楊永安，王 媛，陳 明，謝一柳，王英伍，許肖云

（1.西華師范大學 環(huán)境科學與工程學院，四川 南充 637009；2.四川省遂寧生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心站，四川 遂寧 629000；3.西華師范大學 化學化工學院，四川 南充 637009）

汞廣泛存在于自然界中，隨著人類活動開展和工業(yè)進程的加快，汞的消耗量也越來越大。2018年聯(lián)合國環(huán)境署發(fā)布的報告表明，全世界每年排放汞數(shù)千噸。汞的主要存在形式為單質(zhì)汞、無機汞和有機汞，進入環(huán)境中的無機汞在細菌作用下可轉(zhuǎn)化成毒性更大且難分解的有機汞。汞及其衍生物隨食物鏈進入生物體后，極易與細胞膜或酶蛋白內(nèi)的巰基結(jié)合［1-2］，從而影響細胞的正常代謝和生理功能，且易產(chǎn)生生物富集［3-5］，進而損害心臟、腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、口腔及皮膚等器官［6-8］，即使很低的濃度也可能會造成永久性破壞［9-11］，導致人體中毒，如水俁病［12］，給人類健康帶來巨大傷害［13］。世界衛(wèi)生組織和我國規(guī)定飲用水中的汞不能超過1.0×10-3mg/L［14］。目前，汞已成為最引人關注的環(huán)境污染物之一［15］。因此，設計和開發(fā)高效、快速且靈敏的汞檢測技術(shù)愈加緊迫和重要。

目前汞的測定方法有分光光度法、原子發(fā)射光譜法、原子吸收光譜法、高效液相色譜法以及電化學法等［16-20］，但上述方法存在樣品預處理復雜、分析設備昂貴、分析周期長等弊端，難以滿足方便、快捷和靈敏的檢測要求［21］。熒光法因具有操作簡單、成本低、靈敏度高、檢出限低等優(yōu)異性能，受到研究人員的廣泛關注［22］。熒光探針的核心是熒光基團，常見的有羅丹明類、萘酰亞胺類、菁類、香豆素類以及吡咯甲川類等［23-27］。其中香豆素因熒光量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好、斯托克斯位移大以及易修飾等優(yōu)點，被廣泛應用于探針設計［28-30］。

已有研究設計并合成了一種基于三中心氫鍵促進的剛性芳酰胺寡聚體［31-32］。該類分子不僅具有合成簡單、原料易得、易純化和產(chǎn)率高的特點，且因其三中心氫鍵處于骨架外部，使得羰基伸向環(huán)內(nèi)形成一個富電子空腔，該空腔不僅可選擇性地識別某些小分子［33-34］，還對某些金屬離子具有很強的絡合能力［35-37］?；趯υ擃愋滦突衔锏慕Y(jié)構(gòu)特性和研究興趣，本文首次利用寡聚芳酰胺三聚體和3-氨基香豆素高效合成了擁有兩個香豆素熒光基團的寡聚芳酰胺分子（Coumarin-oligaramide，COA）（合成路線見圖1），并研究了其對Hg2+離子的識別性能及檢測機理。最后將其用于實際水樣中Hg2+離子的檢測，以考察其在環(huán)境監(jiān)測和分離領域的潛在應用價值，為指導和設計更加高效的新型熒光探針奠定基礎。

圖1 探針COA的合成路線Fig.1 Synthesis route of probe COA

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Cary Eclipse 型熒光分光光度計（美國Agilent 公司）；AVANCE-400 型核磁共振儀（四甲基硅烷為內(nèi)標，CDCl3作溶劑）、INVENIO R 型傅里葉變換紅外光譜儀（IR，美國Bruker 公司）；Q-TOF-Premier spectrometer 型質(zhì)譜儀（ESI-HRMS，美國Waters 公司）；AFS-9130型原子熒光光度計（北京吉天儀器有限公司）。

3-氨基香豆素、乙二胺四乙酸四鈉鹽水合物（EDTA）、鋅標準溶液（1.0 mg/L）、KNO3、NaNO3、Ca（NO3）2·4H2O、Mg（NO3）2·6H2O、Cu（NO3）2·3H2O、Zn（NO3）2·6H2O、Pb（NO3）2、Cd（NO3）2·4H2O、Fe（NO3）3·9H2O、Mn（NO3）2·6H2O、Ni（NO3）2·6H2O、Co（NO3）2·6H2O、AgNO3、Al（NO3）3·9H2O、Cr（NO3）3·9H2O、Hg（NO3）2·H2O購于上海阿拉丁試劑有限公司，除鋅標準溶液外均為分析純。測試所用溶劑為色譜純。汞質(zhì)控樣購于環(huán)境保護部標準樣品研究所。其余原料均從供應商處購買后直接使用。

1.2 金屬離子濃度標定

用EDTA 待測溶液滴定鋅標準溶液（二甲酚橙為指示劑，六次甲基四胺為緩沖溶液）至溶液由紫紅色變?yōu)辄S色即為滴定終點，平行滴定5 次，計算EDTA 溶液濃度。接著分別稱量約2.0 g 各金屬硝酸鹽于100 mL 燒杯中，用去離子水溶解后轉(zhuǎn)移至500 mL 容量瓶并定容；在pH 5.0～6.0 條件下，以二甲酚橙為指示劑，用已標定的EDTA滴定金屬離子至紫色變?yōu)辄S色即為滴定終點，平行滴定5次，計算金屬離子溶液濃度。

1.3 探針合成

化合物1、2、3以及寡聚芳酰胺三聚體4按照參考文獻［31，35］的方法進行合成。

在250 mL 三頸瓶中，加入4.46 g 寡聚芳酰胺三聚體4、1.42 g 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDCI）、760 mg 1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑（HOAT）和100 mL 二氯甲烷，常溫下攪拌1 h 后，加入726 mg 3-氨基香豆素（化合物5），室溫下過夜攪拌。待反應完全后，依次用稀鹽酸和水洗滌產(chǎn)物，再以無水硫酸鈉干燥后經(jīng)硅膠柱層析（CH2Cl2-CH3OH，15∶1，體積比） 提純，得橙色產(chǎn)物3.47 g，產(chǎn)率69.5%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：9.58（s，2H），9.47（s，2H），9.18（s，2H），9.02（s，1H），8.45（s，2H），7.65（d，J＝8.0 MHz，2H），7.65（t，J=8.0 Hz，2H），7.58（t，J=8.0 Hz，2H），7.52（d，J＝8.0 MHz，2H），6.55（s，3H），4.09（t，J=6.40 Hz，8H），3.80（s，12H），1.94（m，8H），1.17～1.44（m，72H），0.78～1.82（m，12H）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：164.87，163.82，159.30，158.50，156.57，151.47，149.26，145.33，143.05，136.87，130.23，128.32，125.90，121.81， 119.83， 117.25， 115.02， 112.84， 107.07， 107.52， 96.69， 94.89， 69.25， 61.84，31.91，29.71，29.69，29.67，29.59，29.36，26.02，22.67，14.07。ESI-HRMS：m/z1487.95［M＋H］＋。

1.4 光譜測試

分別取已標定的K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+、Fe3+、Mn2+、Ni2+、Ag+、Cr3+、Al3+、Co2+、Hg2+金屬離子溶液，用甲醇配制成1.0×10-3mol/L的金屬離子貯備液。用CH2Cl2∶CH3OH=9∶1（體積比）混合液配制濃度為1.0×10-5mol/L的探針溶液。

取2.5 mL探針溶液至石英比色皿（厚度1.0 cm，體積3.0 mL）中，加入金屬離子貯備液，最大加入量不超過0.1 mL，以減少體積變化對待測溶液濃度的影響［38］。輕微振搖后進行熒光光譜測試。本實驗中，激發(fā)和發(fā)射波長分別為365 nm和515 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針對金屬離子的識別

在配制的探針混合溶液中，分別加入1.0×10-5mol/L的K+、Na+、Ag+、Al3+、Co2+、Cr3+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+、Fe3+、Mn2+、Ni2+、Hg2+金屬離子溶液。結(jié)果如圖2 所示，前15 種金屬離子加入后體系熒光強度均較低，表明探針分子對這些金屬離子沒有響應或微弱響應；加入Hg2+后，515 nm 處出現(xiàn)一個很強的熒光發(fā)射峰，表明熒光探針對Hg2+具有很好的選擇性。盡管加入Fe3+時探針分子具有一定熒光強度，但強度僅為Hg2+的五分之一，其影響可忽略。

圖2 不同金屬離子（1.0×10-5 mol/L）存在下探針COA（1.0×10-5 mol/L）的熒光發(fā)射光譜Fig.2 Fluorescence emission spectra of probe COA（1.0×10-5 mol/L） in the presence of different metal ions（1.0×10-5 mol/L）

2.2 Hg2+濃度對熒光強度影響

考察了Hg2+濃度對探針COA 熒光強度的影響。在配制的探針混合溶液中，分別加入0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5（×10-5mol/L）的Hg2+溶液，結(jié)果如圖3 所示。隨著Hg2+濃度的不斷增加，COA 的熒光強度逐漸增強，當Hg2+濃度為1.5×10-5mol/L時，熒光強度增加了約15倍。Hg2+濃度達1.0×10-5mol/L后，探針COA的熒光強度幾乎不再增加，熒光強度接近最大值，可推斷探針COA與Hg2+的配比為1∶1。

圖3 探針COA（1.0×10-5 mol/L）在不同Hg2+濃度下的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of probe COA（1.0×10-5 mol/L）with different concentrations of Hg2+

向已配制的探針溶液中，逐次加入0.1×10-5～1.0×10-5mol/L 的Hg2+，分別測定加入后的熒光強度，并利用Origin 8.0 軟件擬合曲線。結(jié)果表明，Hg2+濃度（x）在0.1×10-5～1.0×10-5mol/L 范圍內(nèi)，與探針COA 的熒光強度（y）呈線性關系，線性方程為y=421.5818x+30.8454，相關系數(shù)（r2）為0.9953。根據(jù)3σ/k計算檢出限（LOD），其中σ表示經(jīng)10 次測量的探針空白溶液熒光強度的標準偏差，k為擬合曲線的斜率。經(jīng)計算得到LOD 值為2.08×10-7mol/L，低于世界衛(wèi)生組織對飲用水中Hg2+含量最低標準（4.98×10-7mol/L 即1.0×10-3mg/L）和我國《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》（GB 3838-2002）Ⅲ類水中Hg2+的標準限值（4.98×10-7mol/L）［14］，說明該COA 探針具有較強的檢測能力。

2.3 共存金屬離子的影響

為考察在其它金屬離子共存下，探針COA選擇性識別Hg2+的能力，進行了共存金屬離子競爭實驗。在探針溶液中加入1.0×10-5mol/L 的共存金屬離子，測定其最大熒光強度，然后加入1.0×10-5mol/L 的Hg2+，比較加入Hg2+前后的最大熒光強度值。結(jié)果如圖4 所示，加入Hg2+后，探針COA 與Ag+、Cr3+、Al3+、Co2+、Ni2+、Mn2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+、Ca2+、Mg2+、K+、Na+體系的熒光強度分別增加了23.7、 10.7、 9.9、 6.8、 10.0、 9.6、 6.2、10.8、15.3、9.1、14.4、28.5、18.4、29.6和51.9 倍。由此可知，Hg2+較其它金屬離子具有更強的競爭力，探針COA 在選擇性識別Hg2+時，不受其它共存金屬離子的影響，具有很強的抗干擾能力。

圖4 共存金屬離子競爭實驗Fig.4 Competition experiments of coexisting metal ions cHg2+=cmetal ions =1.0×10-5 mol/L

2.4 可逆性研究

為了考察探針COA 的回收情況和應用潛力，選用與Hg2+配位能力更強的EDTA（兩者的穩(wěn)定常數(shù)高達6.3×1021［39］）對其進行可逆性研究。結(jié)果如圖5 所示，COA 探針的熒光強度很弱（曲線a），當加入Hg2+后，探針COA 與Hg2+相互作用，發(fā)出強烈的熒光（曲線b）；當加入EDTA 后，熒光強度回落到最初狀態(tài)（曲線c），這是由于具有更強配位能力的EDTA 與Hg2+形成更穩(wěn)定的配合物，從而釋放出探針，說明探針COA在識別Hg2+的過程中具有可逆性。

圖5 探針COA識別Hg2+的可逆實驗Fig.5 Reversible experiment of probe COA to identify Hg2+

2.5 配位比的測定

本研究基于Job's plot 實驗選用熒光光譜法確定探針與Hg2+的配位比。結(jié)果如圖6 所示，隨著［Hg2+］/（［COA］+［Hg2+］）的比值逐漸增大，熒光強度隨之增強，當［Hg2+］/（［COA］+［Hg2+］）的比值為0.5時，熒光強度達到最高點，說明探針與Hg2+的配位比為1∶1，該結(jié)論與滴定實驗結(jié)果一致。

圖6 探針COA與Hg2+的Job's plot曲線Fig.6 Job's plot of probe COA and Hg2+

2.6 識別機理推測

由熒光滴定實驗和Job's plot 實驗可知，探針COA 與Hg2+的配位比為1∶1。為進一步確定探針COA 對Hg2+的識別機理，測定了COA、COA 和Hg2+絡合物的紅外光譜。結(jié)果如圖7 所示，在COA的紅外光譜中，1 690 cm-1處的峰歸屬為香豆素C=O 的振動峰［41］，1 660 cm-1處為寡聚芳酰胺C=O的伸縮振動峰［42］。當COA與Hg2+絡合后，寡聚芳酰胺C=O 的伸縮振動峰紅移至1 676 cm-1，而香豆素C=O 的振動峰僅紅移至1 691 cm-1處。說明與Hg2+發(fā)生配位的是探針COA 中寡聚芳酰胺中的羰基氧，而非香豆素中的羰基氧。

圖7 COA，COA和Hg2+絡合物的紅外光譜Fig.7 IR spectra of probe COA，COA and Hg2+ complex

采用核磁共振氫譜進一步推測了COA 對Hg2+的識別機理。結(jié)果如圖8所示，加入Hg2+后，酰胺鍵質(zhì)子Ha、Hb 和寡聚芳酰胺芳環(huán)質(zhì)子Hc、Hd 分別向低場移動了0.38、0.31、0.52、0.57 ppm，而香豆素中的質(zhì)子He 幾乎沒有發(fā)生位移，再次說明與Hg2+配位的是寡聚芳酰胺中的羰基氧，與紅外光譜的結(jié)論一致。

圖8 300 K下COA、COA和Hg2+絡合物（2.0×10-3 mol/L）的核磁共振氫譜Fig.8 1H NMR spectra of COA，COA and Hg2+ complex（2.0×10-3 mol/L） at 300 K

結(jié)合以上分析，推測探針COA 和Hg2+的識別機理如圖9所示。加入Hg2+前，在365 nm激發(fā)波長下，COA 探針中寡聚芳酰胺羰基氧上的孤對電子向熒光基團香豆素轉(zhuǎn)移，發(fā)生光誘導電子轉(zhuǎn)移（PET），使得探針COA 僅發(fā)出微弱的熒光；當探針COA 與Hg2+作用后，由于羰基氧上的孤對電子參與配位，無法發(fā)生PET 過程，從而使得探針在515 nm處發(fā)出很強的熒光。

圖9 COA與Hg2+的識別機理Fig.9 Recognition mechanism of COA and Hg2+

2.7 探針對水樣中Hg2+的檢測

選取西河河水和實驗室自來水為待測水樣，分別進行1.0、5.0、10.0、15.0（×10-6mol/L）水平的加標實驗，每個水平平行測定5次。結(jié)果如表1所示，水樣中Hg2+的回收率為97.0%～104%，相對標準偏差（RSD）為1.5%～2.5%。汞質(zhì)控樣的檢測結(jié)果在1倍偏差范圍。

表1 實際水樣中Hg2+的加標回收率和相對標準偏差Table 1 Recoveries and RSDs of Hg2+in different real water samples

為進一步拓展探針COA 的應用范圍，檢驗其廢水處理能力，本研究選取某城鎮(zhèn)污水處理廠進出口排放的廢水為樣品，分別采用COA 探針和現(xiàn)行標準原子熒光法［40］進行測定，結(jié)果見表2。由表可知，探針COA 的檢測結(jié)果與原子熒光法的檢測結(jié)果基本一致，表明探針COA 適用于不同類型水樣中Hg2+的定量檢測，且具有很高的準確度和精密度。

表2 COA探針和原子熒光法對廢水中Hg2+的檢測結(jié)果對比Table 2 Comparison of determination results of Hg2+ by COA fluorescence probe and atomic fluorescence spectrometry

3 結(jié) 論

本文設計合成了一種新型的基于香豆素的寡聚芳酰胺類熒光探針COA，該探針可高效識別Hg2+，且具有較強的抗干擾性和較好的可逆性。COA 探針可與Hg2+形成1∶1 配合物，IR 和1H NMR 實驗結(jié)果推測探針COA 熒光強度顯著增強是PET 過程中斷所致。該探針對Hg2+的檢出限為2.08×10-7mol/L，滿足世界衛(wèi)生組織對飲用水的最低允許濃度要求，也低于我國《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》（GB 3838-2002）Ⅲ類水中Hg2+的標準限值。該探針適用于不同水樣中Hg2+的定量檢測，且準確度和精密度較高，滿足水質(zhì)檢測相關要求。