高 瑞，牛伊寧，何仁元，張耀全，海 龍，羅珠珠,

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院, 甘肅 蘭州 730070；2.省部共建干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 蘭州 730070）

隸屬于球囊菌門(Glomeromycota)的有益微生物叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhiza fungi，AMF)能與陸地上80%的植物互惠共生形成叢枝菌根[1]。AMF 對(duì)土壤理化性質(zhì)變化響應(yīng)敏感，通過(guò)根外菌絲將植物根系與土壤密切聯(lián)系起來(lái)[2]，以叢枝和泡囊的結(jié)構(gòu)存在于植物根系中，以菌絲網(wǎng)和孢子的形式分布在植物根圍土壤中[3]，菌絲可延伸至與根系沒(méi)有接觸的土壤中拓展植物根系的吸收面積，促進(jìn)植物對(duì)氮、磷、鉀及其他養(yǎng)分和水分的吸收[4-5]，增強(qiáng)植物抗逆性[6]。球囊霉素相關(guān)土壤蛋白(glomalin related soil protein，GRSP)是由AMF 所在的菌絲和孢子壁代謝的，隨菌絲和孢子的降解進(jìn)入土壤中內(nèi)含有金屬離子的耐熱糖蛋白[7]，對(duì)維護(hù)AMF 自身的生理功能格外重要。GRSP 含量占土壤碳庫(kù)的4%～5%，對(duì)土壤碳庫(kù)的貢獻(xiàn)不容忽視[8]，對(duì)土壤總氮最大貢獻(xiàn)率達(dá)到5%，是土壤氮素的一個(gè)重要來(lái)源[9]。同時(shí)，GRSP 被譽(yù)為“超級(jí)膠水”，其獨(dú)特的黏附能力可以促進(jìn)微團(tuán)聚體形成大團(tuán)聚體并有利于維持團(tuán)粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，提高土壤抗侵蝕能力[10]。土壤有機(jī)碳和團(tuán)聚體也存在相互作用，有機(jī)碳膠結(jié)土壤顆粒促進(jìn)團(tuán)聚體的形成，團(tuán)聚體的形成又在一定程度上有利于土壤固碳[11]。因此，通過(guò)研究GRSP 含量可進(jìn)一步明確AMF 在促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)、維持土壤結(jié)構(gòu)中的作用機(jī)理。

紫花苜蓿(Medicago sativa)是一種多年生優(yōu)良豆科牧草，由于其抗旱、抗寒、耐鹽堿、耐瘠薄、生長(zhǎng)適應(yīng)性強(qiáng)[12]，常常被作為黃土高原區(qū)域退耕還林還草的主要草種[13]。持續(xù)多年種植紫花苜蓿后促進(jìn)土壤碳氮含量提高，但其過(guò)度消耗土壤水分和磷素，使得苜蓿產(chǎn)量下降，并制約后續(xù)作物生長(zhǎng)。有研究表明，為了提高土壤磷利用率，植物與AMF 形成共生結(jié)構(gòu)以增加磷的吸收[14]。GRSP 是由AMF 代謝的結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定的產(chǎn)物[15]，常作為指標(biāo)分析AMF 對(duì)生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的影響[16]。有研究表明，GRSP 含量和有機(jī)碳、全氮和速效磷含量正相關(guān)[17]；但也有研究發(fā)現(xiàn)，隨施磷水平提高，GRSP 含量先升后降[18]，這說(shuō)明土壤GRSP 含量與組成受土壤性質(zhì)、植物種類、環(huán)境因子等多種因素的影響。黃土高原半干旱區(qū)苜蓿長(zhǎng)期種植后，GRSP 含量是如何響應(yīng)這樣一種低磷土壤環(huán)境呢？以往研究大多集中于土壤水分、養(yǎng)分和微生物[19-21]等方面，針對(duì)GRSP含量在紫花苜蓿栽培草地的分布狀況及其與土壤性質(zhì)關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道。

因此，本研究通過(guò)測(cè)定紫花苜蓿不同種植年限AMF 豐度和GRSP 含量，評(píng)估其對(duì)土壤有機(jī)碳庫(kù)和團(tuán)聚體穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)，并結(jié)合土壤理化因子明確GRSP 含量的主要影響因素，為區(qū)域紫花苜蓿栽培草地可持續(xù)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本研究基于布設(shè)在定西市甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)旱作農(nóng)業(yè)綜合試驗(yàn)站(104°44′ E, 35°28′ N)的長(zhǎng)期定位試驗(yàn)進(jìn)行。試區(qū)為雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)，土壤為黃綿土，海拔2 000 m，干燥度2.53，無(wú)霜期140 d，年均日照時(shí)數(shù)2 476.6 h，年均降水量390 mm，年蒸發(fā)量1 531 mm，年均氣溫為6.4 ℃，年均太陽(yáng)輻射量為592.9 kJ·cm-2[13]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究對(duì)象為不同建植年限[2019 年(L2019)、2012年(L2012)、2003 年(L2003)]紫花苜蓿地，對(duì)照為玉米(Zea mays)農(nóng)田，小區(qū)面積均為3 m × 7 m，3 次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。苜蓿品種均為‘隴東苜?！?，采用條播方式播種，播量為22.5 kg·hm-2，在建植當(dāng)年施P2O5105 kg·hm-2、純氮 105 kg·hm-2，苜蓿生長(zhǎng)期間未采取施肥措施，每年6 月、10 月刈割兩次。農(nóng)田自 2013 年開始連續(xù)每年播種該地主栽作物玉米，品種為‘先玉335’，每年播前施P2O5105 kg·hm-2、純N 200 kg·hm-2, 種植密度5.25 萬(wàn)株·hm-2。試驗(yàn)期間未施肥灌水，各處理田間管理保持一致。

1.3 土樣采集

用土鉆使用對(duì)角線五點(diǎn)法于2021 年6 月苜蓿第1 茬盛花期收集苜蓿和農(nóng)田玉米土壤(0－20 cm)，混合成一個(gè)樣品，每個(gè)處理3 次重復(fù)，剔除土樣中的各種雜物，將土樣充分混勻后帶回實(shí)驗(yàn)室。部分土樣過(guò)篩(2 mm)于4 ℃冰箱保存用于土壤硝態(tài)氮測(cè)定，其余土樣風(fēng)干后過(guò)1、2 和0.25 mm 篩，用于土壤其他理化指標(biāo)及菌絲密度的測(cè)定；在每個(gè)小區(qū)采集0－30 cm 土層土壤裝盒帶回，在室內(nèi)風(fēng)干過(guò)程中沿土壤自然縫隙將土壤掰成小于1 cm 的小塊用于土壤團(tuán)聚體測(cè)定。將苜蓿根系挖出，干冰保存帶回實(shí)驗(yàn)室，挑選細(xì)根洗凈后剪成1 cm 左右的根段保存，用于測(cè)定根系菌根侵染率。

1.4 土壤相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

測(cè)定方法參考《土壤農(nóng)化分析》[22]。土壤容重使用環(huán)刀法；全氮使用凱氏定氮法；有機(jī)碳使用濃硫酸－重鉻酸鉀外加熱法；全磷使用高氯酸－濃硫酸－鉬銻抗比色法；速效磷使用碳酸氫鈉－鉬銻抗比色法；速效鉀使用醋酸銨－火焰光度法；硝態(tài)氮使用2 mol·L-1氯化鉀浸提全自動(dòng)化學(xué)間斷分析儀測(cè)定；pH 使用pH 計(jì)；土壤微生物生物量碳熏蒸后用硫酸鉀浸提碳氮聯(lián)合分析儀測(cè)定。

土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)采用濕篩法[23]。用干篩法得到各粒徑團(tuán)聚體，按比例配成濕篩法所需土樣，裝入孔徑自上而下為5、2、1、0.5、0.25 mm 的團(tuán)聚體分析套于水桶內(nèi)，加蒸餾水沒(méi)過(guò)土壤(振動(dòng)頻率為30次·min-1，時(shí)間為5 min)。之后用烘干法測(cè)得每個(gè)粒級(jí)土壤質(zhì)量。土壤水穩(wěn)性團(tuán)粒結(jié)構(gòu)特征用平均重量直徑(mean weight diameter， MWD)、大團(tuán)聚體所占比重R0.25表示。MWD 指團(tuán)聚體分布評(píng)估的綜合指標(biāo)，值越大即大粒徑團(tuán)聚體含量越高，兩者代表團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和抗侵蝕能力。

式中：dˉi為各級(jí)土壤團(tuán)聚體的平均直徑；wi為各粒級(jí)土壤團(tuán)聚體占總試樣的百分比。

AMF 侵染率采用墨水醋染色法測(cè)定[24]。菌絲密度采用真空泵抽濾法測(cè)定[25]。參考Wright 和Upadhyaya[26]方法測(cè)定GRSP 含量。稱取1 g 過(guò)2 mm篩土壤樣品，易提取球囊霉素相關(guān)土壤蛋白(easily extractable glomalin related soil protein，EE-GRSP)含量 用20 mmol·L-1檸 檬 酸 鈉 溶 液(pH 7.0)在121 ℃下提取30 min，5 000 r·min-1離心20 min 后收集上清液；總提取球囊素相關(guān)土壤蛋白(total glomalin related soil protein，T-GRSP)含量用50 mmol·L-1檸檬酸鈉溶液、pH 8.0 在121 ℃下提取60 min，5 000 r·min-1離心20 min 后收集上清液，重復(fù)以上步驟直到上清液失去紅棕色。提取后在紫外－可見(jiàn)光分光光度計(jì)(UV-2450，日本島津)在595 nm 波長(zhǎng)下比色。

式中：C表示標(biāo)準(zhǔn)曲線值(μg)；Vt表示提取上清液體積(mL)；Vs表示測(cè)定時(shí)加樣體積(mL)；Wf表示樣品重(g)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本研究使用Excel 2016 對(duì)土壤理化性質(zhì)、GRSP含量進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用SPSS 25.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素(ANOVA)方差分析、多重比較(LSD 法，P＜ 0.05)進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示。運(yùn)用Origin2021 進(jìn)行團(tuán)粒結(jié)構(gòu)特征、侵染狀況及一元線性回歸分析并繪圖，運(yùn)用Canoco5軟件進(jìn)行冗余分析(redundancy analysis，RDA)，用Adobe Illustrator 2020 軟件對(duì)圖表進(jìn)行調(diào)整修飾。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種植年限苜蓿地土壤基本性質(zhì)

土壤基本性質(zhì)表明(表1)，土壤有機(jī)碳、全氮和微生物生物量碳隨苜蓿種植年限增加而提高，且L2003處理顯著高于農(nóng)田(P＜ 0.05)；土壤全磷、速效磷和硝態(tài)氮表現(xiàn)為農(nóng)田顯著高于苜蓿地(P＜ 0.05)，且全磷和速效磷隨苜蓿種植年限增加而降低；土壤水穩(wěn)性團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)特征表明，平均重量直徑、大團(tuán)聚體所占比重(R0.25)均隨苜蓿種植年限的增加而提高，且L2003處理顯著高于其他處理(P＜ 0.05)；土壤容重、速效鉀和pH 各處理間未表現(xiàn)出明顯差異。

表1 不同處理土壤基本性質(zhì)Table 1 Soil properties under different treatments

2.2 不同種植年限苜蓿地土壤AMF 豐度

根系菌根侵染率和菌絲密度均隨苜蓿種植年限增加而提高(圖1)，其中菌根侵染率表現(xiàn)為L(zhǎng)2003(74%)處理顯著高于其他處理(P＜ 0.05)，菌絲密度表現(xiàn)為L(zhǎng)2003和L2012顯著高于L2019和農(nóng)田(P＜ 0.05)。

圖1 不同處理AMF 侵染率和菌絲密度Figure 1 Colonization rate and hypha density of arbuscular mycorrhizal fungi under different treatments

2.3 不同種植年限苜蓿地球囊霉素相關(guān)土壤蛋白

T-GRSP 和EE-GRSP 含量均表現(xiàn)為隨苜蓿種植年限增加而提高(表2)，且L2003處理顯著高于其他處理(P＜ 0.05)。EE-GRSP/T-GRSP 在處理間無(wú)明顯差異，T-GRSP/SOC 隨苜蓿種植年限增加而提高，L2003處理顯著高于農(nóng)田(P＜ 0.05)。線性回歸分析結(jié)果表明(圖2)，土壤有機(jī)碳和微生物量碳與T-GRSP顯著正相關(guān)(P＜ 0.05)，R0.25和MWD 與T-GRSP 和EE-GRSP 之間均顯著正相關(guān)(P＜ 0.05)。

圖2 球囊霉素相關(guān)土壤蛋白與土壤有機(jī)碳、微生物生物量碳及團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)特征的關(guān)系Figure 2 Relationship between glomalin-related soil proteins with Soil organic carbon, microbial biomass carbon, and aggregate characteristics

表2 不同處理球囊霉素相關(guān)土壤蛋白含量及相關(guān)比例Table 2 Glomalin Related Soil Protein and correlation proportions under different treatments

2.4 土壤AMF 指標(biāo)與土壤基本性質(zhì)關(guān)系

RDA 分析結(jié)果表明，RDA1 和RDA2 共解釋了總方差的87.14% (圖3)。蒙特卡洛檢驗(yàn)進(jìn)一步表明(表3)，土壤速效磷(avail phosphorous，AP)和微生物量碳(microbial biomass carbon，MBC)是主導(dǎo)AMF豐度和GRSP 的主要環(huán)境因子(P＜ 0.01)，其中GRSP 與速效磷極顯著負(fù)相關(guān)(P= 0.002)，與微生物量碳極顯著正相關(guān)(P= 0.002)。

圖3 土壤AMF 豐度和GRSP 與土壤基本性質(zhì)冗余分析Figure 3 Redundancy analysis (RDA) of soil AMF Abundance, GRSP, and soil properties

表3 土壤基本性質(zhì)對(duì)AMF 豐度和GRSP 的影響Table 3 The effects of soil properties on AMF Abundance and GRSP

3 討論

3.1 不同種植年限AMF 豐度及球囊霉素相關(guān)土壤蛋白和團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)特征的關(guān)系

GRSP 是由AMF 菌絲分泌的一種含有37%的碳和3%～5%氮的理論假設(shè)糖蛋白[27]，保存在GRSP中的碳對(duì)土壤碳庫(kù)的貢獻(xiàn)很大，甚至其含碳量要高于土壤微生物的含碳量[28]，在土壤碳循環(huán)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。苜蓿根系菌根侵染率和菌絲密度均隨苜蓿種植年限增加而提高，其中菌根侵染率表現(xiàn)為L(zhǎng)2003處理顯著高于其他處理，菌絲密度表現(xiàn)為L(zhǎng)2003和L2012處理顯著高于L2019和農(nóng)田處理。相應(yīng)地，T-GRSP 和EE-GRSP 含量亦表現(xiàn)為隨苜蓿種植年限增加而提高，表明持續(xù)多年種植苜蓿后由于根系A(chǔ)MF 豐度的增加，促使分泌更多的GRSP。大量研究證實(shí)GRSP 充當(dāng)土壤中的“超級(jí)膠水”，具備增強(qiáng)土壤團(tuán)聚體形成及穩(wěn)定性的功能[29]，可將小土壤顆粒黏結(jié)成微團(tuán)聚體至粒徑稍大的團(tuán)聚體，進(jìn)而發(fā)展成穩(wěn)定的大團(tuán)聚體( ＞ 0.25 mm)，其黏附土壤顆粒的能力比其他土壤糖類物質(zhì)強(qiáng)3～10 倍[30]，能增加土壤團(tuán)聚體穩(wěn)定性。前人研究發(fā)現(xiàn)GRSP 含量與粒徑大于2 mm 的大團(tuán)聚含量和團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性指數(shù)MWD 顯著正相關(guān)[31-32]。本研究中土壤水穩(wěn)性團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)特征表明，MWD、R0.25均苜蓿隨種植年限的增加而提高。線性回歸分析也表明，TGRSP 與EE-GRSP 與MWD 和R0.25顯著正相關(guān)。L2003處理中GRSP 含量最高，相對(duì)應(yīng)的土壤水穩(wěn)性團(tuán)粒結(jié)構(gòu)特征也顯著高于其他處理，進(jìn)一步表明持續(xù)多年種植苜蓿后GRSP 含量的增加有利于土壤顆粒黏結(jié)為團(tuán)聚體，從而對(duì)包裹在其中的有機(jī)碳形成保護(hù)，維持有機(jī)碳的穩(wěn)定性，提高有機(jī)碳含量并改善土壤結(jié)構(gòu)。

3.2 不同種植年限苜蓿地球囊霉素相關(guān)土壤蛋白影響因素

GRSP 是土壤有機(jī)質(zhì)的主要組成部分，是土壤中有機(jī)碳、氮的重要來(lái)源[33]，因此，GRSP 常常被認(rèn)為是AMF 對(duì)宿主植物生長(zhǎng)環(huán)境改變的一種應(yīng)答機(jī)制。大量研究證實(shí)，土壤GRSP 含量和有機(jī)碳、氮、含量正相關(guān)[34-35]；但是，GRSP 含量和土壤磷的含量關(guān)系較為復(fù)雜，高磷土壤中與土壤速效磷顯著正相關(guān)[36]，土壤缺磷情況下與土壤速效磷無(wú)顯著相關(guān)性[17]或負(fù)相關(guān)[37]。本研究中土壤速效磷含量隨苜蓿種植年限的增加而降低，微生物量碳和GRSP含量隨苜蓿種植年限增加而提高，且RDA 和蒙特卡洛檢驗(yàn)結(jié)果表明GRSP 含量與速效磷含量極顯著負(fù)相關(guān)，原因可能是黃綿土區(qū)土壤磷缺乏，苜蓿種植多年并未施肥，種植年限越長(zhǎng)速效磷含量越低，在該環(huán)境下植物更容易受到磷限制而不是氮限制，磷限制情況下植物會(huì)釋放更多的化學(xué)信號(hào)來(lái)刺激AMF 生長(zhǎng)。L2003處理AMF 侵染率顯著高于其他處理，當(dāng)土壤中的速效磷含量越低，AMF 的侵染率可能就越高，菌絲延伸吸收土壤養(yǎng)分、GRSP 隨菌絲腐解釋放于土壤，導(dǎo)致速效磷含量低的土壤分泌的GRSP 含量可能就越高。

4 結(jié)論

黃綿土區(qū)長(zhǎng)期種植紫花苜蓿顯著改變了土壤基本性質(zhì)，進(jìn)而提高了AMF 豐度和GRSP 含量。GRSP含量與土壤有機(jī)碳及團(tuán)聚體穩(wěn)定性之間顯著相關(guān)。冗余分析表明，影響土壤AMF 豐度和GRSP 含量的主要環(huán)境因子是土壤速效磷和微生物生物量碳。與農(nóng)田相比，T-GRSP 含量在土壤有機(jī)碳中的比例隨苜蓿種植年限的增加而提高，說(shuō)明長(zhǎng)期種植苜蓿引起GRSP 含量增加并促進(jìn)了其在土壤有機(jī)碳中的積累，提高了GRSP 含量對(duì)團(tuán)聚體穩(wěn)定性和土壤有機(jī)碳的貢獻(xiàn)。該研究結(jié)果可為黃綿土GRSP 研究及紫花苜蓿栽培草地可持續(xù)利用提供理論依據(jù)。