孟領(lǐng)航, 張 威, 王佳佳

(河南大學抗體藥物開發(fā)技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室,河南, 開封 475000)

蛋白質(zhì)翻譯后修飾是維持生命活動的重要過程,包括磷酸化、乙酰化和甲基化等多種類型,其中糖基化也是重要的一種類型。糖基化是指糖類與蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的共價連接,是結(jié)構(gòu)最多樣化的翻譯后修飾,常見參與蛋白質(zhì)糖基化的單糖有 9 種:葡萄糖(glucose, Glc)、半乳糖(galactose, Gal)、甘露糖(mannose,Man)、N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine,GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine,GlcNAc)、 葡萄糖醛酸(glucuronic acid, GlcA)、木糖(xylose, Xyl)、巖藻糖(fucose,Fuc)和N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetylneuraminicacid,NeuAc)。根據(jù)糖與蛋白質(zhì)的連接方式不同可將蛋白聚糖分為N-連接型聚糖(N-linked glycan)和O-連接性聚糖(O-linked glycan)。本文主要圍繞一種簡單的單糖修飾O-GlcNAc修飾進行綜述。

1 O-連接-N-乙酰葡糖胺糖基化

O-GlcNAc 糖基化是一種在原核生物和真核生物中廣泛存在的糖基化形式。己糖胺生物合成途徑(hexosamine biosynthetic pathway, HBP,Fig.1)是O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)的主要生物來源,雖然進入細胞的大部分葡萄糖是通過糖酵解代謝為機體提供能量,但有 2%～5%的葡萄糖會被分流到 HBP,以細胞內(nèi)的 L-谷氨酰胺(L-glutamine)、乙酰輔酶 A(acetyl-CoA)和三磷酸尿苷(uridinetriphosphate,UTP)為原料,在 6-磷酸果糖氨基轉(zhuǎn)移酶(glutamine--fructose-6-phosphate aminotransferase,GFAT)等酶的作用下合成糖基供體 UDP-GlcNAc。與其他O-和N-糖修飾不同,O-GlcNAc 糖基化修飾特別之處在于:(1)O-GlcNAc 修飾是將 GlcNAc 單糖分子以β-O 的連接方式附著在細胞核、細胞質(zhì)和線粒體蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸殘基上[1-3],由于與蛋白質(zhì)磷酸化的修飾位點相同,兩種修飾形式之間存在互相拮抗或促進的陰陽關(guān)系[4];(2)O-GlcNAc 修飾是一個高度動態(tài)的過程,蛋白質(zhì)中O-GlcNAc 的添加和去除是通過在真核生物中高度保守的 2 種緊密調(diào)控的酶的作用而維持,這種可逆的修飾確保細胞中O-GlcNAc 水平保持平衡。其中,O-GlcNAc 轉(zhuǎn)移酶(O-GlcNActransferase,OGT)將 HBP 通路合成的 UDP-GlcNAc 作為供體連接到目的蛋白質(zhì)[5,6],而水解酶O-GlcNAcase(OGA)主要負責去除底物中的O-GlcNAc[7, 8](Fig.1)。

Fig.1 Hexosamine-biosynthesis pathway in vivo UDP-GlcNAc is de novo synthesized from HBP, which is linked with glucose metabolism, fatty acid metabolism, amino acid metabolism, and nucleotide metabolism. The generated products of UDP-GlcNAc is transferred by OGT onto Ser/Thr residues of target proteins and removed by OGA

O-GlcNAc 修飾廣泛存在于哺乳動物細胞中,且在細胞的生命活動中起發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[9,10],目前已證明,該修飾與糖尿病、癌癥[11]、信號傳遞[12,13]、應激反應[14]、抑郁和神經(jīng)衰退性疾病等密切相關(guān)[15]。O-GlcNAc 糖基化修飾蛋白質(zhì)是一個重要的營養(yǎng)傳感器,廣泛調(diào)控重要的生理過程,例如在Ⅱ型糖尿病中礦化皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptor,MR)的O-GlcNAc 糖基化修飾會增加高糖條件下受體的轉(zhuǎn)錄活性[16]。其次,越來越多的證據(jù)表明,O-GlcNAc 修飾對癌癥的進展發(fā)揮促進作用,并且腫瘤細胞內(nèi)的 OGT 和O-GlcNAc 糖基化水平比正常細胞要高,例如,O-GlcNAc 修飾可通過調(diào)節(jié)谷氨酰胺途徑的關(guān)鍵酶蘋果酸脫氫酶 1(malate dehydrogenase 1,MDH1)的活性,或上調(diào)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的去乙?；?sirtuin 家族成員 SIRT7 的表達來促進胰腺導管腺癌的生長[17, 18],同時有研究表明,蘇氨酸蛋白激酶(threonine-protein kinase,PLK1)的O-GlcNAc 修飾通過影響其有絲分裂功能進而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[19]。另外,O-GlcNAc 修飾還可以在腫瘤的“Warburg 效應”中發(fā)揮直接作用,例如磷酸甘油酸激酶 1(phosphoglycerate kinase 1,PGK1)的 T255O-GlcNAc 修飾會促進糖酵解,降低三羧酸循環(huán),進而促進腫瘤發(fā)生[20]。此外,OGT 作為一種營養(yǎng)感應酶在細胞間信息傳遞中發(fā)揮重要作用[21],有研究表明,酪氨酸激酶底物的O-GlcNAc 修飾會抑制表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)在腔內(nèi)的分選以及溶酶體內(nèi)的降解,導致 EGFR 的積累,延長 EGFR 在細胞中的信號傳導[22]。

2 O-連接-N-乙酰葡糖胺糖基化修飾蛋白質(zhì)的富集方法

盡管O-GlcNAc 糖基化修飾在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要功能,然而因為其修飾位點鑒定比較困難,相關(guān)領(lǐng)域的研究仍存在瓶頸,其主要原因有:首先,O-GlcNAc 糖基化是一種動態(tài)的、低豐度和亞化學計量的修飾;其次,GlcNAc 糖苷鍵不穩(wěn)定,無論是酶法還是化學方法,在標準質(zhì)譜檢測中很容易脫落,同時O-GlcNAc 修飾肽的離子信號會被大量未修飾的離子信號掩蓋而被抑制;此外,由于 OGT 識別缺乏明確的一致序列,使得僅基于一級序列的體內(nèi)修飾位點的特異性確定困難。為了更深入研究O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì),多年來已經(jīng)開發(fā)了多種方法用于檢測O-GlcNAc 的位點定位,已鑒定超過 5 000 個人類O- GlcNAc 糖基化蛋白質(zhì)和 7 000 個糖基化位點[23]。下面本文將介紹多種策略在體外和體內(nèi)富集和檢測O- GlcNAc 糖蛋白質(zhì)方面的應用、優(yōu)勢和局限性。

2.1 抗體和凝集素法

抗體是研究生物大分子相關(guān)修飾的重要工具,目前,已有幾種能夠檢測胞質(zhì)和核提取物中的商業(yè)化O-GlcNAc 抗體。利用 Western 印跡通過泛特異性O(shè)-GlcNAc 單克隆抗體 RL2(一種針對O-GlcNAc 修飾的糖基化核孔蛋白片段 IgG 型抗體)[24]和 CTD110.6(一種 IgM 類抗體,使用合成的 RNA 聚合酶 II C 端 O-GlcNAcylation 重復序列作為免疫原)[25],已經(jīng)鑒定了許多O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)。然而,由于這些抗體特異性有限,存在交叉反應性以及結(jié)合親和力相對較低等問題[26],單個修飾的、低豐度的O- GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)的檢測仍存在困難。其次,一些抗O-GlcNAc 小鼠單克隆抗體可以特異性識別末端O-GlcNAc 結(jié)構(gòu),例如 HGAC39 和 85[27],10D8[28], 以及 3 種使用合成的O-GlcNAc 糖肽類抗原開發(fā)的IgG 單克隆抗體(18B10.C7(#3)、9D1.E4(#10)和 1F5.D6(#14))[29],IgM CTD110.6、IgG 單抗18B10.C7(#3)和 9D1.E4(#10)可以特異性地檢測細胞表面糖蛋白質(zhì)的 GlcNAc 修飾,這些抗體與 1F5.D6(#14)混合也能夠結(jié)合N-糖的末端 β-GlcNAc[30, 31]。此外,還有一些位點特異性的O-GlcNAc 抗體,例如針對特定蛋白質(zhì)中獨特的O-GlcNAc 表位,包括 c-Myc(Thr58)[32],Tau 蛋白(Ser400)[33],組蛋白H2A(Ser40、Thr101)[34]和 TAB1(Ser395)[35]等,這些抗體讓我們對O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)功能的研究更加精確。這些抗體能用于檢測O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì),但仍需開發(fā)更多的O-GlcNAc 特異性 IgG 抗體,對O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)進行更深入地研究。

植物凝集素作為天然的糖物質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì),已長期用于識別O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)的研究,特別是小麥胚芽凝集素(wheat germ agglutinin,WGA)。WGA 不僅可以結(jié)合細胞內(nèi)的O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì),而且可以結(jié)合N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-Acetylneuraminic acid ,Neu5Ac)和糖聚合物以及低聚糖上的末端GlcNAc 殘基[36]。琥珀?；?WGA(sWGA)對O-GlcNAc 的特異性更高,但它也降低了未修飾的 WGA 的親和力,所以這種凝集素僅作為純化和免疫印跡的富集工具[37]。最近,來源于真菌的其他凝集素已被鑒定出對O-GlcNAc 有更強的親和力[38],這可能也為后續(xù)O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)的鑒定提供新的工具。但由于植物凝集素的局限性,其只能作為O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)的廣譜性探針,無法特異性標記O- GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)。

2.2 化學酶法

化學酶法是對O-GlcNAc 修飾的體外間接標記,不會干擾體內(nèi)代謝途徑,可以標記細胞生理過程中自然發(fā)生的O-GlcNAc 修飾。檢測細胞中O-GlcNAc 修飾的經(jīng)典化學酶法策略依賴于 β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(β-1,4-galaetosyltransferase,GalT)。GalT 可以 UDP-[3H]-半乳糖為供體,將[3H]-半乳糖標記在糖蛋白末端O-GlcNAc 殘基的 C4-羥基上。由于這種方法需要處理放射性物質(zhì),因此不適合常規(guī)應用。Hsieh-Wilson 課題組構(gòu)建了 GalT 的突變體 GalTY289L[39],該突變體具有更大的活性位點,能夠容納 C2 修飾的半乳糖類似物,能將 2-酮-半乳糖殘基從相應的非天然糖核苷酸轉(zhuǎn)移到末端的O-GlcNAc 殘基,且不影響酶的特異性和催化效率[40],研究者運用該策略發(fā)現(xiàn),蘋果酸脫氫酶和受體酪氨酸激酶底物的O-GlcNAc 修飾可以調(diào)控腫瘤生長[41, 42]?；瘜W酶法還能夠以非天然酮基為化學把手標記O-GlcNAc 修飾的蛋白質(zhì),隨后,通過肟與氨基氧功能化的生物素探針與非天然酮基連接,再通過化學發(fā)光法檢測目的蛋白質(zhì)。這種生物素標記策略可以從細胞裂解液中富集O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)并進行蛋白質(zhì)組學分析,最終,在哺乳動物大腦中鑒定到多種功能和多樣的O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì),進一步揭示了這種修飾在調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[43]。此外,化學酶法還可以對不同預處理的細胞進行酮生物素標記,然后通過還原胺化將輕/重甲基摻入肽的胺中,通過相對定量質(zhì)譜分析檢測大腦中動態(tài)的O-GlcNAc 修飾位點[44]。Hsieh-Wilson 課題組進一步擴展了該工具的使用范圍,使用了另一種含疊氮化物的半乳糖胺供體(UDP-GalNAz),該供體對 GalT(Y289L)耐受良好,可以將非天然的 UDP-GalNAz 轉(zhuǎn)移到O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)上,與相應的氨基氧基標記相比,這種改進的策略使炔基生物素和熒光探針能夠更敏感、更快速和更特異性的進行點擊化學反應標記,并直接用于細胞內(nèi)的凝膠內(nèi)熒光檢測和O-GlcNAc 糖基化蛋白組學鑒定[45]。這種先進的化學酶學策略被用于檢測和驗證神經(jīng)系統(tǒng)和代謝中許多重要調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的O- GlcNAc 修飾,例如,在缺氧條件下磷酸化磷酸果糖激酶 1(6-phosphofructokinase1,PFK1)的 Ser529 位點動態(tài)糖基化,可以作為與體內(nèi)癌細胞生長相關(guān)的葡萄糖代謝的關(guān)鍵代謝調(diào)節(jié)因子[46]。以上化學酶法標記策略通常為兩步法,近期浙江大學易文教授團隊研究發(fā)現(xiàn),K279A 突變體可以識別 2 位生物素修飾的 UDP-GalNAc,并以此為底物開發(fā)了一種一步法標記O-GlcNAc 糖基化蛋白質(zhì)的策略[47]。這些化學酶方法已廣泛應用于細胞水平的O-GlcNAc 糖基化,該方法主要針對變性蛋白質(zhì)樣本,不太適用于體內(nèi)天然的和完全折疊的蛋白質(zhì)。然而,工程酶和非天然底物的使用,可能會導致酶的底物偏好和識別所固有的特異性以及反應性問題,同時也可以改變細胞代謝途徑,可能提供不完整、不準確和/或非生理相關(guān)的信息。因此,對于更有效的O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)的鑒定和位點定位,化學酶學方法仍有需提高的空間來解讀它們的功能作用和分子機制。

2.3 親水作用液相色譜法(hydrophilic interaction chromatography,HILIC)

親水作用液相色譜是一種出色的色譜技術(shù),其利用O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)中的羥基與固定相(例如胺、酰胺或齊聚物鍵合硅膠)之間的親水/極性/氫相互作用,有效地保留和分離糖與蛋白質(zhì)分子。HILIC 已成為富集糖肽的有力工具[48]。近些年,有利用選擇性酶解和親水性微粒提高富集效果的方法,該方法包括兩個步驟:(1)利用 PNGase F(peptide:N-glycosidase F)、唾液酸酶和O-糖苷酶移除N-聚糖和O- 聚糖;(2)用表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(SI-ATPR)合成的新型 HILIC 材料親水性聚合物,修飾二氧化硅微顆粒(pPEGMA-SMs),可與O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)高度特異性結(jié)合。該材料主要使用聚乙二醇甲基丙烯酸酯(poly(ethylene glycol) methacrylate,PEGMA)合成親水固定相,并在其表面沿羥基基團密集堆積,從而使其與O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)結(jié)合[49]。與傳統(tǒng)的 HILIC 材料相比,這種材料主要使用聚乙二醇甲基丙烯酸酯合成親水固定相,其表面沿 PEGMA 聚合物刷密集堆積的羥基,提供了更高的親水性和更強的氫鍵相互作用。利用這種方法分析人體尿液中的O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn),從 457 個蛋白質(zhì)中鑒定出了 474 個O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)。雖然這種方法很有效果,但它無法區(qū)分腫瘤組織中含量較高的O-GalNAc 修飾蛋白質(zhì)。最近,氮氧化物接枝納米球在O-GlcNAc 分析中顯示氫鍵相互作用顯著增強,對來自 PNAC-1 細胞的O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)進行了位點特異性分析,從 183 個糖蛋白中又發(fā)現(xiàn)了197 個O-GlcNAc 位點,這表明O-GlcNAc 修飾的高通量鑒定是成功的[50]。關(guān)于富集O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)的效果,仍需要進一步嚴格評估。

2.4 非天然糖代謝標記策略

為了克服上述在檢測O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)時的特異性和效率方面的限制以及細胞毒性問題,人們開發(fā)了一種糖代謝標記策略用于標記聚糖。糖代謝標記(metabolic glycan labeling, MGL)是將疊氮或者炔基等基團修飾天然糖,該類修飾在不影響細胞正常代謝功能的前提下可以經(jīng)由相應的代謝通路標記到聚糖結(jié)構(gòu)中,隨后與互補的生物正交反應基團進行反應,通過引入熒光基團或者生物素等基團,實現(xiàn)示蹤定位和目標蛋白質(zhì)富集等目的[51],常用的報告基團有疊氮[52]、酮[40, 43]、炔[53]和異腈[54]等。前文提到,HBP 是細胞內(nèi)合成 UDP-GlcNAc 的主要來源,此外,該底物還可以通過 GlcNAc 和 GalNAc 補救途徑生成。首先,細胞內(nèi)不被降解的 GlcNAc(例如,來自溶酶體對糖共軛物的降解或營養(yǎng)成分的降解)和細胞外攝入的 GlcNAc 可以直接被 GlcNAc 激酶(N-acetyl-D-glucosamine kinase,NAGK)和磷酸乙酰葡糖胺變位酶(phosphoacetylglucosamine mutase,PGM3)先后發(fā)生 6 位磷酸化和 1 位磷酸化,最后經(jīng) UDP-N-乙酰己糖胺焦磷酸化酶(UDP-N-acetylhexosamine pyrophosphorylase,AGX1/2)有效地轉(zhuǎn)化為 UDP- GlcNAc(Fig.2)。同時還存在另外一條 GalNAc 補救途徑,即 GalNAc 進入細胞后可以經(jīng)由N-乙酰半乳糖胺激酶(N-acetylgalactosamine kinase,GALK2)和 AGX1/2 生成 UDP-GalNAc,隨后,經(jīng) UDP-半乳糖-4-異構(gòu)酶(UDP-glucose 4-epimerase,GALE)將其轉(zhuǎn)變?yōu)?UDP-GlcNAc 進而被 OGT 識別和利用。目前,人們發(fā)現(xiàn) OGT 對底物具有較高的容忍度,可以識別多種結(jié)構(gòu)修飾的 UDP-GlcNAc 衍生物[55]。由于 OGT 的這一特性,使得各種乙酰化修飾的 GlcNAc 衍生物有成為化學報告標簽的可能,這些報告標簽在進入細胞后被代謝加工成非自然的 UDP 糖供體,通過 OGT 轉(zhuǎn)移標記目標蛋白質(zhì)。Bertozzi 團隊于 2003 年報道了第一個用于O-GlcNAc 糖基化標記的探針 2-疊氮乙酰氨基-2-脫氧吡喃葡萄糖(Ac4GlcNAz)[52],該課題組將生物惰性疊氮基團引入到 GlcNAc 乙酰氨基部分得到目標分子 Ac4GlcNAz,該分子可以通過GlcNAc 補救途徑的生物合成酶生成 UDP-GlcNAz,進而被 OGT 識別并用該非天然的糖供體將 GlcNAz 代謝到絲氨酸/蘇氨酸殘基中,從而產(chǎn)生含有疊氮標簽標記的蛋白質(zhì),再通過生物正交反應(staudinger 或者 CuAAC)進一步檢測該非天然糖的細胞分布和位點功能鑒定[56-58]。

Fig.2 Different biosynthetic pathways of GlcNAc and workflow for labeled proteomic analysis Three pathways for synthesis of GlcNAc, including de novo hexosamine biosynthetic pathway (left), GlcNAc salvage pathway (center), GalNAc salvage pathway (right); The generated UDP-GlcNAc could be recognized by OGT for O-GlcNAc modification. General workflow for proteomic analysis after metabolic labeling and enrichment

Fig.3 MCRs have been reported for labeling and identification of O-GlcNAc modified proteins MCRs equipped with a bioorthogonal chemical handle is incubated with cells. Once inside the cells, the MCRs are processed by the enzymes in biosynthetic pathway and the generated UDP-sugars bearing the chemical handle can be recognized and incorporated into glycan-modified proteins, which will be utilized for visualization or affinity purification through bioorthogonal reaction with fluorescent dyes or biotin

由于 GlcNAc 補救途徑中限速酶 AGX1 的影響,Ac4GlcNAz 代謝標記效率較低,且存在非特異性糖基化標記。前期研究表明,GlcNAz 不僅被代謝入細胞內(nèi)的O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)中,而且還直接摻入N-鏈聚糖的核心五糖中[59]。此外,由于 UDP-GlcNAc 可以通過 UDP-半乳糖-4-異構(gòu)酶(GALE)相互轉(zhuǎn)化為 UDP-GalNAc,相應的 GlcNAz 也可以交替地并入粘蛋白型O-聚糖[60],進一步降低了標記的特異性和效率?；诖?Bertozzi 團隊設(shè)計合成了另外一種分子探針 Ac4GalNAz,該分子經(jīng)與細胞共孵育后,可以通過 GalNAc 補救途徑中的酶代謝合成 UDP-GalNAz,并由 GALE 異構(gòu)合成 UDP-GlcNAz,且其比Ac4GlcNAz 對O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)標記效果更強烈[61]。盡管 Ac4GalNAz 也會被代謝標記到細胞表面的O-/N-糖鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較高的背景信號,然而該探針仍是目前富集O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)和位點鑒定的主要手段[62]。

此外,Pratt 課題組在 2-乙酰基位置引入炔基制備得到 Ac4GlcNAlk,結(jié)果表明,GlcNAlk 能夠以與GlcNAz 相似的速率從目標蛋白質(zhì)中添加和去除,并且不容易通過 GALE 相互轉(zhuǎn)化為 GalNAlk,導致標記的O-鏈粘蛋白糖蛋白水平較低。與 Ac4GlcNAz 和 Ac4GalNAz 相比,Ac4GlcNAlk 是一個更具特異性的O-GlcNAcylation 報告探針,使用此探針并結(jié)合生物正交標記,使用可切割的生物素親和標簽共鑒定到 374 個O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì),其中大多數(shù)以前未報道過(例如,泛素連接酶 NEDD4-1)[63]。然而,Ac4GlcNAlk 仍然會被整合到N-糖鏈中,導致其不能成為完全特異性的O-GlcNAcylation 報告探針。此后,該課題組在 GlcNAc 的 6 位引入疊氮基團制備獲得 Ac36AzGlcNAc[64]。研究發(fā)現(xiàn),該分子由于 C6 羥基被疊氮基取代不能發(fā)生 6 位磷酸化,因此,該化合物不能通過典型的 GlcNAc 補救途徑生物合成相應的 UDP-糖供體,作者進一步研究表明,6AzGlcNAc 可以通過 C1-羥基直接磷酸化來繞過這個最初的生物合成步驟,然后回到挽救途徑通過 AGX1 得到相應的 UDP-6AzGlcNAc,最終被 OGT 識別用于O- 6AzGlcNAcylation;隨后使用全乙酰化的 6AzGlcNAc、GlcNAz 和 GalNAz 進行蛋白質(zhì)組學研究,結(jié)果差異表明,與 GlcNAz 和 GalNAz 相比,6AzGlcNAc 對O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)具有高度特異性,幾乎不標記其他類型的聚糖結(jié)構(gòu)[64]。2017 年,該課題組將6 位的疊氮基團替換為炔基,命名為 Ac36AlkGlcNAc[65]。運用 Ac36AlkGlcNAc 進行化學蛋白質(zhì)組學分析可以鑒定到更多潛在的O-GlcNAc 修飾蛋白質(zhì)(包括caspases-3 和-8),表明其具有更高的效率和選擇性。為了避免糖探針在其他糖鏈結(jié)構(gòu)的非特異性標記,基于 GlcNAc 和 GalNAc 在其他糖鏈結(jié)構(gòu)中多以β-1,4 糖苷鍵連接,我們課題組前期開發(fā)了 4 位脫氧的小分子探針 Ac34deoGlcNAz,以提高探針的特異性,結(jié)果表明,該探針可以減少在細胞膜上的標記且所標記蛋白質(zhì)約 98%為胞內(nèi)蛋白質(zhì),顯示出較高的特異性[66]。隨著人們對探針功能的期望越來越高,基于不同目的的各種修飾應運而生,例如在 GlcNAc 的 2 位引入雙吖丙啶基團得到 Ac3GlcNDAz-1-P(Ac- SATE)2,通過生物合成可以得到O-GlcNDAz 修飾蛋白質(zhì),經(jīng)紫外線照射產(chǎn)生碳自由基可以與修飾蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)的近端結(jié)合發(fā)生光交聯(lián)[67],實現(xiàn)O-GlcNAc 糖蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)的捕獲和鑒定目的。Vocadlo 團隊在 GlcNAc 的 2 位引入一個熒光基團香豆素,并制備獲得自帶熒光的分子探針Glucosamine-nitrobenzoxadiazole(GlcN-NBD),該分子可以直接實現(xiàn)細胞內(nèi)O-GlcNAc 糖基化修飾的可視化,并通過雙熒光脈沖等實驗驗證了該探針對O-GlcNAc 標記的特異性。此外,其他非N-乙酰胺基葡萄糖單糖,例如 2-和 6-疊氮基團修飾的葡萄糖和半乳糖類似物(2AzGlc/GlcAz 和 6AzGlc/6AzGal)[68- 70],其相應的 UDP-糖結(jié)構(gòu)也可以被 OGT 識別并進行標記。

2018 年北京大學陳興教授團隊發(fā)現(xiàn),全乙?；翘烊惶侨菀着c細胞內(nèi)的半胱氨酸殘基發(fā)生非酶介導的副反應,將會干擾其正常代謝且導致O-GlcNAc 糖基化蛋白組學鑒定的假陽性[71]。這種非酶介導的副反應,稱為 S-連接的糖基化修飾,其發(fā)生機制為全乙?；姆翘烊惶沁M入細胞后,當 1 位羥基優(yōu)先裸露時堿性條件下容易發(fā)生 β-消除形成 α,β 不飽和醛,進而與含巰基的蛋白質(zhì)發(fā)生邁克爾加成反應得到3 位取代的 S-糖基化副產(chǎn)物[72]。在此基礎(chǔ)上,該課題組先后報道了 2 種改進的非天然糖 1,3-Pr2GalNAz[73]和 1,6-Pr2GalNAz[72]。利用這種新型的非天然糖,作者在小鼠胚胎干細胞中發(fā)現(xiàn) ESRRB(estrogen related receptor beta)(Ser25)可發(fā)生O-GlcNAc 糖基化,且在干細胞的再生和多能性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外,鑒于糖環(huán)結(jié)構(gòu)中 3,4 位乙?；谋Ｗo會促使 β-消除介導的 S-連接糖的副反應,Pratt 課題組僅在 GlcNAlk 結(jié)構(gòu)的 1 位引入己烷鏈得到 1-Hex-GlcNAlk,其中較長的烷烴鏈結(jié)構(gòu)可以平衡非天然糖的脂水分配系數(shù),由此可以協(xié)助探針跨膜進而提高代謝標記效率[74]。此外,本課題組長期致力于新型O-GlcNAc 糖基化探針的開發(fā),先后合成了 Ac34deoGlcNAz[75],Ac34FGlcNAz[76]和 Ac36deoGlcNAz[77]3 種探針,研究結(jié)果表明,糖環(huán)上不同位置的修飾均可以顯著降低 S-糖修飾水平,此外,通過 Western 印跡和蛋白組學等多種方法證明,這 3 種探針對細胞內(nèi)的O-GlcNAc 糖基化修飾具有較高的選擇性,并且仍保留較高的標記效率。

目前所報道的探針主要集中在細胞層面,而腫瘤微環(huán)境中細胞之間的復雜相互作用會影響蛋白質(zhì)的表達修飾和功能,因此,研究自然狀態(tài)下活體腫瘤組織中糖基化蛋白質(zhì)修飾的動態(tài)變化更具有臨床價值。已有研究報道,O-GlcNAc 糖基化不僅直接參與調(diào)控腫瘤的增殖和凋亡等,而且會影響腫瘤微環(huán)境中 T細胞、巨噬細胞等免疫細胞的活化及其對腫瘤的調(diào)控[78, 79]。更重要的是,部分蛋白質(zhì)的O-GlcNAc 糖基化只有在低氧[80]、IL-8 浸潤[81]等特定腫瘤微環(huán)境中發(fā)生。因此,探究腫瘤組織中O-GlcNAc 糖基化修飾蛋白質(zhì)動態(tài)變化才能如實反映腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機制。Bertozzi 團隊首次將新鮮的人前列腺正常組織和腫瘤組織切片與 Ac4ManNAz 共孵育進行唾液酸代謝標記,經(jīng)與生物素-炔基反應、蛋白質(zhì)富集和質(zhì)譜分析,發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中唾液酸修飾水平較高,其中 21 種蛋白質(zhì)只在腫瘤細胞中表達(例如豆莢蛋白),并且部分蛋白質(zhì)已被報道與前列腺癌的惡性發(fā)生有密切關(guān)系[82]。2022 年,陳興教授等團隊先后開發(fā)了一種可基因編碼的代謝聚糖標記技術(shù),該策略基于化學生物學“凹凸互補”原理,利用非天然糖 1,3- Pr2GlcNAl 及其匹配的焦磷酸酶突變體 AGX2 F383G 的正交組合,以小鼠心血管為模型實現(xiàn)對特定組織細胞的聚糖分析[83];同時 Schumann 團隊利用相同的理論開發(fā)了一種糖蛋白生物正交細胞系特異性標記(BOCTAG)技術(shù),該策略在多種細胞共培養(yǎng)以及小鼠模型中都可以成功標記特定位點蛋白質(zhì)[84]。此外,易文教授團隊利用光控激活策略,使 OGT 關(guān)鍵活性位點(K842)脫籠并恢復活性,在活細胞內(nèi)實現(xiàn)對O-GlcNAc 糖基化蛋白質(zhì)時空分辨的動態(tài)調(diào)控[85]。2023 年,Christina 等人構(gòu)建了 4-羥基他莫昔芬(4-HT)響應的 OGA-內(nèi)涵肽,活化后的 OGA 可以在細胞特定區(qū)域去糖基化,并對 MCF-7 細胞具有顯著的抑制作用,該策略為時空調(diào)控生物體內(nèi)的O-GlcNAc 修飾和生物學功能提供了可行性[86]。因此,基于腫瘤細胞自身特點開發(fā)高效、特異并可時空動態(tài)檢測活體腫瘤內(nèi)O-GlcNAc 糖基化修飾蛋白質(zhì)標記技術(shù),將為闡明糖代謝相關(guān)疾病的發(fā)病機制和靶向治療提供突破口。

3 問題與展望

蛋白質(zhì)糖基化作為一種真核生物中廣泛存在的翻譯后修飾,在許多生命活動中發(fā)揮重要作用。異常的糖基化修飾,包含N-/O-聚糖修飾,O-GlcNAc糖基化等,已被報道參與了多種癌癥的發(fā)生發(fā)展,針對糖蛋白和聚糖的鑒定及分析對于理解糖基化修飾在腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病機制中至關(guān)重要。由于O- GlcNAc修飾是動態(tài)、化學計量的單糖修飾,為了提高實驗對象中O-GlcNAc修飾水平,過表達OGT或者添加OGA抑制劑是常用的研究策略。此外,隨著糖代謝標記策略的涌現(xiàn),雖然可以富集到更多特異的目的蛋白質(zhì),但是這些額外添加物是否影響細胞的正常合成代謝以及相應修飾蛋白質(zhì)的生理學功能尚不清楚。因此尋求安全可靠、特異性好的富集方法是解決糖修飾蛋白質(zhì)功能研究的重要途徑。

近期,基于“凹凸理論”設(shè)計合成的突變轉(zhuǎn)移酶和底物的特異性識別策略已成功用于O-GlcNAc[87]和O-GalNAc 修飾[88, 89],該策略通過在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)入底物特異性強的轉(zhuǎn)移酶載體,進而可以實現(xiàn)對特定細胞和組織內(nèi)蛋白質(zhì)的標記,具有干擾小、特異性強等特點。另外,多組學、多功能酶類等“一石多鳥”策略可以實現(xiàn)同時對N-連接、黏蛋白型O-連接和O-GlcNAc 修飾完整糖肽的富集及分析(Click- iG 策略)[90],或者利用特異性識別核心巖藻糖基化和O-GlcNAc 糖基化的酶、疊氮化探針分子和功能化溫度敏感的富集材料,同時實現(xiàn) 2 種糖基化位點的精準解析[91]。這些新型策略提高了目的蛋白質(zhì)的富集效率和特異性,有助于探究糖修飾在相關(guān)疾病進展中的機制研究?？傊?本文綜述的多種O- GlcNAc 糖基化修飾蛋白質(zhì)富集方法,極大程度改善了質(zhì)譜檢測過程中的信噪比,進而便于精準檢測分析。隨著科學研究和儀器設(shè)備的不斷進步,我們相信,復雜機體環(huán)境中包括O-GlcNAc 在內(nèi)的糖蛋白質(zhì)特異性修飾和精準鑒定一定會迎刃而解,這對闡明糖修飾在相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用至關(guān)重要,也是實現(xiàn)臨床分子診斷并進行靶向干預的關(guān)鍵。