張斯瑋, Gwyn T. Williams

(1)西安醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室, 西安 710021;2)西安醫(yī)學(xué)院 西安市病原微生物與腫瘤免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 西安 710021;3)School of Life Sciences, Keele University,Staffordshire, UK)

慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)由原始造血干細(xì)胞(primitive hematopoietic stem cells)的惡性轉(zhuǎn)化(neoplastic transformation)引起,并影響所有造血細(xì)胞譜系(hematopoietic cell lineages)[1]。CML的染色體缺陷源于多能干細(xì)胞中斷裂點(diǎn)簇集區(qū)BCR(breakpoint cluster region)和 艾貝爾遜鼠白血病病毒癌基因ABL(Abelson murine leukemia viral oncogene)基因的融合,產(chǎn)生的費(fèi)城染色體(Ph)和BCR-ABL1融合基因是CML的特征。表達(dá)的促癌蛋白質(zhì)BCR-ABL1具有高酪氨酸激酶活性,可激活不同的信號(hào)通路,抑制CML細(xì)胞凋亡和促進(jìn)其增殖[2]。伊馬替尼(imatinib,IM)仍是有效的CML一線治療藥物[3]。

生長(zhǎng)阻滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5(growth-arrest specific transcript 5,GAS5)屬于長(zhǎng)非編碼RNA。GAS5最早被發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)停滯的細(xì)胞中有累積[4]。在多數(shù)報(bào)道中,GAS5是腫瘤抑制因子,在腫瘤中低表達(dá),可以通過(guò)促進(jìn)凋亡、抑制細(xì)胞增殖而發(fā)揮抑瘤的作用[5-6])。體外研究表明,GAS5過(guò)表達(dá)抑制癌細(xì)胞增殖[7-8]和集落形成能力[9],促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[7-10],抑制癌細(xì)胞侵襲能力[11-12]和抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程[13-14],并且可能經(jīng)由抑癌基因PTEN實(shí)現(xiàn)抑癌作用[7,9,11-12,15],或通過(guò)抑制AKT/mTOR通路抑癌[8]。此外,GAS5表達(dá)水平能影響細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑(例如阿霉素、5-氟尿嘧啶、多烯紫杉醇和順鉑)的反應(yīng)[16-18],從而對(duì)癌癥的耐藥性具有調(diào)節(jié)作用,例如GAS5介導(dǎo)乳腺癌的阿霉素耐藥性[6]。GAS5的表達(dá)水平也會(huì)受到抗癌藥物的調(diào)控[19]。此外,GAS5能增加電離輻射引起的細(xì)胞凋亡,并可能使腫瘤對(duì)放射治療敏感[20-21]。并且GAS5對(duì)于凋亡的作用不限于腫瘤細(xì)胞中[22-23]。

GAS5有多種剪接變異體(splicing variant),然而,目前對(duì)于GAS5剪接變異體的種類仍有待研究。GAS5共有11個(gè)內(nèi)含子[24],其中包含進(jìn)化中保守的snoRNAs(小核仁RNA)[25]?；诒磉_(dá)系列標(biāo)簽(expressed sequence tag,EST)數(shù)據(jù)推測(cè)以及通過(guò)使用基因預(yù)測(cè)方法自動(dòng)計(jì)算(BestRefSeq)分析,列出2種只含有外顯子的成熟形式GAS5a和GAS5b(GAS5b較長(zhǎng)),以及部分帶有內(nèi)含子序列的剪接變異體包括:(1)GAS5_1B:IMAGE clone 6194071,1 249 bp;(2)GAS5_2B:IMAGE clone 2598129,1 270 bp;(3)GAS5_O1:IMAGE clone 3585621,1 396 bp;(4)GAS5_3A:IMAGE clone 5739605,1 802 bp;(5)GAS5_4A:IMAGE clone 2761825,1 802 bp[4,26-27]。GAS5a和GAS5b是最早發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄物(區(qū)別在外顯子7的選擇性剪接),在大多數(shù)細(xì)胞中主要表達(dá)GAS5b(含有較長(zhǎng)的外顯子7,記為GAS5_AE,即variant 1)[25-26]。

GAS5不同剪接變異體可能在癌癥中發(fā)揮獨(dú)特的作用,但GAS5的確切機(jī)制以及其剪接變異體的分子功能仍缺乏研究報(bào)道。特別是缺乏反映髓系白血病中GAS5各剪接變異體作用的相關(guān)數(shù)據(jù)。因此,本研究選取一系列髓系白血病細(xì)胞系:早幼粒細(xì)胞白血病(promyeloblast leukaemia)細(xì)胞系NB4 和HL-60;以及骨髓母細(xì)胞白血病(myeloblastic leukaemia)Kasumi 1;成紅細(xì)胞白血病(erythromyeloblastoid leukaemia)細(xì)胞系K562。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR,檢測(cè)生長(zhǎng)停滯期和指數(shù)增長(zhǎng)期中部分GAS5剪接變異體的表達(dá)模式,從而(1)明確GAS5在各髓系白血病細(xì)胞系中是否表達(dá),以及表達(dá)水平,從而判斷代表不同亞型疾病的細(xì)胞系之間,GAS5可變剪接的模式是否不同。(2)檢測(cè)在細(xì)胞密度誘導(dǎo)的生長(zhǎng)停滯時(shí)GAS5的可變剪接水平是否發(fā)生變化。(3)通過(guò)過(guò)表達(dá)GAS5不同剪接變異體,檢測(cè)各剪接變異體是否影響各髓系白血病細(xì)胞系的生長(zhǎng)停滯、細(xì)胞活性和凋亡水平。(4)由于CML細(xì)胞系K562具有p210Bcr-Abl酪氨酸激酶[28],因而用酪氨酸激酶抑制劑IM處理細(xì)胞,明確GAS5的可變剪接水平是否可以在IM誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡、抑制增殖[1]的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步增強(qiáng)K562細(xì)胞對(duì)IM的敏感性。

1 材料與方法

1.1 材料

培養(yǎng)基、添加劑、分子生物學(xué)試劑購(gòu)自Invitrogen(Invitrogen/Life Technologies,Paisley,UK)和Sigma-Aldrich(Gillingham,UK)公司。胎牛血清(FCS)購(gòu)自Biosera公司。用于核轉(zhuǎn)染的Nucleofector solution V 和Nucleofector? I Device 購(gòu)自龍沙(Lonza,Verviers,Belgium)集團(tuán)公司。用于PCR的試劑中,除了隨機(jī)六聚體引物購(gòu)自Invitrogen,其余購(gòu)自Bioline(London,UK)試劑公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

本研究用到的細(xì)胞系包括:急性髓系白血病細(xì)胞系Kasumi-1,急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系NB4和HL-60,CML細(xì)胞系K562。

完全培養(yǎng)基包含:RPMI-1640(pH7.4,含2 mmol/L的L-谷氨酰胺)、FBS(10%,V/V)、丙酮酸鈉(1 mmol/L)、HEPES緩沖劑(10 mmol/L)和慶大霉素溶液(250 μg/mL)。細(xì)胞培養(yǎng)箱設(shè)置的培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。每2～3 d將細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基以每毫升(2～3)×105個(gè)細(xì)胞稀釋重懸。在各種處理之前,細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3 質(zhì)粒提取分離

按照QIAGEN? Maxi Preps(QIAGEN,Germantown,MD,USA)說(shuō)明書,進(jìn)行無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取。使用NEBcutter V2.0在線軟件分析限制位點(diǎn)的序列。

1.4 白血病細(xì)胞的核轉(zhuǎn)染

將空載質(zhì)粒pcDNA3.1或載有不同GAS5剪接變異體序列的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到由單個(gè)集落擴(kuò)增而來(lái)的K562克隆細(xì)胞中。依據(jù)Lonza說(shuō)明書對(duì)核轉(zhuǎn)染過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化。核轉(zhuǎn)染前24 h,種6×105cells/mL的HL-60和4×105cells/mL的K562。核轉(zhuǎn)染時(shí),以1 500 r/min,6 min,室溫收集細(xì)胞,用核轉(zhuǎn)染液V(nucleofector solution V) 將細(xì)胞重懸至2×107cells/mL。取100 μL的細(xì)胞懸浮液與過(guò)表達(dá)質(zhì)?；靹?轉(zhuǎn)移到核轉(zhuǎn)染專用的小池(cuvette)中。用Nucleofector? I Device將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒引入細(xì)胞中(K562 程序T-016)。核轉(zhuǎn)染后,每個(gè)小池加入500 μL的預(yù)熱的完全培養(yǎng)基(Iscove’s 培養(yǎng)基加2 mmol/L的谷氨酰胺和 20%的胎牛血清),懸浮細(xì)胞,轉(zhuǎn)移到6孔板(每孔加2.5 mL預(yù)熱的Iscove’s培養(yǎng)基)。在37℃/5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),每24 h,取少量細(xì)胞用顯微鏡直接計(jì)數(shù),評(píng)估其細(xì)胞活性。pcDNA3.1-GFP質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照,并通過(guò)熒光顯微鏡評(píng)估轉(zhuǎn)染效率(即有熒光染色的成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比,每個(gè)樣品至少評(píng)估200個(gè)細(xì)胞)。通常,轉(zhuǎn)染的細(xì)胞需培養(yǎng)24 h,再做其他處理。

1.5 軟瓊脂細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞置于軟瓊脂中,在90 mm組織培養(yǎng)皿中形成單獨(dú)的菌落。底層的培養(yǎng)基包括80%的Iscove完全培養(yǎng)基(含有20%的胎牛血清,250 μg/mL慶大霉素和2 mmol/L L-谷氨酰胺)和20%的高質(zhì)量瓊脂(5%W/V)。細(xì)胞層包含80%的完全培養(yǎng)基、10%的相應(yīng)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(收集培養(yǎng)活躍生長(zhǎng)的細(xì)胞的培養(yǎng)基)、10%的高質(zhì)量瓊脂和每皿2.4×104個(gè)細(xì)胞。經(jīng)24 h孵育,加入覆蓋上層(具有10%細(xì)胞條件培養(yǎng)基的Iscove完全培養(yǎng)基),7 d 后再加5 mL培養(yǎng)基,避免細(xì)胞層干燥和暴露。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)2～3周,待集落形成。

(1)對(duì)于單個(gè)集落進(jìn)行擴(kuò)增:挑取單個(gè)集落,重懸到100 μL的Iscove完全培養(yǎng)基中,96孔板中培養(yǎng)。隨細(xì)胞擴(kuò)增,將細(xì)胞漸次移入24孔板、12孔板、6孔板,之后常規(guī)培養(yǎng)。通過(guò)紫外線和IM處理后,選取對(duì)凋亡誘導(dǎo)敏感的集落。

(2)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選:對(duì)單個(gè)集落擴(kuò)增出的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置于軟瓊脂中,細(xì)胞層種的細(xì)胞數(shù)從12 000～48 000/每盤,以便獲得分離良好的集落。上層加入G418(0.8 μg/mL)以便對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行篩選。在培養(yǎng)3～4周,挑取單集落、擴(kuò)增。

擴(kuò)增過(guò)程中,均使用加有G418的Iscove培養(yǎng)基中(濃度如上)。擴(kuò)增到6孔板時(shí),使用加有G418的1640完全培養(yǎng)基(濃度如上)。

1.6 誘導(dǎo)凋亡

1.6.1 IM處理 使用0.3 μmol/L 甲磺酸伊馬替尼(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI,USA)誘導(dǎo)凋亡。IM儲(chǔ)備液濃度20 mmol/L(DMSO配制),使用0.03 ‰ (V/V) DMSO處理溶劑對(duì)照組細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)起始,重懸細(xì)胞3×105個(gè)/mL后3～5 h再加相應(yīng)濃度的IM或DMSO。

1.6.2 紫外線處理 HL-60細(xì)胞以6×105/mL重懸,轉(zhuǎn)移到直徑35 mm的塑料培養(yǎng)皿中,移去蓋子將細(xì)胞暴露在254 nm、10.45 J/m2的UV下(劑量約誘導(dǎo)50%的細(xì)胞凋亡)。對(duì)照組無(wú)照射UV的步驟,其余給予相同的處理。UV照射后立即將細(xì)胞離心(6 000 r/min,6 min)并用新鮮培養(yǎng)基重懸至3×105/mL。然后在測(cè)定前培養(yǎng)72 h。

1.7 細(xì)胞生長(zhǎng)和活力測(cè)定

臺(tái)盼藍(lán)染色排除法:臺(tái)盼藍(lán)染料液(0.8 mmol/L溶于PBS)與細(xì)胞懸浮液1∶1混勻,將混合液滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板,非活性細(xì)胞呈淡藍(lán)色或深藍(lán)色,活細(xì)胞未著色。

初始種3×105/mL細(xì)胞,每24 h進(jìn)行1次細(xì)胞計(jì)數(shù),48 h后補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基。之后不再補(bǔ)充培養(yǎng)基,待其進(jìn)入生長(zhǎng)停滯期。

1.8 細(xì)胞凋亡的測(cè)定

作為細(xì)胞凋亡的特征,通過(guò)吖啶橙染色法進(jìn)行常規(guī)評(píng)估,使用吖啶橙(25 μg/mL)對(duì)樣品進(jìn)行染色,通過(guò)熒光顯微鏡對(duì)樣品的凋亡特征變化(主要是染色質(zhì)固縮/片段化)進(jìn)行評(píng)估。每個(gè)樣品至少評(píng)估200個(gè)細(xì)胞。

1.9 RT-PCR檢測(cè)

按照Trizol 試劑(Invitrogen/ThermoFisher Scientific,Rockford,IL,USA)說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA。使用RQ1 RNase-Free DNase Kit (Promega)對(duì)樣品中的DNA進(jìn)行消化,去除殘留的基因組DNA。取2 μg DNase處理過(guò)的樣本,加入隨機(jī)六聚體引物(0.05 μg/μL,Invitrogen)和RNase-free dNTPs(0.5 mmol/L),65℃溫浴10 min,使得引物與模板相結(jié)合,之后加入反轉(zhuǎn)錄緩沖液、Ribosafe核糖核酸酶抑制劑 (Bioline Ltd.)、Tetro 逆轉(zhuǎn)錄酶(Bioline Ltd.)室溫放置10 min,42℃孵育30 min,合成cDNAs。之后在95℃ 下加熱5 min,終止反應(yīng)。反應(yīng)終體積是30 μL。假設(shè)反轉(zhuǎn)錄效率為100%,以2 μg每30 μL起始,最終cDNA的濃度是67 ng/μL。

按照ImmoMix (Bioline)說(shuō)明書進(jìn)行RT-PCR,加入一定量的cDNA和特異性引物,擴(kuò)增相應(yīng)片段。擴(kuò)增18S rRNA時(shí),每個(gè)反應(yīng)體系cDNA樣本稀釋10倍(約取5 ng);擴(kuò)增GAS5各剪接變異體時(shí),cDNA樣本不稀釋(每個(gè)反應(yīng)體系約取67 ng樣本)。三步法,30或34個(gè)循環(huán):95℃(30 s)、62℃(30 s)和72℃(60 s),最終5 min終延伸。PCR引物見Table1。

配制瓊脂糖凝膠:瓊脂糖溶解到1×TAE(Tris-acetate-EDTA)使其終濃度達(dá)到1.25%W/V,再加入溴化乙錠(0.5 μg/mL)。每個(gè)PCR產(chǎn)物取5 μL與2 μL上樣緩沖液混合,上樣后進(jìn)行電泳。分子量標(biāo)準(zhǔn)選用Hyperladder I和IV(Bioline)。用imageJ進(jìn)行密度分析。根據(jù)結(jié)果,對(duì)PCR的樣本量進(jìn)行調(diào)整,使樣本之間的18S rRNA水平相當(dāng),減少樣本間的差異。以調(diào)整后的樣本量進(jìn)行PCR,跑膠并記錄。

1.10 實(shí)時(shí)定量PCR

按照2×Sensimix和TaqManTM基因表達(dá)Assay(Bioline) 說(shuō)明書,使用ABI PRISMTM7000 序列檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)GAS5各剪接變異體的RNA水平。GAS5正向引物:CCTGGACCAGCTTAATGGTT;反向引物:GTCTGCCTGCATTTCTTCAA。以18S rRNA作為內(nèi)參。18S rRNA的正向引物:GATGGTAGTCGCCG TGCC,反向引物:GCCTGCTGCCTTCCTTGG。結(jié)果按照 2-ΔΔCt公式計(jì)算。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)都重復(fù)3次。所有結(jié)果均以平均值±SEM(平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤)表示。數(shù)據(jù)比較分析時(shí),如果方差齊,使用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢查多組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性;如果方差不齊,則進(jìn)行Games Howell測(cè)試。

2 結(jié)果

2.1 髓系白血病細(xì)胞系之間生長(zhǎng)阻滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5剪接模式無(wú)明顯差異

不同方法推測(cè)出眾多GAS5剪接變異體(Fig.1)。本文主要參考Mourtada-Maarabouni等(2008)EST分析所得的GAS5剪接變異體[26](Fig.1A)和NCBI列出50種只包含外顯子的剪接變異體(Fig.1B示意其中通過(guò)BestRefSeq方法推測(cè)的15種)。Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)推測(cè)有31種非冗余剪接變異體(http://nov2020.archive.ensembl.org/,Fig. 1C),其中也包括保留有內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄本。其中剪接變異體GAS5_3A(Fig.2C,Fig.3C)、GAS5_1B(Fig.2D,Fig.3B)和GAS5_O1(Fig.2E)可以通過(guò)RT-PCR識(shí)別,并且三者在4種髓系白血病細(xì)胞系中均有出現(xiàn),在生長(zhǎng)停滯期和指數(shù)增長(zhǎng)期都有表達(dá),GAS5剪接模式未見明顯差異(Fig.2)。18S rRNA作為內(nèi)參(Fig.2A)。條帶①的大小與外顯子2到外顯子12完全由GAS5外顯子組合的GAS5_AE和_O1預(yù)期擴(kuò)增子的大小較為相符?？梢?種髓系白血病細(xì)胞系,特別是在K562細(xì)胞中存在GAS5_AE和/或_O1累積(Fig.2B,3D)。但GAS5_O1的水平在K562和HL-60細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)停滯期后有下降的趨勢(shì)(Fig.2E,Fig.3A),所以條帶①所反映的是K562細(xì)胞中存在GAS5_AE的累積(Fig.2B,Fig.3D)。NB4和KASUMI1細(xì)胞系中GAS5_O1的水平在生長(zhǎng)停滯期略有增加(Fig.2E,Fig.3A)。

Fig.1 The structure of the human GAS5 gene and its transcript variants

Fig.2 GAS5 expression patterns in myeloid leukaemia cell lines by RT-PCR

Fig.3 Quantitative analysis of the levels of GAS5 splice variants

Fig.4 Imatinib-induced effects on apoptosis and cell survival on cloned apoptotic sensitive K562 cells

有較多剪接變異體擴(kuò)增子大小與條帶③相符,從中無(wú)法檢測(cè)出生長(zhǎng)停滯期GAS5的累積(Fig.2C,Fig.3E)。GAS5_2B和GAS5_4A有相似的序列,因此條帶④的出現(xiàn)意味著二者至少其中之一出現(xiàn)在4種細(xì)胞系的兩個(gè)時(shí)期(Fig.2D)。

觀察擴(kuò)增子的大小,條帶②(Fig.2C)和條帶⑤(Fig.2D)與本研究參考的剪接變異體無(wú)對(duì)應(yīng)關(guān)系,可知GAS5存在其他剪接變異體。GAS5_3A水平隨HL-60細(xì)胞密度增加呈下降趨勢(shì)。在其他細(xì)胞系中,GAS5_3A水平與細(xì)胞密度無(wú)關(guān)(Fig.2C)。當(dāng)培養(yǎng)密度達(dá)到飽和時(shí),GAS5_1B的表達(dá)水平在3個(gè)細(xì)胞系中有增加趨勢(shì),但在K562細(xì)胞系中保持不變(Fig.2D)。

2.2 生長(zhǎng)阻滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5剪接變異體在K562單克隆株中的功能評(píng)估

使用不同濃度的IM,即0.1 μmol/L、0.3 μmol/L或1.0 μmol/L處理K562細(xì)胞。在48 h時(shí)0.3 μmol/L的IM可以使細(xì)胞活性下降50%以上,且可以誘導(dǎo)55%左右的細(xì)胞凋亡(Fig. 4),因此,選取此濃度的IM抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡。

(1)短期高表達(dá)GAS5各剪接變異體未影響細(xì)胞對(duì)IM的敏感性

核轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞的效率是42.2%。核轉(zhuǎn)染各GAS5剪接變異體對(duì)K562細(xì)胞的基礎(chǔ)凋亡水平(Fig.5A)和細(xì)胞活性(Fig.5E)無(wú)明顯影響。上調(diào)GAS5_1B、GAS5_2B、GAS5_3A或GAS5_4A表達(dá)水平不能影響K562的基礎(chǔ)增殖水平,而上調(diào)GAS5_O1或GAS5_AE表達(dá)水平有促進(jìn)K562基礎(chǔ)增殖水平的趨勢(shì)(Fig.5C)。高表達(dá)GAS5各剪接變異體對(duì)克隆形成能力有一定促進(jìn)作用,例如GAS5_4A和GAS5_O1(Fig.5G)。

Fig.5 Imatinib-induced effects on apoptosis and cell survival in cloned K562 cells transfected with different GAS5 constructs

細(xì)胞被轉(zhuǎn)染24 h,以0.3 μmol/L的IM處理細(xì)胞(對(duì)照組加DMSO),IM促進(jìn)細(xì)胞凋亡(Fig.5B)、抑制細(xì)胞增殖(Fig.5D)、降低細(xì)胞活性(Fig.5F)、抑制細(xì)胞克隆形成(Fig.5H),但GAS5各個(gè)轉(zhuǎn)錄變異體對(duì)IM的作用無(wú)進(jìn)一步的促進(jìn)或抑制(Fig.5)。

(2)K562穩(wěn)轉(zhuǎn)株中GAS5_O1表達(dá)水平和倍增時(shí)間成正比

構(gòu)建GAS5_O1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株(即O1-C1至O1-C6、O1-C8),通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)7個(gè)穩(wěn)轉(zhuǎn)株中GAS5的表達(dá)水平(Fig.6A)。與對(duì)照相比,GAS5_O1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株在基礎(chǔ)細(xì)胞活性(Fig.6B-C)和倍增時(shí)間(Fig.5E-F)方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異。但倍增時(shí)間和GAS5的表達(dá)水平之間存在一定相關(guān)性(R2= 0.5692),即GAS5_O1表達(dá)水平高,細(xì)胞所需的倍增時(shí)間長(zhǎng)(Fig.6D)。

Fig.6 Growth characteristics of K562 clones stably expressing GAS5_O1

(3)K562穩(wěn)轉(zhuǎn)株中GAS5_O1使細(xì)胞對(duì)IM敏感

從7個(gè)穩(wěn)轉(zhuǎn)株中挑選O1-C4、O1-C5和O1-C8等3株,以進(jìn)一步評(píng)估GAS5-O1對(duì)IM靶向CML細(xì)胞作用的影響。O1-C8細(xì)胞顯示出GAS5-O1促進(jìn)IM對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制(56.94% ± 2.84%vs.36.07% ± 2.32%,P<0.05,Fig.7A,B),促進(jìn)凋亡(29.33% ± 1.30%vs.52.00% ± 2.52%,P<0.05,Fig.7C),以及對(duì)細(xì)胞活性的抑制(79.06% ± 0.84%vs.65.02% ± 2.20%,Fig.7D)。雖然O1-C4中GAS5表達(dá)水平最高,但并未觀察到類似現(xiàn)象。

Fig.7 Imatinib-induced effects on K562 stable clones

3 討論

GAS5被認(rèn)為是一種腫瘤抑制基因,在骨肉瘤[29]、肝癌[30]、胃腺癌[7]、食管鱗癌[9]、乳腺癌[13-14]、卵巢癌[11,31]、子宮內(nèi)膜癌[12]的癌組織內(nèi)GAS5表達(dá)水平低于正常組織/癌旁。治療后GAS5水平下降不利于惡性胸膜間皮瘤患者生存[32]。GAS5的表達(dá)水平和腫瘤患者的生存期相關(guān):其高表達(dá)和AML[33]、膀胱癌[34]、喉癌[35]患者的良好DFS(無(wú)病生存期)相關(guān),與乳腺癌[36]、子宮內(nèi)膜癌[37]和卵巢癌[38,12,31]患者良好OS以及DFS相關(guān),在肺癌[39]、低級(jí)別膠質(zhì)瘤[40]、結(jié)直腸癌[41-44]、前列腺癌[45]、食道癌[46]、宮頸癌[47]、肝癌[48-49]、尿路上皮癌[50-51]中的高表達(dá)也可能利于生存。但GAS5并非總是發(fā)揮抑癌作用,在B型兒童急性淋巴細(xì)胞白血病[52]、腎透明細(xì)胞癌[53]和肝癌[54]中,高GAS5表達(dá)水平是生存的不利因素。也有研究提出,大腸癌和癌前病變組中GAS5的表達(dá)水平顯著高于癌旁病變、良性腺瘤和非腫瘤性病變(P<0.05)[55]。因此,GAS5對(duì)腫瘤的作用不能一概而論。

GAS5不同剪接變異體可能在癌癥中發(fā)揮獨(dú)特的作用,但GAS5的確切機(jī)制以及其剪接變異體的分子功能仍缺乏研究報(bào)道。已有研究表明,GAS5的2種剪接變異體GAS5_O1和GAS5_AE促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡[8]。在T細(xì)胞系中,不同GAS5剪接變異體在不同程度上誘導(dǎo)生長(zhǎng)停滯,特別是其中的GAS5_O1在促進(jìn)細(xì)胞凋亡中最為有效[26]。關(guān)于B淋巴細(xì)胞白血病的報(bào)道也指出了相較于正常對(duì)照組,GAS5在患者樣本中高表達(dá),以及GAS5在細(xì)胞系內(nèi)過(guò)表達(dá)抑制增殖,引起生長(zhǎng)停滯在G1期,并促進(jìn)凋亡[56]。在人白血病T細(xì)胞系CEM-C7和外周血淋巴細(xì)胞中,高表達(dá)GAS5-1B、-2B、-3A、-4A和-O1均可顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng),降低克隆形成能力,提高凋亡水平,減緩細(xì)胞周期。GAS5的過(guò)表達(dá)本身就足以誘導(dǎo)白血病細(xì)胞和正常外周血淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯[26]。GAS5_O1過(guò)表達(dá)在急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat、乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 和人胚胎腎細(xì)胞系HEK 293 T細(xì)胞中也有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和促凋亡的作用。乳腺癌上皮細(xì)胞系MCF-10A中過(guò)表達(dá)GAS5-O1、GAS5-2B和GAS5-3A,會(huì)促進(jìn)細(xì)胞在誘導(dǎo)條件(如UV、順鉑等)下的凋亡,而GAS5-1B和GAS5-4A無(wú)此作用[4,9]。本研究中,雖然提高GAS5_AE和GAS5_O1的表達(dá)在短期有增加細(xì)胞增殖的趨勢(shì),但延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間,在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株中觀察到,GAS5_O1表達(dá)水平的提高和K562細(xì)胞倍增時(shí)間的增加呈正相關(guān),體現(xiàn)出一定的抑制腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)的作用。多數(shù)文章認(rèn)為,GAS5引起的生長(zhǎng)停滯和細(xì)胞周期有關(guān),且增高GAS5表達(dá)水平可以使得G1期細(xì)胞增多,S/G2/M期的細(xì)胞減少,反之亦然[57-61]。據(jù)此推測(cè),GAS5_O1引起的生長(zhǎng)停滯和細(xì)胞周期有關(guān),GAS5高表達(dá)可使G1期細(xì)胞增多。此外,本研究觀察到,GAS5_3A水平隨HL-60細(xì)胞密度增加呈下降趨勢(shì),淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系也有類似的表現(xiàn)[26]。GAS5_4A對(duì)K562細(xì)胞的集落形成能力有一定促進(jìn)作用,但GAS5剪接變異體GAS5_1B、GAS5_2B、GAS5_3A、GAS5_4A和GAS5_AE對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡、克隆形成等方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的作用。

Zhang等人[62]關(guān)于GAS5 剪接變異體的研究則是專注于GAS5-007(即Ensembl中的GAS5-227),雄激素受體抑制GAS5-007的表達(dá)。GAS5-007在腫瘤樣本(n=14)中的表達(dá)高于正常組織(n=11)。不同于一般認(rèn)為的GAS5是腫瘤抑制因子,GAS5-007顯現(xiàn)出促瘤的作用。下調(diào)GAS5-007,下調(diào)LNCaP細(xì)胞活性、細(xì)胞增殖被抑制(細(xì)胞周期G1期增長(zhǎng)、S和G2期下降)、凋亡水平增加。而GAS5-001(即GAS5_AE、GAS5_V1(NCBI)或GAS5-221(Ensembl 20220))被廣泛報(bào)道為一種抑瘤的剪接變異體。本文結(jié)果顯示,K562細(xì)胞在生長(zhǎng)停滯期也有一定程度的GAS5_AE累積。但其他內(nèi)源性GAS5剪接變異體在4種髓系白血病細(xì)胞系的生長(zhǎng)停滯期和指數(shù)生長(zhǎng)期中的表達(dá)水平無(wú)明顯差異。

觀察擴(kuò)增子的大小,可知GAS5剪接變異體不只有GAS5_1B、GAS5_2B、GAS5_O1、GAS5_3A、GAS5_4A、GAS5_AE這6種。本文主要參考Mourtada-Maarabouni等人(2008)EST分析所得的GAS5剪接變異體(見Fig.1A[26])和NCBI列出的50種只包含外顯子的剪接變異體(Fig.1B示意其中的15種)。而除此之外,Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)推測(cè)有29種(目前更新到31種http://nov2020.archive.ensembl.org/,Fig. 1C)非冗余剪接變異體,其中包括保留有內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄本[63-64]。Xu等人[65]通過(guò)UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)(The UCSC Genome Browser database,GENCODE V43)92條序列(http://genome.ucsc.edu/)分析出至少25種GAS5剪接變異體,其中GAS5 003長(zhǎng)度最長(zhǎng)(2 554 bp)。參考以上數(shù)據(jù)庫(kù),條帶①除了從外顯子2到外顯子12完全由GAS5外顯子組合的可能性之外,未見外顯子和內(nèi)含子共存的組合與之相符。根據(jù)UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)推測(cè),條帶②(Fig.1C)可能對(duì)應(yīng)到剪接變異體ENST00000688557.1,即外顯子9和10相連,之后鏈接內(nèi)含子10、外顯子11、內(nèi)含子11和外顯子12。條帶⑤可能包括:內(nèi)含子9、外顯子10、11和12(與GAS5-213、ENST00000686918.1、ENST00000685008.1相符),或內(nèi)含子9、外顯子11和12。盡管GAS5基因不編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物,但變體剪接的模式比已有推測(cè)更為復(fù)雜。造成這種復(fù)雜剪接模式的原因尚不清楚。需要對(duì)這些無(wú)對(duì)應(yīng)關(guān)系的條帶開展進(jìn)一步分析,以確定它們的序列。條帶①大小約600 bp,更接近于外顯子7b所能帶來(lái)的長(zhǎng)度。在大多數(shù)細(xì)胞中主要表達(dá)的是含有較長(zhǎng)的外顯子7的GAS5_AE[25-26]。外顯子7b多出于7a的GTAAGGACATG AAGACAGTTCCTGTCATACCTTTTA AAG序列也出現(xiàn)在人MDN1(midasin AAA ATPase 1)基因的內(nèi)含子中,而具體功能還有待進(jìn)一步研究。

此外,本文參考的GAS5剪接變異體都保有外顯子12,多數(shù)推測(cè)的GAS5剪接變異體中也含有外顯子12,其中的莖環(huán)結(jié)構(gòu)可以作為誘餌(稱為GRE-mimic),與糖皮質(zhì)激素響應(yīng)元件(glucocorticoid response element,GRE)競(jìng)爭(zhēng)糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)的DNA結(jié)合位點(diǎn)[4]。GAS5參與調(diào)節(jié)GR的轉(zhuǎn)錄活性,而GR誘導(dǎo)某些響應(yīng)糖皮質(zhì)激素的抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄活性(如細(xì)胞凋亡抑制因子cIAP2、血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶SGK1)[4,66]。GAS5競(jìng)爭(zhēng)性的與GR結(jié)合可以阻礙由GR誘導(dǎo)的 DNA 轉(zhuǎn)錄[67],從而有促進(jìn)凋亡的作用。但多數(shù)GAS5剪切變異體包含外顯子12,然而作用各異,且GAS5總水平和增殖凋亡相關(guān)性低,因而以上研究提出的外顯子12的作用在很多GAS5剪切變異體中并未體現(xiàn)出來(lái)。并且有研究表明,糖皮質(zhì)激素可誘導(dǎo)凋亡[67-68],相關(guān)機(jī)制無(wú)法解釋GAS5的促凋亡作用。

綜上所述,髓系白血病細(xì)胞系在指數(shù)生長(zhǎng)期和生長(zhǎng)停止期存在GAS5_2B和/或GAS5_4A、GAS5_1B、GAS5_3A、GAS5_O1和GAS5_AE的表達(dá)。此外,還可能存在ENST00000688557.1和GAS5-213、ENST00000686918.1和/或ENST00000685008.1的表達(dá)。進(jìn)入細(xì)胞密度生長(zhǎng)停滯期,其中的GAS5_AE表達(dá)存在一定程度的累積。GAS5_O1的表達(dá)水平和K562細(xì)胞倍增時(shí)間成正比。GAS5_O1對(duì)K562細(xì)胞受IM作用敏感性有一定影響,但與GAS5表達(dá)水平不相關(guān)。