劉鳳珍，王榮，崔發(fā)財，趙偉鋒

作者單位：河南省人民醫(yī)院，a檢驗科，b腫瘤內科，河南 鄭州450003

前列腺癌（PCa）是一種常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，2020年全球新發(fā)確診病例140萬人，新發(fā)死亡病例37萬人，其發(fā)病率和病死率已分列世界男性惡性腫瘤的第2 位和第5 位［1-2］。近年來，隨著飲食及生活方式的改變、人口老齡化水平的不斷增加，我國前列腺癌發(fā)病率也呈逐步增長趨勢［3］。流行病學調查研究顯示［4］，我國初診為局限性前列腺癌病人的比例僅為30%左右，大部分病人首次確診時癌細胞已發(fā)生深層組織浸潤和遠處器官轉移，貽誤臨床治療造成病死率高，這是我國PCa 病人5 年生存率低于歐美發(fā)達國家的主要原因，因此深入研究PCa 進展分子機制，篩選腫瘤發(fā)生發(fā)展相關生物標志物對PCa 的診斷、治療和改善病人預后是至關重要的。泛素結合酶E2C（UBE2C）是泛素結合酶E2的家族成員，也是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中的重要參與者，可通過靶向細胞周期調控因子來調控細胞周期中的關鍵檢查點，發(fā)揮其促進細胞有絲分裂進程的作用［5］。研究［6］報道，UBE2C 異常表達可導致有絲分裂周期蛋白破壞和細胞染色體組的不穩(wěn)定性增加，誘導腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。目前在前列腺癌的研究中，鄧蘭等［7］通過免疫組化技術分析發(fā)現(xiàn)UBE2C高表達病人比UBE2C 低表達病人有著更為惡性的臨床病理特征和更差的預后生存期，但UBE2C 在相關病人血清中的表達情況、臨床意義以及參與癌癥進展的機制目前尚未可知。本研究中首先采用基因表達交互分析數(shù)據(jù)庫分析UBE2C 在前列腺癌組織中的表達情況，并進一步檢測UBE2C 在前列腺癌病人血清中的表達情況，分析其臨床診斷價值，并通過一系列體外實驗探討UBE2C 對前列腺癌細胞增殖、侵襲和轉移的影響，為研究前列腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/）分析UBE2C 在前列腺癌病人癌組織及癌旁組織中的表達情況。前列腺癌病人納入標準：①所有病人均為首次診斷前列腺癌且臨床資料完整；②所有病人留取血液樣本前未接受化療、去勢治療等任何治療手段；③既往無惡性腫瘤史，確診時未發(fā)生其他類型惡性腫瘤。排除標準：①合并重要臟器器質性疾病；②合并嚴重自身免疫性疾病。前列腺增生（BPH）病人納入標準：①所有病人均為首次診斷良性前列腺增生且臨床資料完整；②所有病人留取血液樣本前未執(zhí)行前列腺電切除手術；③超聲測量前列腺體積大于25 mL。排除標準：①合并膀胱結石或腫瘤；②病人患有尿路感染或前列腺炎。研究對象樣本量參考公式：N=Z2×［P×（1-P）］/E2，設定Z=1.96，P=90%，E=10%。根據(jù)上述標準篩選2021 年1 月至2022 年6 月在河南省人民醫(yī)院接受住院治療的PCa病人和BPH 病人各50例，以同時期健康管理中心50例體檢者做對照，凍存所有研究對象空腹靜脈血離心后的血清于-80 ℃超低溫冰箱。所有研究對象對研究方案均知情同意。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 試劑與材料前列腺癌細胞株DU145 購自武漢尚恩生物科技有限公司；0.25% 胰酶、Ham's F-12K 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和青霉素-鏈霉素混合雙抗均購自武漢普諾賽生物科技有限公司；UBE2C 酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）試劑盒、兔抗人單克隆抗體（UBE2C、t-Akt、p-Akt、MMP-2、MMP-9 和GAPDH）、HPR 標志羊抗兔二抗和Bradford 蛋白濃度測定試劑盒均購自武漢菲恩生物科技公司；RNAeasy Isolation 試劑、通用反轉錄試劑盒（M-MLV）、高特異性染料法定量PCR 檢測試劑盒（AceQ?qPCR SYBR Green Master Mix）購自諾唯贊生物科技公司；針對UBE2C 的小干擾RNA（si-UBE2C）及陰性對照（si-NC）由銳博生物公司設計合成。

1.3 ELISA 實驗將試劑盒（雙抗體夾心法）自帶標準品根據(jù)說明書進行倍比稀釋，不同濃度標準液各加50 μL 于96 孔板，待測樣本孔中40 μL 稀釋液和10 μL 血清樣本，空白孔滴加稀釋液作為對照。37 ℃孵育30 min，PBS 也洗滌3 次，每孔各加50 μL酶標試劑繼續(xù)孵育30 min，洗凈瀝干水分后加入顯色劑顯色，在酶標以上讀取450 nm 處的吸光度（OD）值。繪制標準曲線計算樣本中UBE2C含量。

1.4 血清前列腺特異性抗原（PSA）檢測使用羅氏全自動化電學發(fā)光免疫分析儀Cobas e601及其配套PSA 試劑盒檢測血清PSA 水平，檢測方法為電化學發(fā)光法，樣本檢測前需進行常規(guī)腫瘤標志物質控品檢測，質控結果在控后方可開展樣本檢測工作。

1.5 細胞轉染與分組將生長狀態(tài)良好的DU145細胞用0.25%胰酶消化，并用含10%FBS 的Ham's F-12K 培養(yǎng)基調整濃度為1×109個/升，6 孔板鋪板，當細胞融合度達到70%時，根據(jù)轉染試劑盒說明書將si-UBE2C 和si-NC 轉染細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后檢測轉染效率。實驗組分為：陽性干擾組（si-UBE2C），陰性對照組（si-NC）和空白對照組。

1.6 實時熒光定量PCR（qPCR）根據(jù)RNA 提取試劑盒說明書提取DU145 細胞總RNA，紫外吸收法測定其濃度和純度。M-MLV 逆轉錄酶將總RNA 生成cDNA，采用AceQ?qPCR SYBR Green Master 試劑盒進行擴增： 95 ℃預變性10 min 后繼續(xù)變性20 s，56 ℃退火25 s，71 ℃延伸20 s，擴增循環(huán)46 次。UBE2C 啟動子引物序列（正向：GACCTGAGGTATAAGCTCTCGC；反向：CAGGGCAGACCACTTTTCCTT），GAPDH啟動子引物序列（正向：AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA；反向：AATGAAGGGGTCATTGATGG）。采用2-ΔΔCt法分析UBE2C mRNA表達水平。

1.7 CCK-8 實驗各實驗組DU145 細胞用0.25%胰酶消化，用含10%FBS的Ham's F-12K培養(yǎng)基調整濃度為3×108個/升，96 孔板每孔加入100 μL 細胞懸液，細胞貼壁后加入CCK-8 試劑，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后用酶標儀測定450 nm處的吸光度值。

1.8 Transwell 侵襲和遷移實驗遷移實驗：各實驗組DU145 細胞用0.25%胰酶消化，并用無FBS 的Ham's F-12K 培養(yǎng)基調整濃度為3×108個/升，transwell小室上室加入100 μL，套入含400 μL Ham's F-12K 培養(yǎng)基（含12% FBS）的下室內，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出上室，PBS 清洗下室2 次，多聚甲醛固定后用0.1%結晶紫染色，在顯微鏡下計數(shù)遷移細胞數(shù)。侵襲實驗：需將預先稀釋的Matrigel 膠包被在transwell小室底部膜上室面，其余操作步驟同遷移實驗。

1.9 蛋白質印跡實驗收集各實驗組細胞用裂解液提取總蛋白，繪制BCA 標準曲線測定蛋白濃度。制備SDS-PAGE 電泳膠，進行蛋白上樣、分離和轉膜， TBST 封閉后，將PVDF 膜與蛋白激酶B（t-Akt和p-Akt）一抗、侵襲轉移相關蛋白（MMP-2 和MMP-9）一抗、UBE2C 蛋白一抗和GAPDH 一抗放置冷藏冰箱孵育過夜，TBST 漂洗后，加入山羊抗兔二抗繼續(xù)孵育1.5 h，用ECL 試劑使PVDF 膜顯影，采用Image J進行條帶分析。

1.10 統(tǒng)計學方法應用SPSS 25.0 和GraphPad Prism 9.0 軟件進行統(tǒng)計學分析和繪圖，定量資料先進行K-S正態(tài)性檢驗。偏態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)（第25、第75百分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，采用Kruskal-WallisH檢驗比較多組間差異，組內兩兩比較采用Bonferroni法，采用Mann-WhitneyU檢驗比較兩獨立樣本間差異。正態(tài)分布數(shù)據(jù)用±s表示，采用單因素方差分析或重復測量方差分析比較多組間差異，組內兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。繪制受試者操作特征（ROC）曲線計算血清UBE2C 診斷前列腺癌的曲線下面積（AUC）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 UBE2C 在前列腺癌組織中和前列腺癌病人血清中高表達GEPIA 在線數(shù)據(jù)庫分析結果表明，UBE2C mRNA 在492例前列腺癌組織中的中位表達水平為顯著高于其在152例癌旁組織中的中位表達水平（4.08比1.21，P＜0.05）。K-S檢驗結果顯示血清UBE2C 濃度在前列腺癌組、前列腺增生組和健康對照組中均為非正態(tài)分布（P＜0.001；P＜0.001；P=0.003）。其在前列腺癌病人中的濃度值為0.64（0.41，1.06）μg/L，顯著高于前列腺增生組和健康對照組［0.28（0.22，0.39）μg/L 和0.19（0.18，0.21）μg/L，H=30.52、78.65，均P＜0.05］，采用Bonferroni 法校正后的兩兩比較發(fā)現(xiàn)，前列腺增生組血清UBE2C 濃度水平也顯著高于健康對照組（H=45.82，P＜0.05）。

2.2 血清UBE2C 檢測對前列腺癌診斷的效能評價對各50例前列腺癌、前列腺增生及健康對照的血清UBE2C結果進行ROC曲線分析，結果顯示血清UBE2C診斷前列腺癌的AUC為0.86，將UBE2C診斷截取值選定為0.395 μg/L，約登指數(shù)最大，血清UBE2C 診斷前列腺癌的靈敏度和特異度分別為76.3%和88.9%，將血清PSA 和血清UBE2C 檢測聯(lián)合應用于前列腺癌診斷，AUC值為0.90，顯著高于血清UBE2C 單獨診斷（Z=2.31，P=0.021），其診斷前列腺癌的靈敏度和特異度分別為82.4%和89.7%。

2.3 血清UBE2C 表達與前列腺癌病人臨床病理特征的關系Mann-WhitneyU檢驗結果顯示，T3～T4期，gleason 評分＞7 分，有淋巴結轉移和骨轉移的前列腺癌病人中血清UBE2C 水平顯著高于T1-T2 期、低gleason 評分、無淋巴結轉移和無骨轉移的前列腺癌病人（均P＜0.05），見表1。

表1 人類泛素偶聯(lián)酶E2C （UBE2C）表達與前列腺癌病人臨床病理特征的關系

2.4 沉默UBE2C 表達抑制結前列腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力qPCR 和蛋白質印跡法檢測結果顯示，陽性干擾組DU145細胞內UBE2C表達水平較陰性對照組和空白對照組顯著降低（均P＜0.05），表明轉染si-UBE2C 能顯著下調前列腺癌DU145 細胞中UBE2C 的表達；重復測量方差分析結果顯示，不同時間和不同組間細胞增殖吸光度均差異有統(tǒng)計學意義（F=222.31、66.34，均P＜0.05），且時間與組間存在顯著的交互效應（F=11.60，P＜0.05），陽性轉染組在48h 和72h 時的細胞增殖吸光度均顯著高于陰性對照組和空白對照組（F=24.02、38.44，均P＜0.05）； transwell 侵襲遷移實驗結果顯示，陽性轉染組的細胞侵襲數(shù)和細胞遷移數(shù)均顯著低于陰性對照組（P=0.003，P=0.006）和空白對照組（P=0.006，P=0.004），見表2，3；圖1，2。

圖1 transwell實驗檢測DU145細胞的侵襲和遷移能力

圖2 蛋白質印跡法檢測DU145細胞內UBE2C蛋白表達

表2 轉染si-UBE2C后各組前列腺癌細胞增殖吸光度的比較/± s

表2 轉染si-UBE2C后各組前列腺癌細胞增殖吸光度的比較/± s

注：①與空白對照組比較，P＜0.05。②與陰性對照組比較，P＜0.05。

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表3 轉染si-UBE2C后前列腺癌細胞UBE2C表達水平、細胞侵襲和遷移能力的變化/± s

表3 轉染si-UBE2C后前列腺癌細胞UBE2C表達水平、細胞侵襲和遷移能力的變化/± s

注：①與空白對照組比較，P＜0.05。②與陰性對照組比較，P＜0.05。

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2.5 沉默UBE2C表達后其前列腺癌細胞內p-Akt、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達降低蛋白質印跡法檢測結果顯示，p-Akt、MMP-2 和MMP-9 蛋白在陽性干擾組、陰性對照組和空白對照組間的表達量均差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），p-Akt、MMP-2 和MMP-9 蛋白在陽性干擾組中的表達量均顯著低于陰性對照組（P=0.003；P＜0.001；P=0.001）和空白對照組（P=0.002；P＜0.001；P=0.002），而t-Akt 蛋白在陽性干擾組、陰性對照組和空白對照組間的表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表4；圖3。

圖3 蛋白質印跡法檢測DU145細胞內t-Akt、p-Akt、MMP-2和MMP-9蛋白表達

表4 轉染si-UBE2C后前列腺癌細胞DU145中t-Akt、p-Akt、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平的變化/± s

表4 轉染si-UBE2C后前列腺癌細胞DU145中t-Akt、p-Akt、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平的變化/± s

注：Akt為蛋白激酶B，MMP為基質金屬蛋白酶。①與空白對照組比較，P＜0.05。②與陰性對照組比較，P＜0.05。

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3 討論

PCa 早期發(fā)病隱匿，臨床表現(xiàn)多與前列腺增生癥狀類似，易被臨床忽視。當病人出現(xiàn)特征性臨床表現(xiàn)時，癌細胞已發(fā)生周圍組織浸潤和遠距離轉移，而侵襲和轉移是導致PCa 病人死亡的主要原因［8-9］。我國國家癌癥中心的調查研究顯示，2015年PCa 標準化生存率為69.2%，較10 年前提升了近13個百分點，這得益于PCa 診斷技術和治療方案的不斷完善和提升［10］，然而相比較西方發(fā)達國家平均80%以上的生存率［11］，我們還相差甚遠。臨床常用于篩查和診斷PCa的檢測手段分別是前列腺癌特異性抗原（PSA）檢測和組織穿刺活檢［12-13］，但前者特異性不高，后者費用昂貴且是有創(chuàng)操作，病人接受度不高，這都造成了潛在PCa初級病人的漏診，貽誤最佳治療時機。因此，闡明PCa 發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉移的分子機制，篩選高特異性高靈敏度的生物標志物和新的治療靶點，對早期診斷PCa 和提高病人生存率是至關重要的。

UBE2C，又被稱為泛素結合酶10（UBH10），在細胞周期過程中發(fā)揮重要作用。近來研究發(fā)現(xiàn)，UBE2C 異常表達導致細胞染色體不穩(wěn)定和有絲分裂紊亂，促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［14］。例如，Kariri等［15］報道UBE2C 在乳腺癌組織中高表達，其表達水平與p53、Ki67、EGFR、PI3K 等細胞周期相關標志物呈正相關，UBE2C 高表達是乳腺癌病人預后的獨立標志物。Zhang、Yang［16］報道UBE2C 在肝細胞癌組織中高表達，其表達水平與腫瘤分期和p53 基因突變率呈正相關，與病人預后和總生存期呈負相關。UBE2C 不但具有組織特異性，其在一些類型腫瘤的病人體液中也能檢測到異常表達，為腫瘤的診斷、惡性度評估及預后效果評估提供了無創(chuàng)性檢測可能。例如，血清UBE2C 水平與膠質瘤病人的TNM分期和Karnofsky（KPS）評分相關，是評估病人預后的有效指標［17］；尿液UBE2C 檢測可以評估膀胱癌的浸潤程度，其診斷膀胱癌的AUC、靈敏度和特異度分別是0.78、0.71 和0.85［18］。本研究利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，UBE2C 基因在前列腺癌組織中表達水平顯著高于癌旁組織，這與相關研究報道一致，提示UBE2C 異常表達與PCa 的發(fā)生發(fā)展相關。之后通過分析PCa 病人及對照組血清樣本發(fā)現(xiàn)，UBE2C 在PCa 病人血清中也處于高表達狀態(tài)，其表達與PCa 病人的T 分期、gleason 評分、淋巴結轉移和骨轉移呈正相關，提示血清UBE2C 檢測可用于評估PCa 病人的疾病進展狀態(tài)。此外，血清UBE2C 診斷前列腺癌的AUC 為0.86，靈敏度和特異度分別為76.3%和88.9%，而將血清PSA 和UBE2C 聯(lián)合用于診斷前列腺癌的AUC 為0.90，靈敏度和特異度進一步提高，表明UBE2C 可作為潛在的前列腺癌聯(lián)合診斷指標之一發(fā)揮良好的診斷價值。在細胞學實驗中，通過轉染小干擾RNA（siRNA）的方式沉默UBE2C 的表達，前列腺癌DU145 細胞的增殖、侵襲和遷移能力均得到有效抑制。PI3K/Akt信號通路中關鍵基因的活化或異常表達是引起腫瘤的增殖、侵襲或轉移的重要原因，研究報道UBE2C 通過影響Akt/mTOR 信號通路促進乳腺癌細胞的增殖［19］；在胰腺癌［20］的研究中，UBE2C 可激活PI3K/Akt 信號通路促進基質金屬蛋白酶（MMPs）表達，UBE2C 與表皮生長因子受體（EGFR）結合，使其穩(wěn)定表達并驅動PI3K-Akt 通路激活，在胰腺癌的增殖和轉移過程中發(fā)揮重要作用。此外，在宮頸癌［21］的研究中也報道UBE2C 調控mTOR/PI3K/Akt 通路的表達和活性。為研究UBE2C 影響前列腺癌發(fā)生發(fā)展的機制，本研究通過蛋白質印跡法檢測PI3K/Akt 信號通路關鍵基因的表達，結果顯示UBE2C表達下調后，Akt磷酸化水平降低，PI3K/Akt 信號通路的異常活化狀態(tài)得到抑制。MMP-2 和MMP-9 同屬基質金屬蛋白酶成員，共同參與腫瘤細胞外基質的降解，其高表達促進了PCa 的侵襲和轉移過程［22］，另在一些腫瘤的機制研究［23］中還發(fā)現(xiàn)MMP-2 和MMP-9 作為下游靶基因受到PI3K/Akt 信號通路的調控。本研究中，在p-Akt 表達下調的同時，MMP-2 和MMP-9 表達水平也相應下調，上述結果表明UBE2C 表達水平的改變與p-Akt、MMP-2 和MMP-9 表達水平的變化存在一定聯(lián)系，但UBE2C 是否通過調控PI3K/Akt/MMP-2/9 信號通路參與前列腺癌的增殖、侵襲和轉移過程需要我們后續(xù)更深入地研究和探討。