徐新穎 朱 琳 劉姿杉 倪欽帥 于竹芹，3*

（1.濟(jì)南市濟(jì)陽區(qū)中醫(yī)院ICU科，山東 濟(jì)南，251400；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部中西醫(yī)結(jié)合中心，山東 青島，266021；3.青島市第六人民醫(yī)院內(nèi)科，山東 青島，266023）

機體發(fā)生衰老時會增加神經(jīng)退行性疾病等多種疾病的發(fā)病風(fēng)險[1]。海馬神經(jīng)元衰老與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[2]。研究表明，端粒酶缺乏的小鼠更容易發(fā)生衰老并伴隨神經(jīng)退行性變，出現(xiàn)海馬神經(jīng)元損傷，而重新提高端粒酶活性可以改善年齡相關(guān)的神經(jīng)元損傷并延緩衰老[3]?！鹅`樞·天年》曰：人之壽，百歲而死。說明人若盡其天年可活到百歲，若能采取有效措施，可以延緩衰老的[4]。《本草綱目》中記載，紅景天（rhodiolarosea）為“本經(jīng)上品，祛邪惡氣，補諸不足”，具有補氣清肺、益智養(yǎng)心、理氣養(yǎng)血等功效[5]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，紅景天可以抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、抗衰老和肝保護(hù)等作用[6-7]?，F(xiàn)代藥理研究表明，紅景天的主要活性成分紅景天苷（salidroside，Sal）對多種神經(jīng)退行性疾病具有神經(jīng)保護(hù)作用[8-9]，但其對神經(jīng)元衰老的影響及作用機制尚不十分明確。本研究通過分離和培養(yǎng)大鼠原代海馬神經(jīng)元，使其自然衰老，旨在探討紅景天苷對海馬神經(jīng)元衰老的作用和作用機制，為臨床應(yīng)用提供新的思路[10]，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

紅景天苷（生產(chǎn)企業(yè)：上海阿拉丁生化科技公司，Sal，S101157，C14H20O7，300.31 Da）；環(huán)黃芪醇（生產(chǎn)企業(yè)：上海麥克林生化科技公司，CAG，C864810，C30H50O5，490.71 Da）；胰蛋白酶（25200056）、胎牛血清（FBS，10099141）、DMEM /F12培養(yǎng)基（11320082）、Neurobasal-A培養(yǎng)基（10888022）（生產(chǎn)企業(yè)：美國Gibco公司）；細(xì)胞計數(shù)試劑盒（生產(chǎn)企業(yè)：北京索萊寶科技公司，CCK-8，CA1210）；衰SA-β-gal染色試劑盒（生產(chǎn)企業(yè)：上海碧云天生物技術(shù)公司，C0602）；兔抗鼠TERT抗體（生產(chǎn)企業(yè)：Novus Biologicals公司，NB100-317）；端粒酶PCR-ELISA試劑盒（生產(chǎn)企業(yè)：德國羅氏公司，1185666910）；熒光顯微鏡（ECLIPSE Ti2）、PCR儀（T100TM）（生產(chǎn)企業(yè)：Bio-Rad公司）；酶標(biāo)儀（生產(chǎn)企業(yè)：Bio-Tek公司，SYNERGYH1）。

1.2 原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)

取新生24 h內(nèi)SD大鼠，用75%酒精浸泡消毒5 min，斷頭取腦，無菌操作，分離海馬，剪碎，加0.125%胰蛋白酶，37 ℃消化15 min。加含血清培養(yǎng)基，機械輕柔吹打數(shù)次終止消化，用200目篩網(wǎng)過濾到離心管，1 000 rpm離心5 min，棄上清。用DMEM/F12培養(yǎng)基將沉淀細(xì)胞懸浮，接種到多聚賴氨酸包被培養(yǎng)板，5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，更換為Neurobasal-A培養(yǎng)基，每隔2天半量換液。光鏡（200倍）觀察神經(jīng)元生長狀態(tài)。隨機選取5個視野，計算平均細(xì)胞數(shù)。實驗過程嚴(yán)格遵守動物倫理學(xué)要求（QDYXBWZLL20230606）。

1.3 原代海馬神經(jīng)元純度鑒定

取培養(yǎng)7 d的原代海馬神經(jīng)元，用4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗5 min×3次。加0.5% Triton X-100室溫透化10 min，PBS洗5 min×3次。用10%正常山羊血清室溫封閉30 min，然后加MAP2抗體（1:150），4 ℃孵育過夜，PBS洗5 min×3次，避光，加Alexa Fluor 488山羊抗兔二抗（1:200）室溫避光孵育1 h，PBS洗5 min×3次，加DAPI染液，室溫避光染色10 min，PBS洗5 min×3次。熒光顯微鏡（200倍）觀察DAPI和MAP2表達(dá)情況，隨機選取5個視野，計數(shù)綠色熒光細(xì)胞數(shù)，根據(jù)熒光細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞總數(shù)的比值計算神經(jīng)元純度。

1.4 原代海馬神經(jīng)元分組

原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天為ST培養(yǎng)（年輕神經(jīng)元），第17天為LT培養(yǎng)（老年神經(jīng)元）。將神經(jīng)元分為ST組、LT組、紅景天苷低濃度（Sal-L）、高濃度（Sal-H）組、環(huán)黃芪醇（CAG）組。神經(jīng)元培養(yǎng)至第14天，分別用紅景天苷（10 μM、20 μM）和CAG（5 μM）處理72 h。第17天收集各組神經(jīng)元。顯微鏡（200倍）觀察神經(jīng)元生長情況。

1.5 細(xì)胞活力測定

原代海馬神經(jīng)元接種于96孔板，至第14天，加紅景天苷（10 μM、20 μM）和CAG（5 μM）繼續(xù)培養(yǎng)至第23天，每隔2天使用CCK-8法檢測細(xì)胞活力。每孔加10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育3 h。酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度。

1.6 SA-β-gal染色

原代海馬神經(jīng)元接種于6孔板，按分組處理后SA-βgal染色。每孔加1 mL染色固定液，室溫固定15 min，PBS洗3 min×3次，隨后每孔加1 mL染色工作液，封口膜封住6孔板以防蒸發(fā)，37℃（無CO2）孵育過夜。光鏡觀察記錄SA-β-gal陽性細(xì)胞（藍(lán)染）數(shù)，計算陽性細(xì)胞率（陽性細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目）。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)

海馬原代神經(jīng)元經(jīng)分組處理，經(jīng)0.25%胰酶（無EDTA）消化，1 000 rpm、4 ℃離心5 min，棄上清，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，1 000 rpm、4 ℃離心5 min，棄上清。將細(xì)胞重懸于100 μL預(yù)冷Annexin V緩沖液，隨后分別加5 μL的 Annexin V-FITC和PI，室溫避光反應(yīng)15 min，加400 μL預(yù)冷Annexin V緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析。

1.8 Western Blot分析

原代海馬神經(jīng)元按分組處理后，用RIPA裂解液裂解，12 000 rpm離心5 min，收集上清，使用BCA法檢測總蛋白濃度?？偟鞍祝?0 ug）經(jīng)SDS-PAGE分離后，凝膠濕轉(zhuǎn)到PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗5 min×3次。加一抗（TERT 1:500，β-actin 1:15 000），4℃孵育過夜，TBST洗5 min×3次。加羊抗兔二抗（1:15 000）室溫孵育1.5 h，TBST洗5 min×3次。隨后ECL化學(xué)發(fā)光顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Image J軟件分析蛋白條帶灰度。目的蛋白與內(nèi)參β-actin灰度比值為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.9 端粒酶活性測定

使用端粒酶PCR-ELISA試劑盒裂解液裂解神經(jīng)元，取部分裂解產(chǎn)物95℃熱滅活作為陰性對照，試劑盒提供的蛋白提取物作為陽性對照。隨后加入含有端粒酶底物的反應(yīng)混合物。將樣品轉(zhuǎn)移PCR儀擴(kuò)增：25 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s 30個循環(huán)，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s。用雜交緩沖液稀釋PCR產(chǎn)物后，加到預(yù)涂有地高辛標(biāo)記（含端粒重復(fù)特異性探針）的96孔板。經(jīng)37 ℃變性雜交2 h，加入抗地高辛過氧化物酶偶聯(lián)物和TMB底物ELISA測定，測定450 nm處的吸光度。根據(jù)陰性對照值，吸光度值大于0.25為端粒酶陽性。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠原代海馬神經(jīng)元長期培養(yǎng)

培養(yǎng)第7天，神經(jīng)元胞體飽滿，細(xì)胞折光性強，神經(jīng)元突起密集，形成突觸連接和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。第11～15天，細(xì)胞胞體飽滿且折光性更強，神經(jīng)元突起發(fā)達(dá)，神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)最為密集，細(xì)胞數(shù)量較第7天無明顯變化（P＞0.05）。第17～19天，細(xì)胞邊界不清，部分細(xì)胞開始退化，光暈減弱，突起斷裂，細(xì)胞數(shù)量較第15天明顯減少（P＜0.01）。第21天，神經(jīng)元退化，胞體萎縮，胞漿內(nèi)出現(xiàn)顆粒變性，神經(jīng)元突起斷裂，細(xì)胞數(shù)量較第19天進(jìn)一步減少（P＜0.01）。海馬神經(jīng)元培養(yǎng)第7天，經(jīng)MAP2免疫熒光鑒定，92%以上為陽性細(xì)胞，見圖1、2。

圖1 原代海馬神經(jīng)元在不同培養(yǎng)時間的形態(tài)和數(shù)目（n=5，200×）

圖2 免疫熒光染色鑒定原代海馬神經(jīng)元純度（n=5，200×）

2.2 紅景天苷對神經(jīng)元存活率的影響

CCK-8結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)至第15天，加紅景天苷和CAG的神經(jīng)元存活率與LT組相比無明顯變化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。至第17天、19天，Sal-L組、Sal-H組和CAG組的神經(jīng)元存活率較LT組顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。至第21天、23天，Sal-L組、Sal-H組和CAG組神經(jīng)元存活率較與LT組顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 紅景天苷對原代海馬神經(jīng)元的形態(tài)和細(xì)胞活性影響（n=5，200×）

2.3 紅景天苷對海馬神經(jīng)元SA-β-gal表達(dá)的影響

SA-β-gal染色結(jié)果顯示，LT組SA-β-gal陽性（藍(lán)染）細(xì)胞率相較ST組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明隨著海馬神經(jīng)元的長時間培養(yǎng)，細(xì)胞逐漸衰老。而與LT組相比，Sal-L組、Sal-H組和CAG組的SA-β-gal陽性細(xì)胞率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 紅 景天苷對自然衰老神經(jīng)元SA-β-gal表達(dá)的影響（n=5，200×）

2.4 紅景天苷對神經(jīng)元凋亡率的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，LT組凋亡細(xì)胞比率較與ST組明顯增加（P＜0.01）。給予紅景天苷和環(huán)黃芪醇處理后，凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，Sal-L、Sal-H和CAG組的凋亡細(xì)胞比率較LT組均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 紅景天苷對自然衰老的海馬神經(jīng)元凋亡的影響（n=3，200×）

2.5 紅景天苷對神經(jīng)元端粒酶活性和TERT表達(dá)的影響

PCR-ELISA法顯示，LT組海馬神經(jīng)元的端粒酶活性較ST組顯著降低（P＜0.0 1）；經(jīng)紅景天苷和環(huán)黃芪醇處理后，神經(jīng)元的端粒酶活性顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Western blot檢測結(jié)果表明，LT組神經(jīng)元TERT表達(dá)較ST組顯著下降（P＜0.01），經(jīng)紅景天苷和環(huán)黃芪醇處理的神經(jīng)元TERT表達(dá)較LT組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖6、表1。

表1 各組海馬神經(jīng)元端粒酶相對活性和TERT表達(dá) （）

表1 各組海馬神經(jīng)元端粒酶相對活性和TERT表達(dá) （）

注：**P＜0.01 vs LT組；# P＜0.01、##P＜0.01 vs ST組。

0.32±0.13 0.14±0.13**0.23±0.15#0.27±0.14##0.24±0.15#組別例數(shù)端粒酶相對活性TERT相對表達(dá)量ST組LT組Sal-L組Sal-H組CAG組5 5 5 5 5 1.19±0.10 0.58±0.18**0.80±0.14#0.99±0.19##0.86±0.15#

圖6 各組小鼠海馬組織中TER的蛋白表達(dá)

3 討論

傳統(tǒng)中藥用藥歷史久遠(yuǎn)，《四部醫(yī)典》中便言其“性平、味澀、善潤肺、能補腎、理氣養(yǎng)血”，《神農(nóng)本草經(jīng)》稱服之可“輕身益氣，不老延年”，具有益氣活血、通脈平喘的功效。近年研究發(fā)現(xiàn)，紅景天具有抗疲勞、抗炎、抗氧化、抗衰老等作用，其主要活性成分紅景天苷可以有效緩解多種神經(jīng)退行性疾病，對神經(jīng)元具有保護(hù)作用，但其作用機制尚不十分明確[11-15]。

本實驗長期培養(yǎng)大鼠原代海馬神經(jīng)元作為自然衰老模型，可以模擬在體海馬神經(jīng)元衰老的一些改變[16]。結(jié)果表明，培養(yǎng)第7～15天，神經(jīng)元胞體飽滿，具有典型的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和突起，神經(jīng)元數(shù)目無明顯改變。隨著海馬神經(jīng)元培養(yǎng)時間的增加，大多數(shù)神經(jīng)元開始退化，細(xì)胞胞體萎縮，神經(jīng)元突起斷裂，神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，可見大量細(xì)胞碎片，與既往研究相一致。Mao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷可以降低人胚肺二倍體細(xì)胞（2BS）的SA-β-gal的表達(dá)，延緩2BS細(xì)胞的復(fù)制性衰老。Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷可以劑量依賴地抑制MPP（+）誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。本實驗研究結(jié)果顯示，與短期培養(yǎng)的年輕神經(jīng)元相比，長期培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活率明顯下降，而SA-β-gal的陽性表達(dá)率明顯增加，并且海馬神經(jīng)元凋亡率增加，說明長期培養(yǎng)的神經(jīng)元衰老比例明顯增多。給予不同濃度的紅景天苷處理后，細(xì)胞存活率顯著提高，SA-β-gal的陽性表達(dá)率和神經(jīng)元凋亡率也明顯下降，提示紅景天苷可以延緩原代海馬神經(jīng)元的自然衰老，與抗衰老藥物環(huán)黃芪醇的作用效果一致[19]。

染色體末端的端粒縮短可以激活DNA損傷反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞周期停滯，加速細(xì)胞衰老和死亡[20]。端粒長度主要由端粒酶維持，端粒酶可以合成并添加端粒重復(fù)序列至染色體末端，以維持染色體末端的端粒長度， 從而防止細(xì)胞衰老。 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）是具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的催化亞基，也是端粒酶起作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和主要調(diào)控亞單位。有研究發(fā)現(xiàn)，TERT基因敲除小鼠的海馬組織中缺乏端粒酶，不僅導(dǎo)致海馬神經(jīng)元退化，組織局部功能喪失，還會產(chǎn)生衰老相關(guān)疾病，而端粒酶再激活可以逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元退化，說明端粒在大腦衰老的過程中具有重要作用[21-22]。本研究證實，長期培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元端粒酶活性明顯低于短期培養(yǎng)的神經(jīng)元，給予紅景天苷處理可以有效減少端粒酶活性的下降，其作用效果與環(huán)黃芪醇的作用效果相似。說明紅景天苷可以有效提高自然衰老的原代海馬神經(jīng)元的端粒酶活性。

綜上所述，紅景天苷可能通過降低衰老海馬神經(jīng)元的SA-β-gal表達(dá)和神經(jīng)元凋亡，提高衰老海馬神經(jīng)元的端粒酶活性，從而延緩海馬神經(jīng)元自然衰老，提高原代海馬神經(jīng)元存活率。