩解組及對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。輕中度急性發(fā)作組FEF50%、FEF75%顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），輕中度急性發(fā)作組與緩解組FEF50%、FEF75% 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.153、0.098）。見表3。

表3 各組肺功能FEV1% 、FEV1/FVC、FEF50%、FEF75%結(jié)果比較/（%，± s）

表3 各組肺功能FEV1% 、FEV1/FVC、FEF50%、FEF75%結(jié)果比較/（%，± s）

注：FEV1%為第1 秒用力呼氣容積/1 s 用力呼氣量預(yù)計值百分比，F(xiàn)EV1/FVC 為1 s 用力呼氣量占用力肺活量比值，F(xiàn)EF50%為最大呼氣50%瞬間流量，F(xiàn)EF75%為最大呼氣75%瞬間流量。①與對照組比較，P＜0.05。②與輕中度急性發(fā)作組比較，P＜0.05。

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2.4 血清Gal-3、IL-35 分別與IL-17 的相關(guān)性分析經(jīng)Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清Gal-3 與IL-17 呈正相關(guān)（r=0.63，P＜0.001）；血清IL-35 與IL-17呈負相關(guān)（r=-0.72，P＜0.001），見圖1。

圖1 相關(guān)性分析：A為Gal-3與IL-17間的相關(guān)性分析；B為IL-35與IL-17間的相關(guān)性分析

2.5 血清Gal-3 、IL-17、IL-35與肺功能指標(biāo)間的相關(guān)性分析血清Gal-3、IL-17 水平與肺功能參數(shù)FEV1、FEV1/FVC、FEF50%、FEF75%呈顯著負相關(guān)（P＜0.001），血清IL-35 與肺功能參數(shù)FEV1、FEV1/FVC、FEF50%、FEF75% 血清呈顯著正相關(guān)（P＜0.001）。見表4。

表4 Gal-3、IL-17及IL-35與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

哮喘的主要特征是慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)，易反復(fù)發(fā)作、病程長，可引發(fā)肺部及全身反應(yīng)，嚴重影響病人的生活和身心健康，給家庭、社會造成沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。該疾病具體發(fā)病機制尚不明確，經(jīng)典理論認為 Th1/Th2 細胞功能失衡是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵機制，然而Th17 細胞和Treg 細胞的動態(tài)平衡也參與支氣管哮喘發(fā)病的免疫調(diào)節(jié)機制。Th17 亞群細胞可誘導(dǎo)機體炎癥發(fā)生炎癥反應(yīng)，且分泌的IL-17是影響氣道炎癥反應(yīng)的重要因子，Treg細胞分泌的IL-35 為抗炎癥細胞因子。Th17 細胞過度活化和Treg 數(shù)目及功能下降是哮喘的免疫防病機制之一［7-8］。魯珊珊等［9］指出在兒童支原體肺炎中Gal-3 可作為強大的促炎因子，反映Th17 細胞功能，Gal-3 促進Th17 細胞表達IL-17 等效應(yīng)因子，參與支原體肺炎的發(fā)病。目前Gal-3、IL-35 及IL-17 與兒童哮喘相關(guān)報道較少，本研究通過分析哮喘病兒血清Gal-3、IL-35 及IL-17 的水平，探究血清Gal-3、IL-35及IL-17在兒童哮喘中可能的作用機制及意義。

Gal-3 是具有多種生物學(xué)效應(yīng)的β-半乳糖苷結(jié)合蛋白，在單核細胞、巨噬細胞、免疫細胞、成纖維細胞中廣泛表達，具有調(diào)節(jié)炎癥因子、參與過度炎癥反應(yīng)和纖維化為特征疾病的發(fā)病過程［10］。Gal-3與多種呼吸系統(tǒng)疾病有關(guān)，在卵白蛋白（OVA）誘發(fā)的哮喘小鼠模型中，Gal-3的表達在支氣管周炎性細胞及支氣管肺泡灌洗液中明顯升高，Gal-3可能在哮喘的發(fā)病機制中起重要作用［11］。Feng等［12］發(fā)現(xiàn)Gal-3 在急性加重期慢性阻塞性肺疾病病人血清水平顯著高于恢復(fù)期慢性阻塞性肺疾病病人，Gal-3可能促進慢性阻塞性肺疾病病人炎癥反應(yīng)。IL-17 是具有強大促炎能力的前炎癥因子，能誘導(dǎo)和促使中性粒細胞在呼吸道聚集，發(fā)揮致炎、損傷修復(fù)、清除病原菌等作用，參與肺部感染、哮喘等多種肺部疾病進展［13］。有研究報道，在過敏性哮喘小鼠模型中發(fā)現(xiàn)Gal-3 作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子通過中性粒細胞募集促進IL-17分泌，在自身免疫性膽管炎小鼠模型中也顯示Gal-3 可增加IL-17 的合成［14-15］。本研究結(jié)果顯示輕中度哮喘急性發(fā)作組病兒血清Gal-3及IL-17水平明顯高于緩解組及對照組，且Gal-3水平越高，IL-17水平越高，二者呈正相關(guān)，這表明，Gal-3可能通過炎性反應(yīng)相關(guān)途徑調(diào)控Th17 及IL-17 的表達，促進IL-17表達增強，引起氣道及全身炎癥反應(yīng)，從而促進疾病的發(fā)展和病程，抑制Gal-3 的表達，有望為支氣管哮喘等免疫性疾病提供新的治療思路。

IL-35 作為IL-12 家族新成員之一，通過增強Tregs 亞群的功能、抑制Th17 細胞的增殖分化和IL-17的分泌，參與哮喘的發(fā)?。?6］。在小鼠的過敏性氣道疾病模型中，靜脈給予表達IL-35 的腺病毒質(zhì)粒或直接注射IL-35，觀察到氣道的高反應(yīng)性及組織病理學(xué)氣道及肺部的炎癥反應(yīng)明顯減輕，肺泡盥洗液中巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞以及細胞因子（IL-4、IL-5、IL-13 和IL-17 等）都明顯降低［17-18］。本研究結(jié)果顯示，急性發(fā)作組哮喘病兒血清IL-35 水平明顯低于緩解組及對照組，與現(xiàn)有文獻［19］報道相同。這表明IL-35 在哮喘急性發(fā)作期抗炎作用減弱，促炎因子作用加強，進而參與哮喘的發(fā)病。經(jīng)相關(guān)性分析顯示血清Gal-3與IL-17呈正相關(guān)，IL-35 與IL-17 呈負相關(guān)，這表明，哮喘血清中IL-17 的表達改變可影響其他細胞因子水平的表達。Gal-3、IL-17 水平的升高及IL-35 的降低，可能在Th17/Treg 細胞平衡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，影響哮喘的發(fā)生。Gal-3、IL-17 可能通過增強炎癥反應(yīng)而加重疾病進展，IL-35則在抑制氣道炎癥反應(yīng)中發(fā)揮積極作用，哮喘中Treg/Th17 的表達失衡，為研究哮喘的免疫學(xué)機制提供了新的理論依據(jù)，進一步研究發(fā)展新型抗炎分子和新的免疫治療方法，有可能為今后治療支氣管哮喘提供新策略。

判斷氣流受限的重要客觀指標(biāo)是肺功能檢查指標(biāo)，肺功能檢測是診斷哮喘的重要手段，同時也是評估哮喘控制水平和病情嚴重程度的重要依據(jù)［20-21］。本研究結(jié)果顯示哮喘緩解期反映大氣道功能的指標(biāo)FEV1%、FEV1/FVC 與輕中度哮喘急性發(fā)作組比較，有明顯改善，而反映小氣道功能的指標(biāo)FEF50%、FEF75%與輕中度哮喘急性發(fā)作組比較，無顯著變化，與對照組比較亦明顯下降，這表明部分哮喘病兒緩解期仍存在小氣道功能異常。陳俊松等［22］研究也顯示在哮喘緩解期小氣道功能障礙組病程明顯長于肺功能正常組，哮喘病兒小氣道功能指標(biāo)對于緩解期的氣道阻塞敏感，對兒童哮喘緩解期的病情評估具有臨床意義。因此我們可以得出小氣道功能指標(biāo)是監(jiān)測、評估哮喘緩解期療效的重要指標(biāo)。通過相關(guān)性分析顯示，血清Gal-3、IL-17與肺功能FEV1%、FEV1/FVC、FEF50%、FEF75%呈負相關(guān)，血清IL-35 與肺功能參數(shù)FEV1%、FEV1/FVC、FEF50%、FEF75%呈正相關(guān)，血清Gal-3、IL-17、IL-35 可間接反應(yīng)哮喘病人肺功能氣道炎癥變化，可作為輔助支氣管哮喘診斷、病情判斷的參考指標(biāo)之一。

綜上所述，哮喘病兒Gal-3表達上調(diào)，IL-35表達下調(diào)，引起IL-17 促表達增強、表達抑制作用減弱，IL-17水平升高從而導(dǎo)致氣道炎癥加重，可能是輕中度哮喘急性發(fā)作的發(fā)病機制之一；亦可能是哮喘緩解期部分病兒小氣道炎癥持續(xù)存在的可能機制之一。Gal-3、IL-35、IL-17水平測定有助于預(yù)測輕中度哮喘急性發(fā)作風(fēng)險及指導(dǎo)調(diào)整吸入性糖皮質(zhì)激素用藥。